כימות זמניות של ביטוי MAPK מושרה בתאי שמרים יחיד

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לכמת את ביטוי חלבוני מפעילים של מיטוגן ברמת התא הבודד. כדי להשיג זאת, נוצר זן שמרים הנושא את המדווח הפלואורסצנטי quadruple Venus, הנשלט על ידי מקדם STL1 וספציפי להפעלתו של ה-map kinase מסוג hog1. ניתן לכמת את ביטוי החלבון הפלואורסצנטי באמצעות בדיקת מיקרוסקופיה של תאים חיים, שבה התאים מעוכבים ישירות על המיקרוסקופ כדי לאפשר צפייה בזמן אמת בהופעת הפלואורסצנציה, או באמצעות ציטומטריה זרימה, שבה התאים מעוכבים בתוך מיקרו-מבחנה וסינתזת החלבון נחסמת בנקודת זמן נתונה.

באמצעות הוספה של cyclo heide, ניתן לנתח רק מספר קטן של תאים בכל פעם באמצעות מיקרוסקופיה של תאים חיים, אך ניתן לצפות ישירות בגורלם של התאים הבודדים ולהצליב זאת עם תכונות תאיות אחרות. מנגד, ציטומטריה של זרימה מאפשרת להעריך ביטוי של חלבונים מופעלים על ידי מיטוגן במספר רב של תאים בו-זמנית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום השליחויות, כגון אילו חלבונים מעורבים בבקרת ביטוי גנים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי נתיב השמרים, ניתן להחיל אותה גם על רצפי שליחויות אחרים, בהתאם לזמינות של Reporter ביטוי מתאים.

כדי להכין את התאים למיקרוסקופיה של תאים חיים, התחילו בהסכמה של חמישה מיליליטר של מצע סינתטי עם שמרים, ולאחר מכן גדלו את התאים בטמפרטורה של 30 °C למשך הלילה. למחרת בבוקר, מדדו את ה-OD 600 של תרבית הלילה, ולאחר מכן דללו את תרבית הלילה בחמישה מיליליטר של מצע סינתטי עד ל-OD 600 של 0.05. גדלו את התרבית המדוללת בטמפרטורה של 30 °C למשך ארבע שעות נוספות לפחות.

בשלב הבא, סננו כ-200 µL של תמיסת קונוולנט שהוכנה טריס לתוך השקופית בעלת הבארות. לאחר 30 דקות, הסירו את תמיסת הקונוולנט והוסיפו 150 µL של מים לבאר. כעת הסירו את המים והניחו לבאר להתייבש בזמן שהתאים מוכנים.

מדוד שוב את ה-OD 600 של תרבית התאים, ולאחר מכן דלל את התאים כדי לקבל 300 µL של תרבית תאים ב-OD 600 של 0.02 בתוך מיקרו-מבחנה של 1.5 mL. בצע סוניקציה לתאים באמבט מים למשך 45 שניות. סובב את המיקרו-מבחנות במהירות באמצעות וורטקס, ולאחר מכן בצע סוניקציה וסחרור בוורטקס לתאים פעם נוספת.

כעת העבירו 200 µL מהתאים לסרטן הבארות, ולאחר שהתאים ישקעו לתחתית הבאר במשך כ-30 דקות, הניחו את הסרטן על המיקרוסקופ. לאחר מכן, בחרו את הגדרות התאורה עבור הערוץ הפלואורסצנטי שיוקלט ועבור שתי תמונות בשדה בהיר (bright field), כאשר אחת מהגדרות השדה הבהיר תכוון לכ-3 µm מתחת למישור המוקד כדי לאפשר סגמנטציה תקינה של התאים. לאחר מכן, קבעו את מרווחי הזמן עבור מדידות ה-time lapse ובחרו את שדות הראייה לצילום.

כעת התחילו את הרכישה למספר פריימים ולאחר מכן השהו את הרכישה כדי להוסיף 100 µL של מצע sodium chloride בריכוז 0.6 molar שהוכן טרי, והמשיכו בדימות כדי להכין את התאים למדידה באמצעות flow cytometry. התחילו על ידי חידל של השמרים בחמישה milliliters של מצע סינתטי וגדלו את התאים למשך לילה בטמפרטורה של 30 °C. למחרת בבוקר, מדדו את ה-OD 600 של תרבית הלילה ולאחר מכן דללו את תרחיף התאים בחמישה milliliters של מצע סינתטי עד ל-OD 600 של 0.1.

גדלו את התרבית למשך ארבע שעות לפחות בטמפרטורה של 30 °C עד להשגת OD 600 של 0.2 עד 0.4. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של נתרן כלורי 0.6 M שהוכן טרי לפקעת מיקרו (micro tube) של 1.5 mL עבור כל נקודת זמן המיועדת למדידה בזמן אפס. הוסיפו 200 µL של תאים לכל פקעת מיקרו והדגירו את התרביות עם ניעור בטמפרטורה של 30 °C.

לאחר מכן, בכל אחת מנקודות הזמן הניסיוניות, הוסיפו 30 µL של cyclo heximide שהוכן טרי לאחד המיקרו-מבחנות. בזמן שהמיקרו-מבחנות נמצאות בדגירה, הוסיפו 400 µL של PBS למבחנת fax תואמת עבור כל מיקרו-מבחנה. לאחר הדגירה, ערבבו קצרה את המיקרו-מבחנות באמצעות וורטקס, ולאחר מכן בצעו סוניקציה לתאים בתוך אמבט מים למשך דקה אחת, כפי שהודגם כעת.

לאחר מכן, העבירו 100 µL מתרבית תאים מכל מיקרו-מבחנה למבחנת ה-fax המתאימה בציטומטר הזרימה. טענו את הגדרות העירור והגילוי המתאימות ובחנו את הדגימות שאינן מבטאות ואת הדגימות המבטאות באופן מלא כדי לוודא שהן נמצאות בטווח הרגישות של הגלאי. לבסוף, מדדו 10,000 תאים עבור כל דגימה בתמונות אלה, כאשר תאי שמרים הנושאים את חלבון הדיווח על ביטוי quadruple venous תחת בקרת ה-TL one promoter ומוצמדים לתחתית של משטח בארות, עוררו על ידי הוספה ישירה של מצע עקה.

כפי שהודגם זה עתה, התאים נוטרו במשך כשעתיים במרווחי זמן של 10 דקות, ותמונות נרכשו הן לפני והן אחרי הוספת הגירוי. שימו לב לביטוי הפלואורסצנטי של הדיווח במהלך פעילות התאים. כדי להפיק את המידע הכמותי הכלול בתמונות אלו, יש לבצע כאן תהליך מורכב של ניתוח תמונות.

התוצאות שהתקבלו באמצעות פלטפורמת ניתוח הכמות של השמרים מוצגות כאן. כל עקבה אדומה מייצגת את ההתפתחות הזמנית של עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת של תא בודד. הקו הכחול ממחיש את החציון של למעלה מ-500 תאים שסוגמנטו ועוקבו לאורך 20 פריימים של חמישה סרטוני Time-lapse שנרכשו מחמישה שדות ראייה שונים מאותה באר; האזור בצבע תכלת מייצג את האחוזון ה-25 וה-75 של כל העוצמות שנמדדו בנקודת זמן נתונה. כדי לבחון את דינמיקת הביטוי של אותו רפורטר באמצעות ציטומטריית זרימה, הוסף Cycloheximide לתרביות תאי השמרים בנקודות זמן שונות במרווחים של 5 עד 10 דקות.

התרופה חוסמת את הסינתזה של חלבונים חדשים, אך הבשלת החלבון הפלואורסצנטי שכבר התבטא אינה נפגעת. לכן, ניתן לכמת את ביטוי החלבון המדגמי, הנראה כהזזה של ההיסטוגרמה ימינה, במועד הוספת ה-Cycl H, ובכך לעקוף את הבעיות הקשורות להבשלת החלבון הפלואורסצנטי. בגרף זה מושווים הדינמיקה של חלבון הדגש לביטוי כפי שנמדדה במיקרוסקופיה או בציטומטריה של זרימה; בעוד שהאות הפלואורסצנטי עולה 30 עד 40 דקות לאחר הוספת מצע העקה כפי שנמדד במיקרוסקופיה, מדידות הציטומטריה של זרימה מצביעות בבירור על כך שהחלבונים כבר יוצרו בין 10 ל-15 דקות לאחר הגירוי, מה שמעיד על ההבשלה האיטית של החלבונים הפלואורסצנטיים.

שתי הטכניקות מאפשרות גישה למידע על תא בודד עבור ניסויים פשוטים אלו; השונות בין שלושה חזרות ביולוגיות היא קטנה בהשוואה לשונות הגדולה שנצפתה בתגובות של תאים בודדים באמצעות מיקרוסקופיה או ציטומטריית זרימה. בעקבות נהלים אלו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מדידות תגובה אלו, כדי לענות על שאלות נוספות, למשל, מהו סף הביטוי הגני. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן מדידת ביטוי חלבון ברמת התא הבודד באמצעות מיקרוסקופ או ציטומטריית זרימה.