סידור זמני של נתוני התבטאות דינמיים מן הביטוי המרחבי מפורט מפות

המטרה הכוללת של הליך ניסיוני זה היא למפות את דינמיקת ביטוי הגנים המרחבית-זמנית של שעון פילוח החולייתנים באמצעות דגימת רקמות קבועות. שיטה זו מאפשרת הערכה בלתי משוחדת של דינמיקת גנים תנודתיים במזודרם הפרסומיטי, וזה חיוני להבנת המנגנונים המולקולריים השולטים בסומטוגנזה של בעלי חוליות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לייצר ולעבד דגימות רבות בו זמנית, מה שמאפשר ניתוח גבוה של שלושה חלקים של דינמיקת ביטוי גנים ברקמה קבועה.

תדגים את ההליך ד"ר שרלוט ביילי, שהיא פוסט-דוקטורנטית לשעבר במעבדה שלי. לאחר השגת קרן רחם עכבר על פי פרוטוקול הטקסט, תחת מיקרוסקופ סטריאו, השתמשו במספריים מעוקלים כדי לחתוך את הקרום השרירי העבה של קרן הרחם ולחלץ בזהירות כל עובר. בעזרת מספריים מעוקלים ומלקחיים עדינים, נתחו את שק מי השפיר מכל עובר.

לאחר מכן, בעזרת מחט כירורגית או מספריים מעוקלות, קצרו את רקמת הזנב מכל עובר על ידי חיתוך העובר הקדמי לניצני הגפיים האחוריות. איזון רקמת הזנב, הצד הגחוני כלפי מטה. לאחר מכן צור זוגות של צמחי PSM על ידי ניתוח רקמת הזנב לשני חצאים לאורך קו האמצע, תוך שימוש בתנועת נדנוד עדינה עם המחט.

ודא שהצינור העצבי, הנוטוכורד ורקמת ה-PSM מחולקים באופן שווה בין שני האקספלנטים. לאחר מכן פיפטה כל צמח PSM נגדי על הצד התחתון של מכסה צלחת תרבית פלסטיק 35 מ"מ בנפח קטן של מדיום תרבית שחומם מראש. מניחים את המנה על החלק העליון של המכסה והופכים אותה במהירות, כך שרקמת ה-PSM תלויה מהמכסה בטיפה תלויה של מדיום.

לאחר מכן תרבית את ה-PSM בתא לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה עד שעתיים. העבירו זוגות של צמחי PSM לבארות הבודדות של צלחת תרבית רקמות של 24 בארות. לאחר מכן הוסיפו 4% פרפורמלדהיד ב-PBS לדגימות ודגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה, או בארבע מעלות צלזיוס על משטח נדנדה למשך הלילה.

לאחר הדגירה, השתמש ב-PBS כדי לשטוף את בארות הדגימה בטמפרטורת החדר על משטח נדנדה. בעזרת פיפטת פסטר מפלסטיק עדינה, החלף את תמיסת ה-PBS על הדגימות שלוש עד ארבע פעמים. כדי לבצע אימונוהיסטוכימיה, הוסף 2% Triton X-100 ב-PBS ל-PSM אחד מכל זוג עוברי ודגר את הדגימות בטמפרטורת החדר על משטח נדנדה למשך שעה כדי לשטוף אותן.

השתמש ב-PBS כדי לשטוף בקצרה את הדגימות. לאחר מכן החלף את ה-PBS בתמיסת חסימה ודגר את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס על משטח נדנדה למשך הלילה. באמצעות חיץ עובד, יש לדלל את הנוגדנים הראשוניים הרצויים.

בדוגמה זו, נוגדנים לדמויי דלתא 1 ו-Notch1 משמשים בדילול של 1:25. הוסיפו את הנוגדנים לצמחים ודגרו את הדגימות על משטח נדנדה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שלושה עד חמישה ימים. לאחר הדגירה, השתמש ב-PBS כדי לשטוף את הדגימות פעמיים במשך חמש עד עשר דקות כל אחת.

לאחר מכן בצע שלוש שטיפות ב-0.3% Triton X-100 ב-PBS בטמפרטורת החדר על פלטפורמת נדנדה. לאחר דילול נוגדנים משניים במאגר העבודה, הוסף 250-500 מיקרוליטר מתמיסת הנוגדנים לכל דגימה היטב, תוך הקפדה לא להשתמש במיקרוליטרים האחרונים של התמיסה, שעלולים להכיל אגרגטים של נוגדנים. בעזרת נייר כסף, מכסים את הצלחת ודוגרים את הדגימות בתמיסת נוגדנים משנית בחושך בארבע מעלות צלזיוס למשך שלושה עד חמישה ימים.

לאחר הדגירה, השתמש ב-PBST כדי לשטוף את הדגימות פעמיים במשך עשר דקות כל אחת. לאחר מכן השתמש ב-PBS כדי לשטוף את הטישו פעם אחת בטמפרטורת החדר על משטח נדנדה למשך חמש דקות. בעקבות פרוטוקול הטקסט, יש לייבש ולהחזיר לחות לשאר חלקי ה-PSM הנגדיים באמצעות סדרת דילול PBST אתנול.

הוסיפו עשרה מיקרוגרם למיליליטר של פרוטאינאז K ב-0.1% PBST לצמחים, ודגרו על הרקמה ללא תסיסה למשך חמש דקות. לאחר מכן הסר במהירות את תמיסת Proteinase K והשתמש ב-PBST כדי לשטוף בקצרה את הדגימות. הוסף 4% פורמלדהיד ו-0.1% גלוטרלדהיד ב-PBST ל-PSM explant כדי לתקן אותם ולדגור את הדגימות למשך 30 דקות.

לאחר מכן, לאחר שימוש ב-PBST כדי לשטוף את הדגימות פעמיים במשך עשר דקות כל אחת, הוסיפו 50% תערובת הכלאה לרקמה ודגרו ב-65 מעלות צלזיוס ללא תסיסה למשך עשר דקות. לאחר הדגירה של הדגימות ותערובת ההכלאה על פי פרוטוקול הטקסט, הסר את התמיסה והוסף 0.25 עד 0.5 מיליליטר של תערובת הכלאה מחוממת מראש המכילה בדיקת RNA אנטי-סנס עם תווית digoxigenin כנגד רכיב שעון סגמנטציה ידוע. השתמש בנייר דבק כדי לאטום את הצלחת ולדגור את הדגימות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך שני לילות.

לאחר הדגירה, השתמש בתערובת הכלאה של 50% מחוממת מראש ב-TBST כדי לשטוף את הדגימות למשך 15 דקות. לאחר מכן השתמש ב-TBST כדי לשטוף את הדגימות פעמיים לפני הדגירה של הרקמה ב-TBST בטמפרטורת החדר על משטח נדנדה למשך 30 דקות. לאחר מכן, דגרו מראש את האקספלנטים בתמיסה חוסמת למשך שעתיים לפחות.

לאחר מכן החלף את התמיסה בתמיסת חסימה טרייה, המכילה דילול של 1:200 של נוגדן אנטי-דיגוקסיגנין מצומד HRB. דגרו את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, השתמש ב-TBST כדי לשטוף את הדגימות שלוש פעמים בטמפרטורת החדר ולהעביר אותן לבארות בודדות של צלחת תרבית רקמה חדשה של 24 בארות.

לאחר מכן עם TBST, שטפו את הצמחים שלוש פעמים למשך שעה כל אחת. השתמש בערכת הגברת אות טירמיד כדי לדמיין את ה-mRNA שזוהה לפני הכנת הדגימות להדמיה. הכן שקופית זכוכית הידבקות טעונה אחת עבור כל זוג צמחים על ידי הסרת ציפוי הדבק ממרווח הדמיה בעובי 0.12 מ"מ והדבקתו על שקופית זכוכית.

לאחר מיקום זוג או שתלים על השקופית לפי פרוטוקול הטקסט, אפשר לדגימות להיצמד לשקופית למשך 45-60 שניות, עד שהרקמה מתחילה להיראות דביקה ושקופה מבלי להתייבש לחלוטין. בינתיים, השתמש במלקחיים כדי להסיר את תוחם הדבק שנותר מהמרווח ולהוסיף טיפה גדולה של מדיום הרכבה בעל פונקציה כפולה ותמיסת ניקוי לדגימות במרכז המרווח. החל כיסוי עגול על פני הדגימות וודא שאמצעי ההרכבה מפוזר באופן שווה ושכל הקצוות יוצרים מגע עם המרווח.

לאחר מכן הנח את שקופית הכיסוי הפוכה על נייר מוך נמוך. לחץ כלפי מטה בחוזקה כדי לוודא שהחלקת הכיסוי נצמדת במלואה למרווח ושכל אמצעי הרכבה עודף מוסר. חזור על תהליך זה עד שלא עוד אמצעי הרכבה מכתים את הנייר.

נקה וסמן את השקופית ואחסן אותה בחושך עד להדמיה. לאחר מכן בצע הדמיה וניתוח על פי פרוטוקול הטקסט. בניסוי זה, ביטוי חלבון Delta-Like 1 ו-Notch1 הוכח כמתנדנד מחוץ לסנכרון על ידי סידור זמני של עוברים על פי השעתוק המתהווה של גן שעון הסגמנטציה המווסת Notch שוליים מטורפים אינטרוניים שזוהו במחצית האחת של כל זוג אקספלנטים.

הפאנלים מסודרים לפי שלב ראשון, שני ושלישי של מחזור שעון הפילוח. היקף תחומי הביטוי עבור Delta-Like 1, Notch1 ושוליים מטורפים אינטרוניים לאורך הציר האנטרופוסטריורי של ה-PSM מסומנים על ידי פסים מקודדים בצבע. כפי שמוצג כאן, נוצרת עלילה לכימות עוצמת אות שוליים משוגעים דמויי דלתא 1, Notch1 ואינטרוני ביחס לציר האנטרופוסטריורי של ה-PSM וממחישה את השונות הצירית ועוצמת האות על פני ה-PSM לאורך מחזור השעון.

קימוגרפים מדמיינים את ההתפלגות המרחבית של שוליים מטורפים דמויי דלתא 1, Notch1 ואינטרונים על פני PSMs רבים. כל שורה בקימוגרף מייצגת את עוצמת האות של צמח PSM בודד. כימות של עוצמת אות שוליים משוגעים דמויי דלתא 1, Notch1 ואינטרוני ביחס לציר האנטרופוסטריורי של ה-PSM חושף דינמיקת ביטוי תנודתית ברורה עבור מטרות אלה.

לבסוף, קימוגרפים אלה מראים את ההתפלגות המרחבית של הצורה המפוצלת והמופעלת של קולטן החריץ NICD, דמוי דלתא 1, שוליים משוגעים אינטרוניים ו-Notch1 על פני PSMs רבים. טכניקה זו סייעה לחוקרים בתחום המיטוגנזיקה של בעלי חוליות להבין טוב יותר את דינמיקת התנודות של גנים במזודרם הפרזומיטי של הגוזלים והעכברים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו על מספר רב של דגימות המאפשרת לנתח את פרופילי הביטוי של מספר mRNA וחלבונים מעניינים בו זמנית.

בעקבות הליך זה, כימות נוסף של נתוני התמונה יכול לספק הבנה של עיכובים זמניים בביטוי גנים כמו גם את הלוקליזציה התת-תאית של אותות ה-RNA והחלבון המעניינים את החוקר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למפות את דינמיקת ביטוי הגנים המרחבית-טמפורלית של שעון פילוח החולייתנים באמצעות דגימת רקמות עבה. לאחר מכן ניתן לבצע ניתוח תמונה אוטומטי כמפורט בפרוטוקול הטקסט.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב להבטיח פיזור שווה של PSM, נוטוקורד והצינור העצבי בין צמחי PSM ולבצע אופטימיזציה קפדנית של דילול הנוגדנים לפני שמתחילים. זכרו שעבודה עם פורממיד, פרפורמלדהיד וגלוטרלדהיד עלולה להיות מסוכנת ביותר. הקפד ללבוש ציוד מגן אישי ולעבוד במכסה אדים במידת הצורך.