סידור זמני של נתוני התבטאות דינמיים מן הביטוי המרחבי מפורט מפות

המטרה הכללית של הליך ניסיוני זה היא למפות את הדינמיקה של ביטוי גנים במרחב ובזמן של שעון הפילוח בחולייתנים באמצעות דגימת רקמה מקובעת. שיטה זו מאפשרת הערכה בלתי מוטה של דינמיקת גנים תנודתית בבלחמה הפרסומטית, ודבר זה חיוני להבנת המנגנונים המולקולריים השולטים בסומטוגנזה בחולייתנים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להפיק ולעבד דגימות רבות בו-זמנית, מה שמאפשר ניתוח רב-חלקי ברזולוציה גבוהה של דינמיקת ביטוי גנים ברקמה מקובעת.

את הפרוצדורה תדגים ד"ר שארלוט ביילי, שהייתה בעבר פוסט-דוקטורנטית במעבדתי. לאחר השגת קרן רחם של עכבר בהתאם לפרוטוקול הכתוב, תחת מיקרוסקופ סטריאו, השתמשה במספריים קמורות כדי לחתוך את הקרום השרירי העבה של קרן הרחם ולהוציא בזהירות כל עובר. בעזרת מספריים קמורות ופינצטה עדינה, הפרידה את שק הש Öffentlichkeit מהעובר.

לאחר מכן, באמצעות מחט כירורגית או מספריים מעוקלים, קצרו את רקמת הזנב מכל עובר על ידי חיתוך העובר קדמית לניצני הגפה האחוריים. הנחו את רקמת הזנב כאשר הצד הבטני פונה כלפי מטה. לאחר מכן, צרו זוגות של השתמרות (explants) של ה-PSM על ידי חלוקת רקמת הזנב לשני חצאים לאורך קו האמצע, תוך שימוש בתנועת נדנוד עדינה של המחט.

ודאו כי צינור העצבים, הנוטוכורד ורקמת ה-PSM מחולקים באופן שווה בין שני האקספלנטים. לאחר מכן, העבירו בעזרת פיפטה כל אקספלנט PSM קונטרלטרלי אל הצד התחתון של מכסה פלסטיק של צלחת תרבית בנפח קטן של מצע תרבית שחומם מראש. הניחו את הצלחת על גבי המכסה והפכו אותה במהירות, כך שרקמת ה-PSM תהיה תלויה מהמכסה בטיפה תלויה של מצע.

לאחר מכן, גדלו את השתילים של ה-PSM בתא לחות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך שעה עד שעתיים. העבירו זוגות של שתילים של PSM לבארות בודדות בצלחת תרבית רקמות בעלת 24 בארות. לאחר מכן, הוסיפו ל samples 4%paraformaldehyde ב-PBS והדגירו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, או בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius על פלטפורמת נדנוד למשך הלילה.

לאחר הדגירה, יש להשתמש ב-PBS לשטיפת בארי הדגימות בטמפרטורת החדר על פלטפורמה נעה (rocking platform). באמצעות פיפט פסטור פלסטיק דק, יש להחליף את תמיסת ה-PBS על הדגימות שלושה עד ארבעה פעמים. לביצוע אימונוהיסטוכימיה, יש להוסיף 2% Triton X-100 ב-PBS לכל פרוס של PSM מכל זוג עובריים, ולהדגיר את הדגימות בטמפרטורת החדר על פלטפורמה נעה למשך שעה אחת לצורך שטיפה.

יש להשתמש ב-PBS כדי לשטוף את הדגימות קצרה. לאחר מכן, החליפו את ה-PBS בתמיסת חסימה (blocking solution) והדגירו את הדגימות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס על פלטפורמה נעה (rocking platform) למשך לילה. דללו את הנוגדנים הראשוניים הרצויים באמצעות באפר עבודה (working buffer).

בדוגמה זו, נעשה שימוש בנוגדנים ל-Delta-like 1 ול-Notch1 בדילול של 1:25. יש להוסיף את הנוגדנים לאקספלאנטים (explants) ולהדגיר את הדגימות על פלטפורמת ניעור בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שלושה עד חמישה ימים. לאחר ההדגרה, יש לשטוף את הדגימות פעמיים באמצעות PBS למשך חמש עד עשר דקות בכל פעם.

לאחר מכן בצעו שלוש שטיפות ב-0.3% Triton X-100 ב-PBS בטמפרטורת החדר על פלטפורמת נדנוד. לאחר דילול הנוגדנים המשניים בתמיסת עבודה, הוסיפו 250-500 microliters של תמיסת הנוגדנים לכל באר של דגימה, תוך הקפדה לא להשתמש במיקרוליטרים האחרונים של התמיסה, שעלולים להכיל צברים של נוגדנים. כסו את הפלטה בנייר אלומיניום והדגירו את הדגימות בתמיסת הנוגדנים המשניים בחושך בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך שלושה עד חמישה ימים.

לאחר הדגירה, יש לשטוף את הדגימות פעמיים ב-PBST למשך עשר דקות בכל פעם. לאחר מכן, יש לשטוף את הרקמה פעם אחת ב-PBS בטמפרטורת החדר על פלטפורמה נעה למשך חמש דקות. בהתאם לפרוטוקול הכתוב, יש לבצע דהידרציה ורהידרטציה לשאריות הבלשנות (explants) של ה-PSM מהצד הקונטרלטורי באמצעות סדרת דילול של אתנול ב-PBST.

הוסיפו 10 µg/mL של Proteinase K ב-0.1% PBST לאקספלאנטים, והדגירו את הרקמה ללא ערבוב למשך חמש דקות. לאחר מכן, הסירו במהירות את תמיסת ה-Proteinase K והשתמשו ב-PBST לשטיפה קצרה של הדגימות. הוסיפו 4% formaldehyde ו-0.1% glutaraldehyde ב-PBST לאקספלאנטים של ה-PSM לצורך קיבוע נוסף, והדגירו את הדגימות למשך 30 דקות.

לאחר מכן, לאחר שטיפת הדגימות פעמיים באמצעות PBST למשך עשר דקות בכל פעם, הוסף תערובת היברידיזציה בריכוז 50% לרקמה והדגרה בטמפרטורה של 65 degrees Celsius ללא ערבוב למשך עשר דקות. לאחר הדגרת הדגימות ותערובת ההיברידיזציה בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הסר את התמיסה והוסף 0.25 עד 0.5 milliliters של תערובת היברידיזציה שחוממה מראש ומכילה גשושית RNA antisense המסומנת בדיגוקסיגנין נגד רכיב מוכר של שעון הפילולה (segmentation clock). השתמש בסרט דביק כדי לאטום את הפלטה והדגר את הדגימות בטמפרטורה של 65 degrees Celsius למשך שני לילות.

לאחר הדגירה, השתמשו בתערובת היברידיזציה 50% ב-TBST שחוממה מראש כדי לשטוף את הדגימות למשך 15 דקות. לאחר מכן, שטפו את הדגימות פעמיים ב-TBST לפני הדגרה של הרקמה ב-TBST בטמפרטורת החדר על פלטפורמה נעה (rocking platform) למשך 30 דקות. לאחר מכן, הדגירו מראש את השבבים (explants) בתמיסת חסימה למשך שעתיים לפחות.

לאחר מכן, החליפו את התמיסה בתמיסת חסימה טרייה, המכילה דילול של 1:200 של נוגדן anti-digoxigenin המשורשב ל-HRB. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, השתמשו ב-TBST כדי לשטוף את הדגימות שלוש פעמים בטמפרטורת החדר והעבירו אותן לבארים נפרדות של פלטת תרבית רקמה חדשה בעלת 24 בארות.

לאחר מכן, שטפו את השתילים שלושה פעמים עם TBST למשך שעה אחת בכל פעם. השתמשו בערכה להגברת אות טיראמיד (tyramide signal amplification kit) כדי להנחית ויזואלית את ה-mRNA שהזוהה לפני הכנת הדגימות לדימוג. הכינו שקופית זכוכית בעלת הידבקות טעונה עבור כל זוג שתילים, על ידי הסרת שכבת ההדבקה ממפריד דימוג בעובי 0.12 mm והדבקתו על שקופית זכוכית.

לאחר מיקום זוג Eksplants על השקופית בהתאם לפרוטוקול הכתוב, המתינו 45-60 שניות עד שהדגימות יידבקו לשקופית, עד שהרקמה מתחילה להיראות דביקה ושקופה מבלי להתייבש לחלוטין. בינתיים, השתמשו בפינצטה כדי להסיר את שכבת ההדבקה שנותרה מהמפריד (spacer), והוסיפו טיפה גדולה של תמיסת קיבוע וביรือר (mounting medium and clearing solution) בעלת תפקוד כפול על הדגימות במרכז המפריד. הניחו כיסוי זכוכית עגול מעל הדגימות תוך הבטחה שתמיסת הקיבוע תפוזר באופן שווה וכי כל הקצוות יהיו במגע עם המפריד.

לאחר מכן, הנח את זכוכית הכיסוי הפוכה על נייר סופג ללא סיבים. לחץ בחוזקה כדי להבטיח שזכוכית הכיסוי נצמדת במלואה למקצב (spacer) וכי עודפי חומר ההטמעה הוסרו. חזור על תהליך זה עד שלא יישאר עוד חומר הטמעה שנספג בנייר.

יש לנקות ולסמן את השקופית ולאחסנה בחושך עד לצילום. לאחר מכן, יש לבצע את הצילום והניתוח בהתאם לפרוטוקול הכתוב. בניסוי זה, מוצג כי ביטוי החלבונים Delta-Like 1 ו-Notch1 תנוד ביטוי שאינו מסונכרן, וזאת על ידי סידור זמני של העוברים בהתאם לתעתוק הראשוני של הגן intronic lunatic fringe, גן בשעון הפילוח המונחה על ידי Notch, שזוהה בחצי אחד מכל זוג של רססי רקמה (explants).

הלוחות מסודרים לפי שלב אחד, שני ושלוש של מחזור שעון הסגמנטציה. היקף תחומי הביטוי של Delta-Like 1, Notch1 ו-intronic lunatic fringe לאורך הציר האנטרו-פוסטריורי של ה-PSM מסומן על ידי פסים מקודדי צבע. כפי שמוצג כאן, נוצר גרף לכימות עוצמת האות של Delta-Like 1, Notch1 ו-intronic lunatic fringe ביחס לציר האנטרו-פוסטריורי של ה-PSM, והוא ממחיש את השונות הצירית ואת עוצמת האות לאורך ה-PSM במהלך מחזור השעון.

קימוגרפים (Kymographs) ממחישים את ההתפלגות המרחבית של Delta-Like 1, Notch1 ו-intronic lunatic fringe לאורך מספר PSMs. כל שורה בקימוגרף מייצגת את עוצמת האות של שתל PSM בודד. כימות עוצמת האות של Delta-Like 1, Notch1 ו-intronic lunatic fringe ביחס לציר הקדמי-אחורי של ה-PSM חושף דינמיקת ביטוי תנודתית ברורה עבור מטרות אלו.

לבסוף, קימוגרפים אלו מראים את ההתפלגות המרחבית של הצורה השבורה והפעילה של קולטן ה-Notch, NICD, ושל Delta-Like 1, intronic lunatic fringe ו-Notch1 לאורך מספר רב של PSMs. טכניקה זו סייעה לחוקרים בתחום המיטוגנזה של חולייתים להבין טוב יותר את דינמיקת התנודות של גנים של סגמנטציה במזודרמה הפרסומטית של אפרוחים ועכברים. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה על מספר רב של דגימות, מה שמאפשר ניתוח סימולטני של פרופילי ביטוי של מספר mRNA וחלבונים רלוונטיים.

בעקבות פרוצדורה זו, כימות נוסף של נתוני התמונה יכול לספק הבנה של עיכובים זמניים בביטוי גנים, כמו גם של הלוקליזציה התת-תאית של אותות ה-RNA והחלבון המעניינים את החוקר. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו ניתן למפות את הדינמיקה המרחבית-זמנית של ביטוי הגנים בשעון הסגמנטציה של חולייתן באמצעות דגימת רקמה עבה. ניתן להמשיך זאת בניתוח תמונה אוטומטי, כמפורט בפרוטוקול הכתוב.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להבטיח חלוקה שווה של ה-PSM, הנוטוכורד (notochord) והצינור העצבי בין ה-explants של ה-PSM, ולבצע אופטימיזציה מדויקת של דילול הנוגדנים לפני התחלה. זכרו כי עבודה עם פורממיד, פראפורמלידה וגלוטראלדהיד עלולה להיות מסוכנת ביותר. הקפידו להשתמש בציוד מיגון אישי ולעבוד תחת מ hút (fume hood) במידת הצורך.