כימות זמניות של ביטוי MAPK מושרה בתאי שמרים יחיד

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לכמת את ביטוי החלבון המופעל על ידי מיטוגן ברמת התא הבודד. כדי להשיג זאת, נוצר זן שמרים הנושא את מדווח הביטוי הפלואורסצנטי הרביעי ונוס הנשלט על ידי מקדם STL אחד וספציפי להפעלת החזיר קינאז מפה אחת. ניתן לכמת ביטוי חלבון פלואורסצנטי על ידי בדיקת מיקרוסקופ תא חי שבה התאים נלחצים ישירות על המיקרוסקופ כדי להקל על הופעה בזמן אמת של הקרינה או על ידי ציטומטריית זרימה, ובמקרה זה התאים נלחצים במיקרו צינור וסינתזת החלבון נחסמת בזמן נתון.

על ידי תוספת של cyclo heide, ניתן לנתח רק כמה תאים בכל פעם באמצעות מיקרוסקופ תאים חיים, אך ניתן לצפות ישירות בגורל התאים הבודדים ולתאם אותו עם ציטומטריית זרימת תכונות תאיות אחרות מצד שני, מאפשרת גם הערכה של ביטוי חלבון המופעל על ידי מיטוגן על מספר רב של תאים בבת אחת. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האיתות, כגון אילו חלבונים מעורבים בוויסות ביטוי הגנים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מסלול השמרים, ניתן ליישם אותה גם על מפל איתות אחר בהתאם לזמינות הביטוי המתאים. כתב.

כדי להכין את התאים למיקרוסקופ תאים חיים, התחל בחיסון חמישה מיליליטר של מדיום סינתטי בשמרים ולאחר מכן גדל את התאים ב-30 מעלות צלזיוס בן לילה. למחרת בבוקר, מדדו את ה-OD 600 של תרבית הלילה ולאחר מכן דללו את תרבית הלילה בחמישה מיליליטר של מדיום סינטטי ל-OD 600 של 0.05. מגדלים את התרבית המדוללת בחום של 30 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות נוספות לפחות.

לאחר מכן, סנן כ -200 מיקרוליטר של קונה-וולנט טרי שהוכן תמיסה למגלשת הבאר. לאחר 30 דקות, הסר את התמיסה והוסף 150 מיקרוליטר מים לבאר. כעת הסר את המים ותן לבאר להתייבש בזמן הכנת התאים.

מדוד שוב את ה-OD 600 של תרבית התאים, ולאחר מכן דלל את התאים לקבלת 300 מיקרוליטר של תרבית תאים ב-OD 600 של 0.02 וצינור מיקרו של 1.5 מיליליטר. סוניקציה של התאים באמבט מים למשך 45 שניות. מערבל לזמן קצר את צינורות המיקרו ואז סוניקט ומערבל שוב את התאים.

כעת הוסיפו 200 מיקרוליטר מהתאים למגלשת הבאר, ולאחר מכן לאחר שנתנו לתא להתיישב בתחתית הבאר למשך כ-30 דקות, הניחו את השקף על המיקרוסקופ. לאחר מכן, בחר את הגדרות התאורה עבור ערוץ הפלואורסצנט שלהם שיש להקליט ועבור שתי תמונות שדה בהיר, התאם את אחת מהגדרות השדה הבהיר כשלושה מיקרון מתחת למישור המוקד כדי לאפשר פילוח תאים נכון. לאחר מכן הגדר את מרווחי הזמן עבור מדידות הזמן ובחר את שדות הראייה להדמיה.

כעת התחל את הרכישה לכמה פריימים ולאחר מכן השהה את הרכישה כדי להוסיף 100 מיקרוליטר של מדיום נתרן כלורי טרי שהוכן לאחרונה, והמשך את ההדמיה כדי להכין את התאים למדידה על ידי ציטומטריית זרימה. התחל בחיסון השמרים בחמישה מיליליטר של מדיום סינטטי וגדל את התאים למשך הלילה ב -30 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, מדוד את ה-OD 600 של תרבית הלילה ולאחר מכן דלל את תרחיף התאים בחמישה מיליליטר של מדיום סינטטי ל-OD 600 של 0.1.

גדל את התרבית לפחות ארבע שעות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס כדי להגיע ל-OD 600 של 0.2 עד 0.4. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של נתרן כלורי טרי של 0.6 מולארי לצינור מיקרו של 1.5 מיליליטר עבור כל נקודת זמן שתימדד בזמן אפס. הוסף 200 מיקרוליטר תאים לכל צינור מיקרו ודגר את התרביות בניעור ב -30 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, בכל אחת מנקודות הזמן של הניסוי, הוסף 30 מיקרוליטר של ציקלו היידה טרי שהוכן לאחד מצינורות המיקרו. בזמן שהמיקרו צינורות מודגרים, הוסף 400 מיקרוליטר PBS לצינור פקס מתאים אחד לכל מיקרו שפופרת. לאחר הדגירה, מערבל לזמן קצר את צינורות המיקרו ולאחר מכן סוניקציה של התאים והוסף אמבט מים למשך דקה אחת כפי שהודגם זה עתה.

לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של תרבית תאים מכל צינור מיקרו לצינור הפקס המתאים לו בזרימת הציטומטר. טען את הגדרות העירור והזיהוי המתאימות ובדוק את הדגימות שאינן מבטאות ומבטאות במלואן כדי לוודא שהן נופלות בטווח הרגישות של הגלאי. לבסוף, מדדו 10,000 תאים עבור כל דגימה בתמונות אלה, תאי שמרים הנושאים את החלבון הוורידי המרובע המדווח על הביטוי תחת שליטת מקדם TL אחד ומחוברים לתחתית שקופית באר עוררו על ידי מהדורה ישירה של מדיום הלחץ.

כפי שהודגם זה עתה, התאים נוטרו במשך כשעתיים במרווחים של 10 דקות, והתמונות נרכשו לפני ואחרי המהדורה של הגירוי. שימו לב, הביטוי הפלואורסצנטי של הדוח במהלך התאים המופעלים. כדי לחלץ את המידע הכמותי הכלול בתמונות אלה, יש לבצע כאן תהליך ניתוח תמונה מורכב.

התוצאה שהתקבלה עם פלטפורמת הניתוח הכמותי של השמרים מוצגת. כל עקבה אדומה מייצגת את ההתפתחות הזמנית של עוצמת הקרינה הממוצעת של תא בודד. הקו הכחול ממחיש את החציון של יותר מ-500 תאים שחולקו ועקבו אחריהם לאורך 20 פריימים של חמישה סרטי זמן-lapse שנרכשו מחמישה שדות ראייה שונים מאותה באר האזור הכחול הבהיר מייצג את האחוזון ה-25 וה-75 של כל העוצמות שנמדדו בנקודת זמן נתונה כדי לחקור את הדינמיקה של הביטוי של אותו מדווח על ידי ציטומטריית זרימה ציקלוהקסימיד נוסף לשמרים תרביות תאים בנקודות זמן שונות במרווחים של חמש עד 10 דקות.

התרופה חוסמת את הסינתזה של חלבונים חדשים, אך הבשלת החלבון הפלואורסצנטי שכבר בא לידי ביטוי אינה מופרעת. לכן, ניתן לכמת את ביטוי החלבון המוצג על ידי תזוזה של ההיסטוגרמה ימינה בזמן מהדורת Cycle H תוך עקיפת הבעיות הקשורות להבשלת חלבון פלואורסצנטי. בגרף זה, הדינמיקה של מדווח הביטוי כפי שנמדדה על ידי מיקרוסקופיה או ציטומטריית זרימה מושווה בעוד שהאות הפלואורסצנטי עולה 30 עד 40 דקות לאחר המהדורה של מדיום הלחץ כפי שנמדד על ידי המיקרוסקופיה, מדידות ציטומטריית הזרימה מצביעות בבירור על כך שהחלבונים כבר מיוצרים בין 10 ל-15 דקות לאחר הגירוי המדגים את ההתבגרות האיטית של החלבונים הפלואורסצנטיים.

שתי הטכניקות מאפשרות גישה למידע על תא בודד עבור ניסויים פשוטים אלה, השונות בין שלושה שכפולים ביולוגיים קטנה בהשוואה לשונות הגדולה שנצפתה בתגובות התא הבודד על ידי מיקרוסקופיה או ציטומטריית זרימה. בעקבות הליכים אלה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מדידות תגובה אלה על מנת לענות על שאלות נוספות כגון, מהו הסף לביטוי גנים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד ביטוי חלבון ברמת תא בודד באמצעות מיקרוסקופ של ציטומטריית זרימה.