ניתוח של חלבונים קושרי שווי בתאים אנושיים חשופים לתנאי חמצן פיזיולוגיים

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא ללכוד חלבונים קושרי כובע בתנאים של חמצן נמוך. שיטה זו משתמשת באנלוגי של שבעה כובעי מתיל-גואנוזין המקושרים לאגרוז כדי לחקור גורמי קשירת כובע ושותפיהם האינטראקטיביים. שיטה זו תעזור לענות על שאלות מפתח בתחום סינתזת החלבונים כגון זיהוי גורמים מווסתים חמצן חדשים המעורבים בתרגום תלוי מכסה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהתאים נשמרים בתחנת עבודה של היפוקסיה עד לנקודת הליזה. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בסרטן מכיוון שתאי סרטן בתוך גידול חשופים לרמות נמוכות מאוד של חמצן ובקרה תרגומית ממלאת תפקיד מפתח בהתקדמות הגידול. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר קראנו פרסום שפורסם לאחרונה על ידי עמיתיו של קורונה המדווח כי חמצון הרקמות קרוב יותר למה שאנו מכנים היפוקסיה ולא לנורמקסיה שבה תאים מגודלים באופן שגרתי.

התחל בהליך זה תרבית תאים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר ספירת התאים באמצעות המוציטומטר מזינים 150 מילימטר כלים מתורבתים המכילים 15 מיליליטר של מדיום שלם כדי להשיג צפיפות תאים של 2500 עד 5000 תאים לסנטימטר מרובע. השתמש בשתי צלחות 150 מ"מ עבור כל בדיקת קשירת מכסה.

מניחים את כלי התרבות הזרעים בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ואטמוספירה של חמישה אחוזים פחמן דו חמצני. לאחר הדגירה של התאים לפחות 24 שעות, הכניסו את התאים לתחנת עבודה של היפוקסיה למשך הזמן הרצוי. לאחר מכן, הגדר את תחנת העבודה לפיזיוקסיה המתאימה.

יש לחמם מראש תמיסת מלח חוצצת X פוספט, או PBS, וטריפסין באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. Aliquot 980 מיקרוליטר של מאגר ליזה לתוך צינור צנטריפוגה של 1.5 מיקרוליטר עבור כל בדיקת קשירת מכסה שמתבצעת. 10 מיקרוליטר של קוקטייל מעכב פרוטאז 100X ו-10 מיקרוליטר של הידרוקלוריד פלואוריד 4-בנזנסולפוניל ל-980 מיקרוליטר של מאגר ליזה על קרח.

השלך את המדיה מכל צלחת 150 מילימטר במיכל פסולת בתוך תחנת העבודה להיפוקסיה. לאחר מכן, שטפו את התאים בשלושה עד ארבעה מיליליטר של X PBS חם והשליכו את הנוזל. הוסיפו מיליליטר אחד של טריפסין EDTA חם 05 אחוז לכל מנה ותנו לכלים לשבת במשך שתי דקות או עד שהתאים כבר לא נדבקים לצלחת.

בעזרת פיפטה מעבירים את התאים של צלחת אחת לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. חזור על הפעולה לפי הצורך כך שכל צלחת תאים תועבר לצינור מיקרו-צנטריפוגה נפרד בנפח 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה את צינורות המיקרו-צנטריפוגה ב-6000 פעמים גרם למשך 90 שניות כדי לגלול את התאים.

לאחר הצנטריפוגה יש לשאוב את הטריפסין באמצעות פיפטה מבלי להפריע לכדור. שטפו את התאים עם PBS אחד חם על ידי פיפטינג בעדינות של 200 מיקרוליטר PBS לתוך הצינור ממש מעל הגלולה. לאחר מכן שאפו את ה-PBS מבלי להפריע לגלולה.

לאחר מכן, פיפטה 500 מיקרוליטר מתמיסת חיץ הליזיס המוכנה במיליליטר אחד על הגלולה הסלולרית הראשונה. השעו מחדש את הגלולה לחלוטין על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. שלב את התאים התלויים מחדש עם גלולת התא השנייה והשעיה מחדש את הגלולה השנייה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.

חזור על תהליך זה עד שכל הכדורים שולבו והושעו מחדש עבור כל דגימה. לאחר מכן, שלב את הליזאט עם 500 המיקרוליטרים הנותרים של מאגר ליזה בצינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 ליטר. הסר את הדגימות מתחנת העבודה של ההיפוקסיה.

ליז את התאים באמצעות תסיסה עדינה על ידי סיבוב הדגימות בארבע מעלות צלזיוס למשך 1.5 עד שעתיים. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את התאים הליזים ב-1200 פעמים גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר פסולת תאית. העבירו את הליזאט לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מיליליטר והשליכו את הגלולה.

שמור חלק מהסופרנטנט שישמש כבקרת קלט ליזאט תא שלם לניתוח כתמים מערביים. כדי להתכונן לבדיקת קשירת הכובע השתמש במספריים כדי להסיר את קצה הפיפטה כדי להקל על איסוף תמיסת החרוזים. עבור כל דגימה העבירו 50 מיקרוליטר של תמיסת בקרת חרוזי אגרוז הריקה ו-50 מיקרוליטר של תמיסת החרוזים המקושרת ל-m7GTP agarose C10 כדי להפריד בין צינורות מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר.

לאחר מכן, גלו את החרוזים על ידי צנטריפוגה של התרחיץ ב -500 פעמים גרם למשך 30 שניות. הסר את הסופרנטנט בזהירות ותלה מחדש את החרוזים ב -500 מיקרוליטר TBS. לאחר חזרה על שלבים אלה גלולה את החרוזים ב 500 פעמים גרם למשך 30 שניות והסר את הסופרנטנט.

לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט המכיל את הליזאט לצינור המיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר המכיל את חרוזי האגרוז הריקים. דוגרים במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה. לאחר 10 דקות, גלול את חרוזי האגרוז הריקים על ידי צנטריפוגה ב -500 פעמים גרם למשך 30 שניות.

לאחר הצנטריפוגה העבירו את הליזט שאינו נקשר לחרוזים לצינור המיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר המכיל את החרוזים המקושרים m7GTP agarose C10. שטפו את חרוזי האגרוז הריקים על ידי השעיה מחדש של החרוזים ב-500 מיקרוליטר של מאגר ליזה, כדורי החרוזים על ידי צנטריפוגה ב-500 זמן גרם למשך 30 שניות, והשלכת הסופרנטנט. חזור על פעולה זו ארבע פעמים בסך הכל חמש כביסות.

השעו מחדש את חרוזי האגרוז הריקים במאגר דגימה אחד של X SDS-PAGE. ומרתיחים את החרוזים במשך 90 שניות בחום של 95 מעלות צלזיוס. אחסן את הדגימה ב-20 מעלות צלזיוס לניתוח כתם מערבי עתידי כדי לצפות במזג האוויר שהחלבון המעניין נקשר באופן לא ספציפי לחרוז.

דגרו את הליזאט עם החרוזים המקושרים ל-m7GTP agarose C10 עם תסיסה עדינה למשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס כדי ללכוד חלבונים קושרי כובע. לאחר התסיסה, גלולה את החרוזים המקושרים ל-m7GTP agarose C10 על ידי צנטריפוגה ב-500 פעמים גרם למשך 30 שניות. לאחר השלכת הסופרנטנט, שטפו את החרוזים המקושרים ל-m7GTP agarose C10 כמו קודם.

השעו מחדש את החרוזים ב-600 מיקרוליטר של מאגר ליזה והוסיפו GTP לריכוז סופי של מילימול אחד. דגרו את החרוזים המקושרים ל-m7GTP agarose C10 בתוספת GTP מילי-מולרי אחד עם תסיסה עדינה למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס. זה ינתק חלבונים שמקיימים אינטראקציה לא ספציפית עם m7GTP.

גלולה את החרוזים המקושרים ל-C10 של m7GTP על ידי צנטריפוגה ב-500 זמן גרם למשך 30 שניות. העבירו את הסופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מיליליטר, והוסיפו 200 מיקרוליטר של ארבעה מאגר דגימת X SDS-PAGE. לאחר שטיפת החרוזים כמו קודם, השעו מחדש את החרוזים במאגר דגימה אחד של X SDS-PAGE והרתיחו בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות.

מוצגים כאן כתמים מערביים מייצגים של טיהור זיקה טיפוסי m7GTP של שני חלבונים קושרי כובע עיקריים בתגובה לתנודות חמצן בתאי אפיתל צינורית פרוקסימליים ראשוניים של הכליה האנושית. הליזאטים של התאים נחשפו לשמונה אחוזים, חמישה אחוזים, שלושה אחוזים או אחוז אחד של חמצן במשך 24 שעות. הנתיבים כוללים 10 אחוז מכל הליזאט של התא כקלט, GTP שנשטף כדי למדוד את הספציפיות של m7GTP, והחלבונים הקשורים לחרוזי m7GTP לאחר שטיפת ה-GTP.

נתונים משלושה ניסויים בלתי תלויים לפחות כומתו על ידי תמונה J ובאו לידי ביטוי כיחידות צפיפות יחסית ביחס לקלט של 10 אחוז מהליזאט של התא כולו. התוצאות מצביעות על כך שתאים אנושיים שגודלו תחת חמצן פיזיולוגי משתמשים בשני חלבונים קושרי מכסה כדי לגייס mRNA נפרדים לתרגום. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ללכוד חלבונים קושרי כובע בתנאים דלי חמצן.

בזמן ניסיון הליך זה חשוב לזכור לשמור על תאים בתחנת העבודה של היפוקסיה עד לנקודת הליזיס, שכן חמצן יכול לשנות במהירות את התכונות הביוכימיות של גורמי התחלת התרגום הללו. בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כמו פיצול פוליזום כדי לענות על שאלות נוספות כגון אילו חלבונים קושרי כובע קשורים לתרגום פעיל בתנאים של חמצן נמוך.