Name: כימות זמניות של ביטוי MAPK מושרה בתאי שמרים יחיד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-04T23:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: חקור כימות ביטוי MAPK ברמת תא בודד בשמרים באמצעות מיקרוסקופיה וציטומטריית זרימה. שיטות אלו מאפשרות ניתוח דינמיקת ביטוי גנים בזמן אמת ומספקות תובנות לגבי מסלולי שידור אותות תאיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים למתיאס פיטר וקבוצתו במכון לביוכימיה במכון הטכנולוגי בציריך שבו שיטות אלו פותחו. עבודה זו נתמכה על ידי שוויצרי הקרן הלאומית למדע.

1. מדידות מיקרוסקופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 5 מיליליטר של מדיום סינטטי עם שמרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים ב30 מעלות צלזיוס למשך לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את OD 600 של תרבות הלילה למחרת בבוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תרבות הלילה ב 5 מיליליטר בינוני סינתטית לOD 600 0.05. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול התרבות בדילול מלא ב30 מעלות צלזיוס במשך לפחות 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פי 3 מרוכז (0.6 M) פתרון NaCl במדיום סינטטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 1 מ&quot;ג / מיליליטר של concanavalin (ConA) ב-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תסנין ~ 200 μl של פתרון ConA לתוך השקופית היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתת לעמוד במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון ConA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 150 μl H 2 O אל הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד 600 OD של תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 300 μl של תרבית תאים בOD 600 = 0.02 בmicrotube 1.5 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate התאים באמבט מים במשך 45 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה מערבולת מילcrotube. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate התאים באמבט מים במשך 45 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה מערבולת microtube. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של תרבית תאים לטוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה 30 דקות כדי לאפשר לתאים ליישב לתחתית הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקף גם במיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הגדרות תאורה עבור ערוץ הניאון שיירשם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הגדרות התאורה לשתי תמונות בהירות שדה (אחד קצת מחוץ לפוקוס: 3 מיקרומטר מתחת למישור המוקד, כדי לאפשר פילוח נכון של התאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את מרווחי הזמן למדידת הזמן לשגות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את שדות מבט לתמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הרכישה של כמה מסגרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשהות את הרכישה להוסיף ל0.6 בינוני M NaCl 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קורות חיים הדמיה. </li></ol> 2. מדידות זרימת cytometry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 5 מיליליטר של מדיום סינטטי עם שמרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול ב30 מעלות צלזיוס למשך לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמצעיOD 600 של תרבות הלילה למחרת בבוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תרבות הלילה ב 5 מיליליטר בינוני סינתטית לOD 600 0.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול ב30 מעלות צלזיוס במשך לפחות 4 שעות כדי להגיע 600 OD של 0.2-0.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 מ&quot;ג / מיליליטר פתרון cycloheximide בH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פי 3 מרוכז (0.6 M) פתרון NaCl במדיום סינטטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן microtube 1.5 מיליליטר אחד עם של 0.6 בינוני M NaCl 100 μl עבור כל נקודת זמן כדי להימדד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן 0, להוסיף 200 μl של תרבית תאים לכל microtube. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם הרועד ב30 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן t, להוסיף 30 cycloheximide μl לmicrotube. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 2.11 עבור כל נקודות הזמן הרצויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כל microtubes לפחות 45 דקות ועד 3 שעות ב30 ° C עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צינורות FACS עם 400 μl PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate התאים באמבט מים במשך דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה מערבולת microtubes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בןicate התאים באמבט מים במשך דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה מערבולת microtubes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 תרבית תאי μl מmicrotube לצינור FACS המקביל שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את לייזר 488 ננומטר עירור ו530/30 מסנן bandpass ננומטר לצורך זיהוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחן אינו מביע ומבטא באופן מלא לדוגמא כדי לוודא אם הם נופלים בטווח רגישות גלאי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד 10,000 תאים לכל דגימה שנרכשה. </li></ol>

<ol><li>Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+expression+programs+in+the+response+of+yeast+cells+to+environmental+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes.</a> Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).</li>
<li>de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MAPK+Hog1+recruits+Rpd3+histone+deacetylase+to+activate+osmoresponsive+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The MAPK Hog1 recruits Rpd3 histone deacetylase to activate osmoresponsive genes.</a> Nature. 427 (6972), 370-374 (2004).</li>
<li>Ghaemmaghami, S., Huh, W. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+expression+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein expression in yeast.</a> Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).</li>
<li>Wu, J. -Q., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+cytokinesis+proteins+globally+and+locally+in+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Counting cytokinesis proteins globally and locally in fission yeast.</a> Science. 310 (5746), 310-314 (2005).</li>
<li>Colman-Lerner, A., Gordon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+cell-to-cell+variation+in+a+cell-fate+decision+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulated cell-to-cell variation in a cell-fate decision system.</a> Nature. 437 (7059), 699-706 (2005).</li>
<li>Acar, M., Becskei, A., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+cellular+memory+by+reducing+stochastic+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Enhancement of cellular memory by reducing stochastic transitions.</a> Nature. 435 (7039), 228-232 (2005).</li>
<li>Pelet, S., Rudolf, F., Nadal-Ribelles, M., de Nadal, E., Posas, F., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+activation+of+the+HOG+MAPK+pathway+regulates+bimodal+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transient activation of the HOG MAPK pathway regulates bimodal gene expression.</a> Science. 332 (6030), 732-735 (2011).</li>
<li>de Nadal, E., Casadome, L., Posas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+MEF2-like+transcription+factor+Smp1+by+the+stress-activated+Hog1+mitogen-activated+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Targeting the MEF2-like transcription factor Smp1 by the stress-activated Hog1 mitogen-activated protein kinase.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (1), 229-237 (2003).</li>
<li>Elowitz, M. B., Levine, A. J., Siggia, E. D., Swain, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+gene+expression+in+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stochastic gene expression in a single cell.</a> Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).</li>
<li>Pelet, S., Dechant, R., Lee, S. S., van Drogen, F., Peter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+image+analysis+platform+to+quantify+signal+transduction+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+biology+%3A+quantitative+biosciences+from+nano+to+macro%22%5BJournal%5D)">An integrated image analysis platform to quantify signal transduction in single cells.</a> Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4 (10), 1274-1282 (2012).</li>
<li>Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome biology. 7 (10), R100(2006).</li>
<li>Chernomoretz, A., Bush, A., Yu, R., Gordon, A., Colman-Lerner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Cell-ID+1.4+with+R+for+microscope-based+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Using Cell-ID 1.4 with R for microscope-based cytometry.</a> Current protocols in molecular biology. Chapter 14, Unit 14.18(2008).</li>
<li>Dimopoulos, S., Mayer, C., Rudolf, F., Stelling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+Single+Cell+Segmentation+in+a+Variety+of+Microscopy+Images%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Automatic Single Cell Segmentation in a Variety of Microscopy Images.</a> Current protocols in molecular biology. , (2012).</li>
<li>Miyawaki, A., Nagai, T., Mizuno, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+protein+fluorophore+formation+and+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of protein fluorophore formation and engineering.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 7 (5), 557-562 (2003).</li>
<li>Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+processing+by+the+HOG+MAP+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Signal processing by the HOG MAP kinase pathway.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (20), 7165-7170 (2008).</li>
<li>Pepperkok, R., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+fluorescence+microscopy+for+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput fluorescence microscopy for systems biology.</a> Nature reviews Molecular cell biology. 7 (9), 690-696 (2006).</li>
</ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

מיקרוסקופית הטיפול בהיטב עם ConA הוא צעד חיוני כדי להבטיח הדמיה תקינה של התאים. בגלל ConA יש מסיסות נמוכה ב PBS (5 מ&quot;ג / מיליליטר), תהליך הסינון מאפשר הסרת אגרגטים גדולים שנמצאים בפתרון מסונן ולהפריע להדמיה. תאים לצרף יחסית חזק אל פני השטח טופל והתוספת של פתרון גרימת לא צריכה להפריע ללוקליזציה של התאים, המאפשרת מעקב רציף לפני ואחרי הגירוי. טיפול זה יכול להיות מיושם גם לזרום ערוצים או מכשירי microfluidic היו התא...

איתות באמצעות מפלי התמרה לעתים קרובות מגיע לשיאו בביטוי של חלבונים. אפיון פרופיל ביטוי זה הוא מרכיב מפתח בהבנת התפקיד של מסלולים ביולוגיים. זיהוי של הספקטרום של חלבונים והדינמיקה של ההפעלה שלהם מוסדר עד יכול להיות מושגת על ידי טכניקות שונות, כגון מיקרו מערכים, כתמים הצפוניים או כתמים מערביים 1-3. עם זאת, טכניקות אלו הן בממוצע התגובה של אוכלוסייה שלמה של תאים. כדי להבין את הרגולציה הקנס של הביטוי של חלבונים, רצוי לאסוף מדידות ברמת התא בודדת. באופן אידיאלי, מדידות אלה אמורות גם לספק נתונים כמותיים נוחים לפתח מודלים מתמטיים של המסלול הבסיסי. מיקרוסקופית וcytometry זרימה הן שתי טכניקות, שמתאימים באופן אידיאלי כדי לספק מדידות תא כזה כמותית אחת. תיוג אנדוגני של חלבונים בחלבון פלואורסצנטי יכול bדואר משמש לכמת רמת הביטוי שלהם 4. עם זאת, מאחר שהתוספת של מחצית ניאון גדולה בתחנה הסופית של החלבון יכולה להבהיר את זה שאינו פונקציונלי, הוא לעתים קרובות רצוי יותר כדי ליצור כתבי ביטוי ספציפיים המבוססים על אמרגן הנהיגה הביטוי למבנה ניאון. חלבון הכתב הזה הוא חיצוני למערכת הסלולרית, ולכן אינו משפיע על אירועי איתות המתרחשים בתא. מיקרוסקופיה וcytometry זרימה שניהם הייתה בשימוש נרחב בתחום איתות השמרים. כדוגמאות; קולמן-לרנר ועמיתים לעבודה מתואמת, בתאים בודדים, הביטוי של הזדווגות כתבים ספציפיים והביעו constitutively על ידי מיקרוסקופ לכמת את הרעש במפל הולכים אותות שמרי הזדווגות 5, Acar ועמיתיו השתמשו cytometry זרימה ללמוד את רשת הרגולציה שליטה על הביטוי של גנים GAL 6. במחקר קודם 7, השתמשנו combinatiבשתי הטכניקות הללו כדי ללמוד את פלט הביטוי מגליצרול osmolarity הגבוה המסלול (HOG) בניצני שמרים. מסלול קינאז חלבון זה mitogen הופעל (MAPK) מופעל על ידי מתח Hyper-האוסמוטי. התוצאה הוא ההפעלה של Hog1 MAPK, אשר translocates לגרעין התא כדי לגרום לתכנית תעתיק וכתוצאה מכך הביטוי של בערך 300 גנים. ללמוד את התהליך הזה, היינו לנו מהונדס כתב ביטוי המבוסס על אמרגן STL1 (גן המושרה באופן ספציפי בתגובה לפעילות Hog1 8) נהיגה הביטוי של חלבון מרובע ונוס ניאון (עמ &#39;STL1-ע&quot;ע). Cytometry זרימת מדידות חשפו את נוכחותם של שתי אוכלוסיות של תאים ברמה בינונית מתח (0.1 M NaCl) עם רק חלק קטן מהאוכלוסייה המבטאת את כתב הניאון. אנחנו השתמשנו במיקרוסקופ כדי לחקור את ההתנהגות הזאת עוד יותר וגילינו שהרעש הזה בביטוי חלבון היה נשלטת על ידי גורמים פנימיים 9. אנחנו could להתבונן עוד כי תאים עם רמה דומה של פעילות Hog1 יכולים להציג תוצאות ביטוי שונות לחלוטין. השילוב של שתי טכניקות אלה אפשר לנו להדגים כיצד שיפוץ האיטי של גנים תגובת לחץ השפיע על תוצאת הביטוי ברמת התא הבודד 7. במאמר זה, אנו משתמשים בביטוי של כתב STL1-ע&quot;ע עמ &#39;הנגרם על ידי הלם Hyper-האוסמוטי כדוגמא לכימות של ביטוי חלבון על ידי מיקרוסקופ וcytometry זרימה. אותו הזן נתון 0.2 מתח M NaCl נחקר בשני הטכניקות. זה יאפשר לנו להדגיש כמה הבדלים עיקריים בשתי טכניקות משלימות מאוד אלה.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><חזק>ריאגנט</חזק></td></tr><tr><td>שמרים בסיס חנקן</td><td>ForMedium</td><td>CYN6202</td><td></td></tr><tr><td>תערובת חומצות אמינו CSM</td><td>ForMedium</td><td>DCS0011</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0450-01</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Fluka Aldrich Sigma</td><td>C7698</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>ySP9</td><td></td><td></td><td>W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus</td></tr><tr><td>pSP34</td><td></td><td></td><td>pRS305 pSTL1 (-800 -0) - מרובע V enus</td></tr><tr><td colspan="4"><חזק>חומר</חזק></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Nikon</td><td>Ti-Eclipse</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת בקרת מיקרוסקופ</td><td>Micro-manager</td><td>Ver 1.4.11</td><td></td></tr><tr><td>תא דגירה</td><td>LIS</td><td>התיבה</td><td></td></tr><tr><td>אור פלואורסצנטי מקור</td><td>Lumencor</td><td>SpectraX</td><td></td></tr><tr><td>מצלמה</td><td>Hamamatsu</td><td>פלאש 4.0</td><td></td></tr><tr><td>זרימה ציטומטר</td><td>BD</td><td>FACS קליבר</td><td></td></tr><tr><td>סוניקטור אמבט</td><td>טלסוניק</td><td>TUC-150</td><td></td></tr><tr><td>8 בארות שקופיות </td><td>Thermo Lab-tek</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>96 בארות</td><td>מדעי ביולוגי מטריקאלי</td><td>MGB096-1-2-LG</td><td></td></tr><tr><td>FACS שפופרת</td><td>BD פלקון</td><td>352054</td><td></td></tr></tbody></table>

כימות זמניות של ביטוי mapk מושרה בתאי שמרים יחיד

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

כימות של ביטוי גנים ברמת התא הבודד חושפת מנגנוני ויסות רומן מטושטשים במדידות שבוצעו ברמת האוכלוסייה. שתי שיטות מבוססות על מיקרוסקופיה וcytometry זרימה מוצגות כדי להדגים כיצד ניתן לרכוש נתונים כאלה. הביטוי של כתב ניאון המושרה על שפעול מסלול MAPK גליצרול הגבוה osmolarity בשמרים משמש כדוגמא. היתרונות הספציפיים של כל שיטה מודגשים. Cytometry זרימה מודד מספר גדול של תאים (10,000) ומספק מדידה ישירה של הדינמיקה של ביטוי החלבון העצמאי של קינטיקה ההבשלה האיטית של חלבון פלואורסצנטי. הדמיה של תאי חיים על ידי מיקרוסקופ היא לעומת מוגבל למדידה של הטופס התבגר של הכתב בפחות תאים. עם זאת, ערכות נתונים שנוצרו על ידי טכניקה זו יכולה להיות עשיר מאוד הודות לשילובים של כתבים רבים ולמידע המרחב ובזמןהמתקבל מהתאים בודדים. שילוב של שתי שיטות מדידה אלה יכולים לספק תובנות חדשות על הרגולציה של ביטוי חלבון על ידי איתות מסלולים.

מיקרוסקופית תאי שמרים הנושאים את כתב ביטוי p STL1-ע&quot;ע (7 ySP9) הוצמדו לחלק התחתון של השקופית היטב והניחו מתחת למיקרוסקופ. התאים היו מגורה על ידי התוספת של מדיום מתח ישירות לתוך הבאר במהלך פגישת ההדמיה. זה מאפשר לנו לרכוש כמה תמונות של התאים לפני גיוס מסלול ובצעו את גורלם לאחר הגירוי. במקרה הנוכחי, התאים היו במעקב במשך ~ שעה 2 עם מרווח של 10 דקות זמן. איור 1A הוא דימוי של תאי...

שתי שיטות משלימות המבוססות על הזרימה cytometry ומיקרוסקופיה מוצגות המאפשרות כימות, ברמת התא הבודד, של הדינמיקה של ביטוי גנים הנגרמת על ידי ההפעלה של מסלול MAPK בשמרים.

כימות זמניות של ביטוי MAPK מושרה בתאי שמרים יחיד

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לכמת את ביטוי חלבוני מפעילים של מיטוגן ברמת התא הבודד. כדי להשיג זאת, נוצר זן שמרים הנושא את המדווח הפלואורסצנטי quadruple Venus, הנשלט על ידי מקדם STL1 וספציפי להפעלתו של ה-map kinase מסוג hog1. ניתן לכמת את ביטוי החלבון הפלואורסצנטי באמצעות בדיקת מיקרוסקופיה של תאים חיים, שבה התאים מעוכבים ישירות על המיקרוסקופ כדי לאפשר צפייה בזמן אמת בהופעת הפלואורסצנציה, או באמצעות ציטומטריה זרימה, שבה התאים מעוכבים בתוך מיקרו-מבחנה וסינתזת החלבון נחסמת בנקודת זמן נתונה.באמצעות הוספה של cyclo heide, ניתן לנתח רק מספר קטן של תאים בכל פעם באמצעות מיקרוסקופיה של תאים חיים, אך ניתן לצפות ישירות בגורלם של התאים הבודדים ולהצליב זאת עם תכונות תאיות אחרות. מנגד, ציטומטריה של זרימה מאפשרת להעריך ביטוי של חלבונים מופעלים על ידי מיטוגן במספר רב של תאים בו-זמנית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום השליחויות, כגון אילו חלבונים מעורבים בבקרת ביטוי גנים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי נתיב השמרים, ניתן להחיל אותה גם על רצפי שליחויות אחרים, בהתאם לזמינות של Reporter ביטוי מתאים.כדי להכין את התאים למיקרוסקופיה של תאים חיים, התחילו בהסכמה של חמישה מיליליטר של מצע סינתטי עם שמרים, ולאחר מכן גדלו את התאים בטמפרטורה של 30 °C למשך הלילה. למחרת בבוקר, מדדו את ה-OD 600 של תרבית הלילה, ולאחר מכן דללו את תרבית הלילה בחמישה מיליליטר של מצע סינתטי עד ל-OD 600 של 0.05. גדלו את התרבית המדוללת בטמפרטורה של 30 °C למשך ארבע שעות נוספות לפחות.בשלב הבא, סננו כ-200 µL של תמיסת קונוולנט שהוכנה טריס לתוך השקופית בעלת הבארות. לאחר 30 דקות, הסירו את תמיסת הקונוולנט והוסיפו 150 µL של מים לבאר. כעת הסירו את המים והניחו לבאר להתייבש בזמן שהתאים מוכנים.מדוד שוב את ה-OD 600 של תרבית התאים, ולאחר מכן דלל את התאים כדי לקבל 300 µL של תרבית תאים ב-OD 600 של 0.02 בתוך מיקרו-מבחנה של 1.5 mL. בצע סוניקציה לתאים באמבט מים למשך 45 שניות. סובב את המיקרו-מבחנות במהירות באמצעות וורטקס, ולאחר מכן בצע סוניקציה וסחרור בוורטקס לתאים פעם נוספת.כעת העבירו 200 µL מהתאים לסרטן הבארות, ולאחר שהתאים ישקעו לתחתית הבאר במשך כ-30 דקות, הניחו את הסרטן על המיקרוסקופ. לאחר מכן, בחרו את הגדרות התאורה עבור הערוץ הפלואורסצנטי שיוקלט ועבור שתי תמונות בשדה בהיר (bright field), כאשר אחת מהגדרות השדה הבהיר תכוון לכ-3 µm מתחת למישור המוקד כדי לאפשר סגמנטציה תקינה של התאים. לאחר מכן, קבעו את מרווחי הזמן עבור מדידות ה-time lapse ובחרו את שדות הראייה לצילום.כעת התחילו את הרכישה למספר פריימים ולאחר מכן השהו את הרכישה כדי להוסיף 100 µL של מצע sodium chloride בריכוז 0.6 molar שהוכן טרי, והמשיכו בדימות כדי להכין את התאים למדידה באמצעות flow cytometry. התחילו על ידי חידל של השמרים בחמישה milliliters של מצע סינתטי וגדלו את התאים למשך לילה בטמפרטורה של 30 °C. למחרת בבוקר, מדדו את ה-OD 600 של תרבית הלילה ולאחר מכן דללו את תרחיף התאים בחמישה milliliters של מצע סינתטי עד ל-OD 600 של 0.1.גדלו את התרבית למשך ארבע שעות לפחות בטמפרטורה של 30 °C עד להשגת OD 600 של 0.2 עד 0.4. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של נתרן כלורי 0.6 M שהוכן טרי לפקעת מיקרו (micro tube) של 1.5 mL עבור כל נקודת זמן המיועדת למדידה בזמן אפס. הוסיפו 200 µL של תאים לכל פקעת מיקרו והדגירו את התרביות עם ניעור בטמפרטורה של 30 °C.לאחר מכן, בכל אחת מנקודות הזמן הניסיוניות, הוסיפו 30 µL של cyclo heximide שהוכן טרי לאחד המיקרו-מבחנות. בזמן שהמיקרו-מבחנות נמצאות בדגירה, הוסיפו 400 µL של PBS למבחנת fax תואמת עבור כל מיקרו-מבחנה. לאחר הדגירה, ערבבו קצרה את המיקרו-מבחנות באמצעות וורטקס, ולאחר מכן בצעו סוניקציה לתאים בתוך אמבט מים למשך דקה אחת, כפי שהודגם כעת.לאחר מכן, העבירו 100 µL מתרבית תאים מכל מיקרו-מבחנה למבחנת ה-fax המתאימה בציטומטר הזרימה. טענו את הגדרות העירור והגילוי המתאימות ובחנו את הדגימות שאינן מבטאות ואת הדגימות המבטאות באופן מלא כדי לוודא שהן נמצאות בטווח הרגישות של הגלאי. לבסוף, מדדו 10,000 תאים עבור כל דגימה בתמונות אלה, כאשר תאי שמרים הנושאים את חלבון הדיווח על ביטוי quadruple venous תחת בקרת ה-TL one promoter ומוצמדים לתחתית של משטח בארות, עוררו על ידי הוספה ישירה של מצע עקה.כפי שהודגם זה עתה, התאים נוטרו במשך כשעתיים במרווחי זמן של 10 דקות, ותמונות נרכשו הן לפני והן אחרי הוספת הגירוי. שימו לב לביטוי הפלואורסצנטי של הדיווח במהלך פעילות התאים. כדי להפיק את המידע הכמותי הכלול בתמונות אלו, יש לבצע כאן תהליך מורכב של ניתוח תמונות.התוצאות שהתקבלו באמצעות פלטפורמת ניתוח הכמות של השמרים מוצגות כאן. כל עקבה אדומה מייצגת את ההתפתחות הזמנית של עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת של תא בודד. הקו הכחול ממחיש את החציון של למעלה מ-500 תאים שסוגמנטו ועוקבו לאורך 20 פריימים של חמישה סרטוני Time-lapse שנרכשו מחמישה שדות ראייה שונים מאותה באר; האזור בצבע תכלת מייצג את האחוזון ה-25 וה-75 של כל העוצמות שנמדדו בנקודת זמן נתונה. כדי לבחון את דינמיקת הביטוי של אותו רפורטר באמצעות ציטומטריית זרימה, הוסף Cycloheximide לתרביות תאי השמרים בנקודות זמן שונות במרווחים של 5 עד 10 דקות.התרופה חוסמת את הסינתזה של חלבונים חדשים, אך הבשלת החלבון הפלואורסצנטי שכבר התבטא אינה נפגעת. לכן, ניתן לכמת את ביטוי החלבון המדגמי, הנראה כהזזה של ההיסטוגרמה ימינה, במועד הוספת ה-Cycl H, ובכך לעקוף את הבעיות הקשורות להבשלת החלבון הפלואורסצנטי. בגרף זה מושווים הדינמיקה של חלבון הדגש לביטוי כפי שנמדדה במיקרוסקופיה או בציטומטריה של זרימה; בעוד שהאות הפלואורסצנטי עולה 30 עד 40 דקות לאחר הוספת מצע העקה כפי שנמדד במיקרוסקופיה, מדידות הציטומטריה של זרימה מצביעות בבירור על כך שהחלבונים כבר יוצרו בין 10 ל-15 דקות לאחר הגירוי, מה שמעיד על ההבשלה האיטית של החלבונים הפלואורסצנטיים.שתי הטכניקות מאפשרות גישה למידע על תא בודד עבור ניסויים פשוטים אלו; השונות בין שלושה חזרות ביולוגיות היא קטנה בהשוואה לשונות הגדולה שנצפתה בתגובות של תאים בודדים באמצעות מיקרוסקופיה או ציטומטריית זרימה. בעקבות נהלים אלו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מדידות תגובה אלו, כדי לענות על שאלות נוספות, למשל, מהו סף הביטוי הגני. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן מדידת ביטוי חלבון ברמת התא הבודד באמצעות מיקרוסקופ או ציטומטריית זרימה.

temporal-quantification-mapk-induced-expression-single-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

טכניקה מהירה להדמיה של גידול בתאי שמרים משותקת, מיושם כאן לכתבים פלורסנט בבית לוקוסים שקט ההזדווגות HML ו...

טכניקה מהירה עבור ויזואליזציה של תאים חיים שמרים ללא יכולת לזוז

הזדקנות בשמרים כרונולוגית מתייחס לאובדן של כדאיות התא הקשורים זמן בשלב נייח. כאן אנו מתארים את שיטת תפוקה גבוהה עבור כמותית בקביעת תוחלת החיים בשמרים כרונולוגי.

כימות כרונולוגי שמרים תוחלת החיים על ידי תולדה של תאים בני

סריג מבוססי הכתבים משמשים יותר ויותר לעקוב אחר פעילות קינאז ו phosphatase בתאים חיים. כאן אנו מתארים שיטה כיצד להשתמש סריג מבוססי עיתונאים כדי להעריך את מחזור התא תלויות שינויים זירחון היעד.

ניטור פעילות קינאז ו phosphatase דרך מחזור התא על ידי Ratiometric סריג

כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

פרוטוקול זה מתאר הליך ניסיוני לביצוע...

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

אנו מציגים פרוטוקול פשוט להשיג סרטי הקרינה מיקרוסקופיה של תאי שמרים גדלו, וחבילת תוכנה מבוססת GUI כדי לחלץ את נתוני זמן סדרת תא בודד. הניתוח כולל שושלת אוטומטית והקצאת זמן החלוקה משולבת עם בדיקה חזותית ואוצרות ידני של נתונים מסומנים.

רכישת זמן לשגות סרטים הקרינה של שמרים להנץ וניתוח Dynamics תא בודד באמצעות שתלי

שמרי הביקוע, שמר החלוקה היא מערכת מודל מצוינת ללמוד cytokinesis, השלב הסופי חלוקת תא. כאן אנו מתארים גישה מיקרוסקופ לנתח אירועים cytokinetic שונים בתאי שמרים ביקוע חי.

ניתוח Spatiotemporal של אירועים Cytokinetic שמרים ביקוע

כאן, אנו מציגים פרוטוקול בעזרת RNA-seq לנטר את רמות ה-mRNA לאורך זמן במהלך התגובה שתקבעו של cerevisiae ס תאים. בשיטה זו ניתן להתאים לנתח ביטוי גנים במהלך כל תגובה תאית.

מדידת רמות ה-mRNA לאורך זמן במהלך שמרים ס' cerevisiae ובשפתיים התגובה

הפרוטוקול המתואר כאן מבוסס על כימות ברמת הגנום של mRNA החדש מסונתז מטוהרים מתאי שמרים עם 4-thiouracil תוויות. שיטה זו מאפשרת למדוד את סינתזת mRNA חשיפות מהשחתה mRNA ומספק, לפיכך, מדידה מדויקת של RNA פולימראז II שעתוק.

שמר האפייה מטבולית תיוג עם 4-thiouracil, כימות של לאחרונה מסונתז mRNA כמדד לפעילות RNA פולימראז II

מיקרוסקופיה בהילוך מהיר היא כלי רב ערך לחקר מיוזה בשמרים ניצנים. פרוטוקול זה מתאר שיטה המשלבת סנכרון מחזור התא, מיקרוסקופיה בהילוך מהיר ודלדול מותנה של חלבון מטרה כדי להדגים כיצד לחקור את תפקודו של חלבון מסוים במהלך הפרדת כרומוזומים מיוטיים.

שימוש במיקרוסקופיה של קיטועי זמן ודלדול גרעיני ספציפי לשלב של חלבונים כדי לחקור מיוזה ב- S. cerevisiae

פרוטוקול זה מפרט שתי שיטות לעצירת מחזור תאי שמרים ושחרור אופציונלי, ומרחיב על השימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית לחקר תהליכים תלויי מחזור תא ב-S. cerevisiae.

מניפולציה וניתוח של תהליכים תלויי מחזור התא בשמרים ניצנים

חקור כימות ביטוי MAPK ברמת תא בודד בשמרים באמצעות מיקרוסקופיה וציטומטריית זרימה. שיטות אלו מאפשרות ניתוח דינמיקת ביטוי גנים בזמן אמת ומספקות תובנות לגבי מסלולי שידור אותות תאיים.

כימות זמניות של ביטוי MAPK מושרה בתאי שמרים יחיד

גלה סרטונים נוספים