Name: ניתוח של חלבונים קושרי שווי בתאים אנושיים חשופים לתנאי חמצן פיזיולוגיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: למדו ללכוד חלבונים קושרי כובע mRNA בתנאי חמצן נמוך באמצעות אנלוג m7GTP מקושר לאגרוז. שיטה זו מאפשרת זיהוי גורמים מוסדרי חמצן בתרגום תלוי-כובע בתאים אנושיים ותורמת להבנת בקרה תרגומית בסרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המועצה למדעי הטבע וההנדסה של קנדה ומשרד המחקר והחדשנות של אונטריו.

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+translation+initiation+in+eukaryotes%3A+mechanisms+and+biological+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets.</a> Cell. 136 (4), 731-745 (2009).</li>
<li>Gingras, A. C., Raught, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((eIF4+initiation+factors%3A+effectors+of+mRNA+recruitment+to+ribosomes+and+regulators+of+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">eIF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation.</a> Annu Rev Biochem. 68, 913-963 (1999).</li>
<li>Weingarten-Gabbay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genetics.+Systematic+discovery+of+cap-independent+translation+sequences+in+human+and+viral+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comparative genetics. Systematic discovery of cap-independent translation sequences in human and viral genomes.</a> Science. 351 (6270), (2016).</li>
<li>Andreev, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+and+glucose+deprivation+induces+widespread+alterations+in+mRNA+translation+within+20+minutes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes.</a> Genome Biol. 16, 90(2015).</li>
<li>Ho, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+Reprogramming+of+Translation+Efficiencies+on+Oxygen+Stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Systemic Reprogramming of Translation Efficiencies on Oxygen Stimulus.</a> Cell Rep. 14 (6), 1293-1300 (2016).</li>
<li>Shatsky, I. N., Dmitriev, S. E., Andreev, D. E., Terenin, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+studies+uncover+the+diversity+of+modes+of+mRNA+recruitment+to+eukaryotic+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide studies uncover the diversity of modes of mRNA recruitment to eukaryotic ribosomes.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 49 (2), 164-177 (2014).</li>
<li>Ho, J. J., Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cap+for+Every+Occasion%3A+Alternative+eIF4F+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">A Cap for Every Occasion: Alternative eIF4F Complexes.</a> Trends Biochem Sci. , (2016).</li>
<li>Lin, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHAS-I+as+a+link+between+mitogen-activated+protein+kinase+and+translation+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">PHAS-I as a link between mitogen-activated protein kinase and translation initiation.</a> Science. 266 (5185), 653-656 (1994).</li>
<li>Richter, J. D., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cap-dependent+translation+by+eIF4E+inhibitory+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of cap-dependent translation by eIF4E inhibitory proteins.</a> Nature. 433 (7025), 477-480 (2005).</li>
<li>Tee, A. R., Tee, J. A., Blenis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+interaction+of+the+mammalian+eIF4E-related+protein+4EHP+with+4E-BP1%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Characterizing the interaction of the mammalian eIF4E-related protein 4EHP with 4E-BP1.</a> FEBS Lett. 564 (1-2), 58-62 (2004).</li>
<li>Rom, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+4EHP%2C+a+novel+mammalian+eIF4E-related+cap-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of 4EHP, a novel mammalian eIF4E-related cap-binding protein.</a> J Biol Chem. 273 (21), 13104-13109 (1998).</li>
<li>Uniacke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxygen-regulated+switch+in+the+protein+synthesis+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery.</a> Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).</li>
<li>Morita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+4EHP-GIGYF2+translational+repressor+complex+is+essential+for+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel 4EHP-GIGYF2 translational repressor complex is essential for mammalian development.</a> Mol Cell Biol. 32 (17), 3585-3593 (2012).</li>
<li>Webb, N. R., Chari, R. V., DePillis, G., Kozarich, J. W., Rhoads, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+the+messenger+RNA+cap-binding+protein+using+a+new+affinity+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Purification of the messenger RNA cap-binding protein using a new affinity medium.</a> Biochemistry. 23 (2), 177-181 (1984).</li>
<li>Kiriakidou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+mRNA+m7G+cap+binding-like+motif+within+human+Ago2+represses+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An mRNA m7G cap binding-like motif within human Ago2 represses translation.</a> Cell. 129 (6), 1141-1151 (2007).</li>
<li>Mazza, C., Segref, A., Mattaj, I. W., Cusack, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+induced+fit+recognition+of+an+m%287%29GpppG+cap+analogue+by+the+human+nuclear+cap-binding+complex%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Large-scale induced fit recognition of an m(7)GpppG cap analogue by the human nuclear cap-binding complex.</a> EMBO J. 21 (20), 5548-5557 (2002).</li>
<li>Nojima, T., Hirose, T., Kimura, H., Hagiwara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+between+cap-binding+complex+and+RNA+export+factor+is+required+for+intronless+mRNA+export%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The interaction between cap-binding complex and RNA export factor is required for intronless mRNA export.</a> J Biol Chem. 282 (21), 15645-15651 (2007).</li>
<li>Pabis, M., Neufeld, N., Shav-Tal, Y., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+properties+and+dynamic+localization+of+an+alternative+isoform+of+the+cap-binding+complex+subunit+CBP20%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Binding properties and dynamic localization of an alternative isoform of the cap-binding complex subunit CBP20.</a> Nucleus. 1 (5), 412-421 (2010).</li>
<li>Ruud, K. A., Kuhlow, C., Goss, D. J., Browning, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+novel+cap-binding+protein+from+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a novel cap-binding protein from Arabidopsis thaliana.</a> J Biol Chem. 273 (17), 10325-10330 (1998).</li>
<li>Ptushkina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+second+eIF4E+protein+in+Schizosaccharomyces+pombe+has+distinct+eIF4G-binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A second eIF4E protein in Schizosaccharomyces pombe has distinct eIF4G-binding properties.</a> Nucleic Acids Res. 29 (22), 4561-4569 (2001).</li>
<li>Cho, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+paradigm+for+translational+control%3A+inhibition+via+5%27-3%27+mRNA+tethering+by+Bicoid+and+the+eIF4E+cognate+4EHP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A new paradigm for translational control: inhibition via 5'-3' mRNA tethering by Bicoid and the eIF4E cognate 4EHP.</a> Cell. 121 (3), 411-423 (2005).</li>
<li>Dinkova, T. D., Keiper, B. D., Korneeva, N. L., Aamodt, E. J., Rhoads, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+of+a+small+subset+of+Caenorhabditis+elegans+mRNAs+is+dependent+on+a+specific+eukaryotic+translation+initiation+factor+4E+isoform%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translation of a small subset of Caenorhabditis elegans mRNAs is dependent on a specific eukaryotic translation initiation factor 4E isoform.</a> Mol Cell Biol. 25 (1), 100-113 (2005).</li>
<li>Timpano, S., Uniacke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Cells+Cultured+Under+Physiological+Oxygen+Utilize+Two+Cap-binding+Proteins+to+Recruit+Distinct+mRNAs+for+Translation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human Cells Cultured Under Physiological Oxygen Utilize Two Cap-binding Proteins to Recruit Distinct mRNAs for Translation.</a> J Biol Chem. , (2016).</li>
<li>Dings, J., Meixensberger, J., Jager, A., Roosen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+experience+with+118+brain+tissue+oxygen+partial+pressure+catheter+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Clinical experience with 118 brain tissue oxygen partial pressure catheter probes.</a> Neurosurgery. 43 (5), 1082-1095 (1998).</li>
<li>Le, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+tumor+oxygenation+and+gene+expression+in+patients+with+early+stage+non-small+cell+lung+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers.</a> Clin Cancer Res. 12 (5), 1507-1514 (2006).</li>
<li>Muller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+desflurane+and+isoflurane+on+intestinal+tissue+oxygen+pressure+during+colorectal+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Anaesthesia%22%5BJournal%5D)">Effects of desflurane and isoflurane on intestinal tissue oxygen pressure during colorectal surgery.</a> Anaesthesia. 57 (2), 110-115 (2002).</li>
<li>Brooks, A. J., Eastwood, J., Beckingham, I. J., Girling, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+tissue+partial+pressure+of+oxygen+and+carbon+dioxide+during+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Anaesth%22%5BJournal%5D)">Liver tissue partial pressure of oxygen and carbon dioxide during partial hepatectomy.</a> Br J Anaesth. 92 (5), 735-737 (2004).</li>
<li>Muller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renocortical+tissue+oxygen+pressure+measurements+in+patients+undergoing+living+donor+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">Renocortical tissue oxygen pressure measurements in patients undergoing living donor kidney transplantation.</a> Anesth Analg. 87 (2), 474-476 (1998).</li>
<li>Richardson, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+intracellular+oxygenation%3A+the+impact+of+ambient+oxygen+availability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle intracellular oxygenation: the impact of ambient oxygen availability.</a> J Physiol. 571 (Pt 2), 415-424 (2006).</li>
<li>Harrison, J. S., Rameshwar, P., Chang, V., Bandari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+saturation+in+the+bone+marrow+of+healthy+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Oxygen saturation in the bone marrow of healthy volunteers.</a> Blood. 99 (1), 394(2002).</li>
<li>Gleadle, J., Ratcliffe, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGleadle%2C+J+%22Hypoxia%22">Hypoxia</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. (2001).</li>
<li>Gluckman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+reconstitution+in+a+patient+with+Fanconi%27s+anemia+by+means+of+umbilical-cord+blood+from+an+HLA-identical+sibling%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling.</a> N Engl J Med. 321 (17), 1174-1178 (1989).</li>
<li>Parrinello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+sensitivity+severely+limits+the+replicative+lifespan+of+murine+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts.</a> Nat Cell Biol. 5 (8), 741-747 (2003).</li>
<li>Jewell, U. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+HIF-1alpha+in+response+to+hypoxia+is+instantaneous%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Induction of HIF-1alpha in response to hypoxia is instantaneous.</a> FASEB J. 15 (7), 1312-1314 (2001).</li>
<li>Newby, D., Marks, L., Lyall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissolved+oxygen+concentration+in+culture+medium%3A+assumptions+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Dissolved oxygen concentration in culture medium: assumptions and pitfalls.</a> Placenta. 26 (4), 353-357 (2005).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Haghighat, A., Mader, S., Pause, A., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+cap-dependent+translation+by+4E-binding+protein+1%3A+competition+with+p220+for+binding+to+eukaryotic+initiation+factor-4E%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Repression of cap-dependent translation by 4E-binding protein 1: competition with p220 for binding to eukaryotic initiation factor-4E.</a> EMBO J. 14 (22), 5701-5709 (1995).</li>
<li>Pyronnet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+eukaryotic+translation+initiation+factor+4G+%28eIF4G%29+recruits+mnk1+to+phosphorylate+eIF4E%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Human eukaryotic translation initiation factor 4G (eIF4G) recruits mnk1 to phosphorylate eIF4E.</a> EMBO J. 18 (1), 270-279 (1999).</li>
<li>Okumura, F., Zou, W., Zhang, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISG15+modification+of+the+eIF4E+cognate+4EHP+enhances+cap+structure-binding+activity+of+4EHP%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">ISG15 modification of the eIF4E cognate 4EHP enhances cap structure-binding activity of 4EHP.</a> Genes Dev. 21 (3), 255-260 (2007).</li>
<li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+ternary+complex+%28eIF2-GTP-tRNA%28i%29%28Met%29%29-deficient+preinitiation+complexes+are+core+constituents+of+mammalian+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).</li>
<li>Gu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+structure%2C+mechanism%2C+and+regulation+of+scavenger+mRNA+decapping+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into the structure, mechanism, and regulation of scavenger mRNA decapping activity.</a> Mol Cell. 14 (1), 67-80 (2004).</li>
<li>Szczepaniak, S. A., Zuberek, J., Darzynkiewicz, E., Kufel, J., Jemielity, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+resins+containing+enzymatically+resistant+mRNA+cap+analogs--a+new+tool+for+the+analysis+of+cap-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Affinity resins containing enzymatically resistant mRNA cap analogs--a new tool for the analysis of cap-binding proteins.</a> RNA. 18 (7), 1421-1432 (2012).</li>
<li>Joshi, B., Cameron, A., Jagus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mammalian+eIF4E-family+members%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Characterization of mammalian eIF4E-family members.</a> Eur J Biochem. 271 (11), 2189-2203 (2004).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

הניתוח של חלבוני קושרי כובע בתאים אנושיים חשופים לתנאי חמצן פיסיולוגיים יכול לאפשר זיהוי של גורמי ייזום תרגום רומן מוסדר חמצן. הזיקה של הגורמים הללו עבור המכסה &#39;5 של mRNA או חלבונים הקשורים כובע אחרים ניתן למדוד את עוצמת הקשר שלהם אל מ 7 GTP צמודים חרוזי Agarose. אזהרה אחת של טכניקה זו היא כי הוא מודד את הפוטנציאל מחייב כובע של חלבונים-ימסו פוסט, אבל זה מבוצע בתנאים שאינם denaturing המקיימים אינטראקציות חלבון-חלבון ופוסט translational שינויים (PTMs). אינטראקציות חלב...

שליטה Translational מתגלה צעד חשוב לא פחות לרגולציה תעתיק בביטוי הגנים, במיוחד בתקופות של מתח הסלולר 1. מוקד שליטת תרגום הוא צעד שער הגבלת חניכה שבו הצעדים הראשונים של סינתזת חלבון לערב הכריכה של 4E גורם ייזום איקריוטיים (eIF4E) אל 7-methylguanosine (מ 7 GTP) 5 &#39;כובע של mRNAs 2 . eIF4E הוא חלק ממכלול trimeric בשם eIF4F הכולל eIF4A, גידול helicase RNA, eIF4G, חלבון פיגומים הנדרש לגיוס של גורמי תרגום אחרים ואת 40S הריבוזום 3. בתנאים פיסיולוגיים נורמלים, רוב mRNAs המכריע מתורגם באמצעות מנגנון כובע תלוי, אבל תחת תקופות של מתח הסלולר כ 10% של mRNAs האנושי מכילים 5 &#39;UTRs עלולה לאפשר תרגום עצמאי-כובע טכס חניכת 1,4. תרגום שווה תלויה כבר היסטורי נרדףמפוקפק עם eIF4F, לעומת זאת, וריאציות ספציפי לחץ של eIF4F הפכו נושאי טרנדים 5-8. מדגיש תאיים שונה לגרום לפעילות eIF4E צורך להדחיק באמצעות היעד היונק של rapamycin מורכבי 1 (mTORC1). קינאז זה הופך לקוי תחת לחץ, וכתוצאה מכך את הפעילות המוגברת של אחד היעדים שלה, 4E-חלבון מחייב (4E-BP). ללא פוספורילציה 4E-BP נקשר eIF4E וחוסם את יכולתה לקיים אינטראקציה עם eIF4G גורם לדיכוי של תרגום תלוי כובע 9,10. נקודה מעניינת היא homolog של eIF4E בשם eIF4E2 (או 4EHP) יש זיקה הרבה יותר נמוך עבור 4E-BP 11, אולי שמאפשר לו לחמוק הדחקה בתיווך מתח. ואכן, בתחילה לאפיין מדכא של התרגום בשל היעדר האינטראקציה עם eIF4G 12, eIF4E2 יוזם את התרגום של מאות mRNAs המכילים אלמנטים בתגובה היפוקסיה רנ&quot;א 3 שלהם &#39;UTR במהלך מתח היפוקסי 6,13. אני הפעלה זושעות מושגת באמצעות אינטראקציות עם eIF4G3, RNA חלבון מחייב מוטיב 4, והגורם היפוקסיה מושרה (HIF) 2α להוות מורכבים eIF4F חוסר חמצן, או eIF4F H 6,13. כתוצאה מדכאת בתנאים רגילים, eIF4E2 נקשר עם GIGYF2 ו ZNF598 14. מתחמים אלה היו, בין שאר, שזוהו באמצעות שרפי זיקת GTP מ 7 Agarose צמודים. השיטה הקלאסית זה 15 הוא תקן בתחום התרגום והוא הטוב ביותר הנפוץ טכניקה לבודד מתחמי מחייב כובע לנתץ ו במבחנה מחייב מבחני 16-19. כמו מכונות תרגום תלוי כובע מתגלה גמישות להתאמה עם חלקים בין-שינוי 6-8,13, שיטה זו היא כלי רב עצמה כדי לזהות חלבוני כובע מחייב רומן במהירות מעורב תגובת הלחץ. יתר על כן, וריאציות eIF4F עשויות להיות השלכות רחבות כמערכות מודל מספר איקריוטיים להופיע להשתמש homolog eIF4E2 לתגובות מתח כזהכמו א thaliana 20, ס Pombe 21, ד melanogaster 22, ו- C. elegans 23. הראיות עולה כי שינויים eIF4F לא יכול להיות מוגבל למצבי לחץ, אבל להיות מעורבים בפיזיולוגיה נורמלי 24. אספקת חמצן לרקמות (בקצוות נימי) או בתוך רקמות (נמדד באמצעות microelectrodes) נע בין 2-6% במוח 25, 3-12% בתוך הריאות 26, 3.5-6% במעי 27, 4% ב הכבד 28, 7-12% בכליה 29, 4% בשריר 30, ו 6-7% ב מח עצם 31. תאי המיטוכונדריה מכילים פחות מ -1.3% חמצן 32. ערכים אלה הם הרבה יותר קרובים היפוקסיה מאשר באוויר הסביבה שבה תאים בתרבית באופן שגרתי. הדבר מצביע על כך מה בעבר נחשבו כמו תהליכים תאיים ספציפי היפוקסיה עשויים להיות רלוונטיים בסביבה פיזיולוגית. מעניין, eIF4F ו eIF4F H </sup&gt; להשתתף באופן פעיל בייזום התרגום של ברכות או כיתות נפרדות של mRNAs בכמה שורות תאים אנושיות שונות נחשפות לחמצן פיסיולוגי או &quot;physioxia&quot; 24. חמצן נמוך גם דוחפת להתפתחות תקינה של העובר 33 ותאי בדרך כלל יש שיעורי התפשטות גבוה, תוחלת החיים ארוכה יותר, פחות נזק בדנ&quot;א ותגובות הלחץ הכללי פחות physioxia 34. לכן, eIF4F H עשויה גורם מפתח בביטוי של גנים בוחרים בתנאים פיסיולוגיים. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לתאי תרבות בתנאי חמצן פיסיולוגיים קבועים או במגוון משתנה דינמי כי סביר יותר נציג microenvironments רקמות. אחד היתרונות של שיטה זו הוא כי התאים lysed בתוך תחנת עבודה היפוקסיה. לא לעתים קרובות ברור כיצד מעבר מתרבות תא היפוקסי תמוגה התא מתבצע פרוטוקולים אחרים. תאים הם לעתים קרובות להסיר תחילה מן חממת היפוקסיה קטנה להיותקדמי תמוגה, אבל לחשיפה זו חמצן יכולה להשפיע הביוכימיים כתגובה הסלולר לחמצן היא מהירה (אחד או שתיים דקות) 35. חלבוני כובע מחייב מסוימים דורשים אינטראקציות עם בסיס שני או יכולים hydrolyze GTP מ 7, ולכן חלק interactors הכובע עלול לרדת לטמיון בתהליך הטיהור. Agarose-צמוד אנלוגים כובע עמיד enzymatically ניתן להחליף בפרוטוקול זה. היכרות עם הפעילות ורכב eIF4F H וריאציות אחרות של eIF4F באמצעות השיטה המתוארת כאן שתשפוך אור על מנגנוני ביטוי הגנים המורכבים שתאיים לנצל במהלך מצבים פיסיולוגיים או תגובות דחק.

<table><tbody><tr><td>&gamma;-aminophenyl-m7GTP agarose C10-linked חרוזים Jena</td><td>Bioscience</td><td>AC-1555</td><td>Agarose-linked m7GTP</td></tr><tr><td>100 מ"מ צלחת תרבית</td><td>קורנינג</td><td></td><td>877222 10 ס"מ צלחת תרבית</td></tr><tr><td>150 מ"מ</td><td>Thermofisher</td><td>130183</td><td>צלחת תרבית 15 ס"מ</td></tr><tr><td>AEBSF הידרוכלוריד</td><td>ACROS אורגני</td><td>A0356829</td><td>AEBSF</td></tr><tr><td>חרוזי אגרוז</td><td>Jena Bioscience&nbsp;</td><td>AC-0015</td><td>בקרת חרוזי אגרוז</td></tr><tr><td>ברומופנול בלו</td><td>פישר</td><td>BP112-25</td><td>רכיב של מאגר טעינה SDS-PAGE</td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות צנטריפוגה</td><td>FroggaBio</td><td>1210-00S</td><td>משמש לצנטריפוגה בנפחים קטנים</td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים</td><td>פישר</td><td>1495970C</td><td>משמש בתרבית תאים ראשוניים</td></tr><tr><td>מעכב טריפסין מוגדר</td><td>פישר</td><td>R007100</td><td>DTI</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Fisher</td><td>BP172-25</td><td>DTT</td></tr><tr><td>מדיום תאי אפיתל (ערכה מלאה)</td><td>ScienCell</td><td>4101</td><td>כולל תוספי סרום וגורמי גדילה)</td></tr> <tr><td>גליצרול</td><td>פישר</td><td>BP229-1</td><td>רכיב של מאגר טעינה SDS-PAGE</td></tr><tr><td>100 מ"מ גואנוזין 5'-טריפוספט, 1 מ"ל</td><td>Jena Bioscience</td><td>272076-0251M</td><td>GTP</td></tr><tr><td>HCT116 קרצינומה של המעי הגס</td><td>ATCC</td><td>CCL-247</td><td>קו תאי סרטן אנושי</td></tr><tr><td>תאי אפיתל צינוריים פרוקסימליים של הכליה האנושית</td><td>ATCC</td><td>PCS-400-010</td><td>HRPTEC</td></tr><tr><td>Hyclone DMEM/High Glucose</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30022.01</td><td>מדיה סטנדרטית לתרבית תאים אנושיים</td></tr><tr><td>Hyclone תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>GE Life Sciences</td><td>SV30010</td><td>רכיב אנטיביוטי של DMEM</td></tr><tr><td>H35 HypOxystation</td><td>Hypoxygen</td><td>N/A</td><td>תחנת עבודה היפוקסיה</td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>MP ביו-רפואי</td><td>2198596</td><td>רכיב דטרגנט של מאגר ליזה</td></tr><tr><td>מונופוטסיום פוספט</td><td>פישר</td><td>P288-500</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>פישר</td><td>P217-500</td><td>KCl</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>פישר</td><td>M33-500</td><td>MgCl2</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר</td><td>BP358-10</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>נתרן פלואוריד</td><td>פישר</td><td>5299-100</td><td>NaF (רכיב מעכב פוספטאז של מאגר ליזה)</td></tr> <tr><td>דיסודיום פוספט</td><td>פישר</td><td>5369-500</td><td>Na2HPO4</td></tr> <tr><td>Premium Fetal Bovine Serum</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז FBS (100x)</td> <td>איתות תאים</td><td>58715</td><td>רכיב של מאגר ליזה</td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>פישר</td><td>BP166-100</td><td>SDS</td></tr><tr><td>נתרן אורתוואנדאט</td><td>סיגמא</td><td>56508</td><td>Na3VO4</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher</td><td>BP152-5</td><td>רכיב של מאגרים</td></tr><tr><td>0.05% טריפסין-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>2500-067</td><td>טריפסין המשמש לניתוק תאים נצמדים</td></tr></tbody></table>

ניתוח של חלבונים קושרי שווי בתאים אנושיים חשופים לתנאי חמצן פיזיולוגיים

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

בקרה תרגומית היא מוקד של ויסות גנים, במיוחד בתקופות של לחץ תאי. תרגום תלוי כובע באמצעות קומפלקס eIF4F הוא ללא ספק המסלול הנפוץ ביותר להתחלת סינתזת חלבון בתאים אוקריוטיים, אך וריאציות ספציפיות למתח של קומפלקס זה צצות כעת. טיהור חלבונים קושרי כובע עם שרף זיקה המורכב מ-m7GTP המקושר לאגרוז (אנלוגי כובע mRNA 5') הוא כלי שימושי לזיהוי גורמים המעורבים בוויסות התחלת התרגום. היפוקסיה (חמצן נמוך) היא מתח תאי שנתקל בו במהלך התפתחות העובר והתקדמות הגידול, והיא תלויה מאוד בוויסות התרגום. יתר על כן, לאחרונה דווח כי לאיברים בוגרים אנושיים יש תכולת חמצן נמוכה יותר (פיזיוקסיה 1-9% חמצן) הקרובה יותר להיפוקסיה מאשר האוויר הסביבתי שבו התאים מגודלים באופן שגרתי. עם האפיון המתמשך של קומפלקס eIF4F היפוקסי (eIF4FH), יש עניין גובר בהבנת התחלת תרגום תלוית חמצן דרך מכסה ה-mRNA 5'. לאחרונה פיתחנו שיטת תרבית תאים אנושיים לניתוח חלבונים קושרי כובע המווסתים על ידי זמינות חמצן. פרוטוקול זה מדגיש כי תרבית תאים וליזה יבוצעו בתחנת עבודה היפוקסיה כדי למנוע חשיפה לחמצן. יש לדגור תאים למשך 24 שעות לפחות כדי שהמדיה הנוזלית תתאזן עם האטמוספירה בתוך תחנת העבודה. כדי להימנע ממגבלה זו, ניתן להוסיף לתאים מדיה מותנית מראש (נטולת חמצן) אם נדרשות נקודות זמן קצרות יותר. חלבונים מסוימים קושרי כובע דורשים אינטראקציות עם בסיס שני או יכולים להידרוליזה של ה-m7GTP, ולכן חלק מהאינטראקטורים של הכובע עלולים להחמיץ בתהליך הטיהור. ניתן להחליף אנלוגים של כובע המקושר לאגרוז לעמידות אנזימטית בפרוטוקול זה. שיטה זו מאפשרת למשתמש לזהות גורמי תרגום חדשים המווסתים על ידי חמצן המעורבים בתרגום תלוי מכסה.

ניתוח יכולת Cap-מחייב תגובה חמצן של eIF4E ו eIF4E2 בבית מ 7 טור GTP זיקה איורים 1 ו -2 מייצגים כתמים המערבי של טיהור זיקה מ 7 GTP טיפוסי של שני חלבונים כובע מחייב מרכזי בתגובה לתנודות חמצן בשני שורות תאים אנושיים: תאי אפיתל צינורי הפרוקסימלי כליות אדם מן המעלה הראשונה (HRPTEC) ב קרצינומה F <stron...

כאן, אנו מציגים פרוטוקולי תרבית תאים אנושיים לניתוח גורמי התחלת תרגום הקושרים את מכסה ה-5' של mRNA בתנאי חמצן פיזיולוגיים. שיטה זו משתמשת באנלוגי כובע m7GTP המקושר לאגרוז ומתאימה לחקירת גורמי קשירת כובע ושותפיהם האינטראקטיביים.

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא ללכוד חלבונים קושרי כובע בתנאים של חמצן נמוך. שיטה זו משתמשת באנלוגי של שבעה כובעי מתיל-גואנוזין המקושרים לאגרוז כדי לחקור גורמי קשירת כובע ושותפיהם האינטראקטיביים. שיטה זו תעזור לענות על שאלות מפתח בתחום סינתזת החלבונים כגון זיהוי גורמים מווסתים חמצן חדשים המעורבים בתרגום תלוי מכסה.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהתאים נשמרים בתחנת עבודה של היפוקסיה עד לנקודת הליזה. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בסרטן מכיוון שתאי סרטן בתוך גידול חשופים לרמות נמוכות מאוד של חמצן ובקרה תרגומית ממלאת תפקיד מפתח בהתקדמות הגידול. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר קראנו פרסום שפורסם לאחרונה על ידי עמיתיו של קורונה המדווח כי חמצון הרקמות קרוב יותר למה שאנו מכנים היפוקסיה ולא לנורמקסיה שבה תאים מגודלים באופן שגרתי.התחל בהליך זה תרבית תאים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר ספירת התאים באמצעות המוציטומטר מזינים 150 מילימטר כלים מתורבתים המכילים 15 מיליליטר של מדיום שלם כדי להשיג צפיפות תאים של 2500 עד 5000 תאים לסנטימטר מרובע. השתמש בשתי צלחות 150 מ"מ עבור כל בדיקת קשירת מכסה.מניחים את כלי התרבות הזרעים בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ואטמוספירה של חמישה אחוזים פחמן דו חמצני. לאחר הדגירה של התאים לפחות 24 שעות, הכניסו את התאים לתחנת עבודה של היפוקסיה למשך הזמן הרצוי. לאחר מכן, הגדר את תחנת העבודה לפיזיוקסיה המתאימה.יש לחמם מראש תמיסת מלח חוצצת X פוספט, או PBS, וטריפסין באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. Aliquot 980 מיקרוליטר של מאגר ליזה לתוך צינור צנטריפוגה של 1.5 מיקרוליטר עבור כל בדיקת קשירת מכסה שמתבצעת. 10 מיקרוליטר של קוקטייל מעכב פרוטאז 100X ו-10 מיקרוליטר של הידרוקלוריד פלואוריד 4-בנזנסולפוניל ל-980 מיקרוליטר של מאגר ליזה על קרח.השלך את המדיה מכל צלחת 150 מילימטר במיכל פסולת בתוך תחנת העבודה להיפוקסיה. לאחר מכן, שטפו את התאים בשלושה עד ארבעה מיליליטר של X PBS חם והשליכו את הנוזל. הוסיפו מיליליטר אחד של טריפסין EDTA חם 05 אחוז לכל מנה ותנו לכלים לשבת במשך שתי דקות או עד שהתאים כבר לא נדבקים לצלחת.בעזרת פיפטה מעבירים את התאים של צלחת אחת לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. חזור על הפעולה לפי הצורך כך שכל צלחת תאים תועבר לצינור מיקרו-צנטריפוגה נפרד בנפח 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה את צינורות המיקרו-צנטריפוגה ב-6000 פעמים גרם למשך 90 שניות כדי לגלול את התאים.לאחר הצנטריפוגה יש לשאוב את הטריפסין באמצעות פיפטה מבלי להפריע לכדור. שטפו את התאים עם PBS אחד חם על ידי פיפטינג בעדינות של 200 מיקרוליטר PBS לתוך הצינור ממש מעל הגלולה. לאחר מכן שאפו את ה-PBS מבלי להפריע לגלולה.לאחר מכן, פיפטה 500 מיקרוליטר מתמיסת חיץ הליזיס המוכנה במיליליטר אחד על הגלולה הסלולרית הראשונה. השעו מחדש את הגלולה לחלוטין על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. שלב את התאים התלויים מחדש עם גלולת התא השנייה והשעיה מחדש את הגלולה השנייה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.חזור על תהליך זה עד שכל הכדורים שולבו והושעו מחדש עבור כל דגימה. לאחר מכן, שלב את הליזאט עם 500 המיקרוליטרים הנותרים של מאגר ליזה בצינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 ליטר. הסר את הדגימות מתחנת העבודה של ההיפוקסיה.ליז את התאים באמצעות תסיסה עדינה על ידי סיבוב הדגימות בארבע מעלות צלזיוס למשך 1.5 עד שעתיים. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את התאים הליזים ב-1200 פעמים גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר פסולת תאית. העבירו את הליזאט לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מיליליטר והשליכו את הגלולה.שמור חלק מהסופרנטנט שישמש כבקרת קלט ליזאט תא שלם לניתוח כתמים מערביים. כדי להתכונן לבדיקת קשירת הכובע השתמש במספריים כדי להסיר את קצה הפיפטה כדי להקל על איסוף תמיסת החרוזים. עבור כל דגימה העבירו 50 מיקרוליטר של תמיסת בקרת חרוזי אגרוז הריקה ו-50 מיקרוליטר של תמיסת החרוזים המקושרת ל-m7GTP agarose C10 כדי להפריד בין צינורות מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר.לאחר מכן, גלו את החרוזים על ידי צנטריפוגה של התרחיץ ב -500 פעמים גרם למשך 30 שניות. הסר את הסופרנטנט בזהירות ותלה מחדש את החרוזים ב -500 מיקרוליטר TBS. לאחר חזרה על שלבים אלה גלולה את החרוזים ב 500 פעמים גרם למשך 30 שניות והסר את הסופרנטנט.לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט המכיל את הליזאט לצינור המיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר המכיל את חרוזי האגרוז הריקים. דוגרים במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה. לאחר 10 דקות, גלול את חרוזי האגרוז הריקים על ידי צנטריפוגה ב -500 פעמים גרם למשך 30 שניות.לאחר הצנטריפוגה העבירו את הליזט שאינו נקשר לחרוזים לצינור המיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר המכיל את החרוזים המקושרים m7GTP agarose C10. שטפו את חרוזי האגרוז הריקים על ידי השעיה מחדש של החרוזים ב-500 מיקרוליטר של מאגר ליזה, כדורי החרוזים על ידי צנטריפוגה ב-500 זמן גרם למשך 30 שניות, והשלכת הסופרנטנט. חזור על פעולה זו ארבע פעמים בסך הכל חמש כביסות.השעו מחדש את חרוזי האגרוז הריקים במאגר דגימה אחד של X SDS-PAGE. ומרתיחים את החרוזים במשך 90 שניות בחום של 95 מעלות צלזיוס. אחסן את הדגימה ב-20 מעלות צלזיוס לניתוח כתם מערבי עתידי כדי לצפות במזג האוויר שהחלבון המעניין נקשר באופן לא ספציפי לחרוז.דגרו את הליזאט עם החרוזים המקושרים ל-m7GTP agarose C10 עם תסיסה עדינה למשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס כדי ללכוד חלבונים קושרי כובע. לאחר התסיסה, גלולה את החרוזים המקושרים ל-m7GTP agarose C10 על ידי צנטריפוגה ב-500 פעמים גרם למשך 30 שניות. לאחר השלכת הסופרנטנט, שטפו את החרוזים המקושרים ל-m7GTP agarose C10 כמו קודם.השעו מחדש את החרוזים ב-600 מיקרוליטר של מאגר ליזה והוסיפו GTP לריכוז סופי של מילימול אחד. דגרו את החרוזים המקושרים ל-m7GTP agarose C10 בתוספת GTP מילי-מולרי אחד עם תסיסה עדינה למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס. זה ינתק חלבונים שמקיימים אינטראקציה לא ספציפית עם m7GTP.גלולה את החרוזים המקושרים ל-C10 של m7GTP על ידי צנטריפוגה ב-500 זמן גרם למשך 30 שניות. העבירו את הסופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מיליליטר, והוסיפו 200 מיקרוליטר של ארבעה מאגר דגימת X SDS-PAGE. לאחר שטיפת החרוזים כמו קודם, השעו מחדש את החרוזים במאגר דגימה אחד של X SDS-PAGE והרתיחו בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות.מוצגים כאן כתמים מערביים מייצגים של טיהור זיקה טיפוסי m7GTP של שני חלבונים קושרי כובע עיקריים בתגובה לתנודות חמצן בתאי אפיתל צינורית פרוקסימליים ראשוניים של הכליה האנושית. הליזאטים של התאים נחשפו לשמונה אחוזים, חמישה אחוזים, שלושה אחוזים או אחוז אחד של חמצן במשך 24 שעות. הנתיבים כוללים 10 אחוז מכל הליזאט של התא כקלט, GTP שנשטף כדי למדוד את הספציפיות של m7GTP, והחלבונים הקשורים לחרוזי m7GTP לאחר שטיפת ה-GTP.נתונים משלושה ניסויים בלתי תלויים לפחות כומתו על ידי תמונה J ובאו לידי ביטוי כיחידות צפיפות יחסית ביחס לקלט של 10 אחוז מהליזאט של התא כולו. התוצאות מצביעות על כך שתאים אנושיים שגודלו תחת חמצן פיזיולוגי משתמשים בשני חלבונים קושרי מכסה כדי לגייס mRNA נפרדים לתרגום. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ללכוד חלבונים קושרי כובע בתנאים דלי חמצן.בזמן ניסיון הליך זה חשוב לזכור לשמור על תאים בתחנת העבודה של היפוקסיה עד לנקודת הליזיס, שכן חמצן יכול לשנות במהירות את התכונות הביוכימיות של גורמי התחלת התרגום הללו. בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כמו פיצול פוליזום כדי לענות על שאלות נוספות כגון אילו חלבונים קושרי כובע קשורים לתרגום פעיל בתנאים של חמצן נמוך.

analysis-cap-binding-proteins-human-cells-exposed-to-physiological

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

Saponin-permeabilized הכנה סיבים בשילוב עם ניתוח respirometric זרחון חמצוני מספק הערכה אינטגרטיבית של תפקוד המיטוכונדריה. הנשימה מיטוכונדריאלי במדינות פיזיולוגיים ופתולוגיים יכול לשקף השפעות רגולטוריות שונות, כולל אינטראקציות המיטוכונדריה, מורפולוגיה וביוכימיה.

הערכה Respirometric זרחון חמצוני ב-Saponin permeabilized סיבים לב

כאן אנו מציעים שיטות פשוטות לגרום היפוקסיה בתרביות תאים ו בדיקות פשוטות על מנת להעריך את מצב hypoxic של תרבויות.

אינדוקציה ובדיקה של היפוקסיה בתרבות התא

מקור:אלטרה ליאו1, לואיזה קרדוסו1, סבין שמיט1, אריך גניגר11אורובורוס אינסטרומנטססרטון זה מסביר כיצד שטף החמצן משמש להערכת נשימה מיטוכונדריאלית בתאי יונקים חיים וחדירים. הוא מדגים את השימוש הרציף בדיגיטונין, סובסטרטים מטבוליים, ADP, מצמד ומעכב לאפיון מצבי נשימה שונים. פרופיל שטף החמצן המתקבל חושף את תפקוד המיטוכונדריה ויעילות צימוד האנרגיה בתנאים מוגדרים.

מדידות שטף חמצן להערכת נשימה מיטוכונדריאלית בתאים חיים וחדירים

אנו מתארים טכניקה לניתוח של סינתזת RNA העולמית בהיפוקסיה באמצעות הדמיה. תיוג לחץ כימיה של RNA עד עתה לא בוצע תחת היפוקסיה ומאפשר הדמיה של שינויי RNA הגלובליים ברמת התא הבודד. גישה זו משלימה את טכניקות RNA ממוצע הקיימות, המאפשרת הדמיה ישירה של תא אל תא שינויים בסינתזת RNA הגלובלי.

ניתוח של גלובל RNA סינתזה ברמת התא בודד הבאות היפוקסיה

כאן נתאר פרוטוקול co-immunoprecipitation ללמוד אינטראקציות חלבון בין חלבונים גרעיניים אנדוגני בתנאים ובשפתיים. שיטה זו מתאימה הפגנה של אינטראקציות בין גורמי שעתוק גנים ברמת השעתוק הרגולטורים שותף ב היפוקסיה.

Co-immunoprecipitation Assay באמצעות חלבונים גרעיניים אנדוגני מתאי תרבותי בתנאים ובשפתיים

אנו מציגים פרוטוקול כדי להשיג חתימות פרוטיאומיה מבנית של מקרופאגים האנושית ואת ליישם את זה נחישות ההשפעה של סביבה חמצן נמוך על מקרופאג קיטוב.

ניתוח פרוטיאומיה מבנית של קיטוב מקרופאג האנושי תחת סביבה חמצן נמוך

כאן אנו מציגים שיטה לשימוש צנתר אופטי פנים-חדר בלבבות מעשה כדי לבצע ספקטרוסקופיה ספיגת על פני קיר הלב. הנתונים שהושגו מספק מידע חזק על מתח החמצן ברקמות, כמו גם ניצול מצע ופוטנציאל הממברנה במקביל עם ביצועים מדדים לב בהכנה זו בכל מקום.

מהצד הפנים-לב-אש קטטר אור עבור ניטור מטבוליזם הסלולר באמצעות בליעה בספיגת העבר של הלבבות המגברים

במאמר זה אנו מציגים אוסף של בדיקות למדידה ישירה של תפקוד המיטוכונדריה בתאי יונקים ללא תלות ביכולתם לצרוך חמצן מולקולרי.

בדיקות שאינן תלויות בחמצן למדידת תפקוד המיטוכונדריה ביונקים

פרוטוקול זה מפרט את הסינתזה, עטיפת ההמוגלובין ו-PEGylation פני השטח של ננו-חלקיקי UiO-66 הנקבוביים היררכית המיועדים לאספקת חמצן. ההליך משלב הנדסת פגמים עם קונוגציה ביאורתוגונלית מעודדת על ידי עיוות, ליצירת נשאים חדירים ויציבים פיזיולוגית המתאימים ליישומים ביורפואיים.

סינתזה, קיפוזציה של המוגלובין ו-PEGylation ביאורתוגונלית בננו-חלקיקי UiO-66 היררכיים נקבוביים ליישומי אספקת חמצן

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה transfecting siRNA ב cytotrophoblasts villous אדם המבודד טרי באמצעות microporation וזיהוי מתחמים-חלבון ה- DNA בתאים אלה. תאי transfected יכולים להיות במעקב על ידי כתם מערבי Emsa מנתח בזמן תרבות 4 ימים.

ניתוח Transfection siRNA ו Emsa על Cytotrophoblasts Villous אדם המבודד טרי

למדו ללכוד חלבונים קושרי כובע mRNA בתנאי חמצן נמוך באמצעות אנלוג m7GTP מקושר לאגרוז. שיטה זו מאפשרת זיהוי גורמים מוסדרי חמצן בתרגום תלוי-כובע בתאים אנושיים ותורמת להבנת בקרה תרגומית בסרטן.

ניתוח של חלבונים קושרי שווי בתאים אנושיים חשופים לתנאי חמצן פיזיולוגיים

גלה סרטונים נוספים