אפיון של אירועים קלציפיקציה שימוש אופטי חיה מיקרוסקופית אלקטרונים טכניקות בתוך ימית תולעת-שפופרת

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את המיקום והמבנה של אירוע ההסתיידות על ידי ביצוע שילוב של שיטות מיקרוסקופיה אופטית ואלקטרונים. זה מושג על ידי ניטור תולעת צינור הזחל החיה במהלך המטמורפוזה, שלב החיים האחראי להסתיידות שניתן לזהות באמצעות אינדיקטורים פלואורסצנטיים הרגישים לאותות pH וסידן תוך תאיים. הדמיית pH תוך-תאית מאפשרת לנו לחקור את ריכוז הפרוטונים לתוך הציטופלזמה ומחוצה לה בתהליך ההסתיידות.

כדי להתחיל, הדמיית pH תוך-תאית בזחלי תולעת הצינור הימי, זחלי השחייה המוסמכים מוכתמים בצבע מחוון ה-pH התוך-תאי, SNARF-1 AM. לאחר מכן הזחלים מועברים לצלחת של IBMX המכילה מי ים עם חלון תצפית זכוכית דק ומונחים על מיקרוסקופ פלואורסצנטי, שם הם נפגעים מאור באורך גל של 488 ננומטר, הנספג על ידי הצבע. נאספות פליטות של 580 ננומטר ו-640 ננומטר מהצבע. ניתן לחשב את ערכי ה- pH התוך תאי מהיחסים בין ערכים אלה.

מיקרוסקופיה אופטית מאפשרת לנו לזהות זמן ואזור רקמה הקשורים לרמת pH גבוהה יותר. זהו הצעד הראשון לקביעת נקודות הזמן המעניינות לניתוח נוסף. בשלב השני, שמור על תולעת הצינור עם מקבעים בנקודות הזמן הרלוונטיות למיקרוסקופ אלקטרונים.

שלב חיים חדש של מינרליזציה מזוהה באמצעות מיפוי SEM-EDS לאות סידן. לאחר מכן האזורים עם אות סידן גבוה נבדקים באמצעות SEM/EBSD, ומזהים נוכחות של מינרל גבישי. לבסוף, באמצעות קרן יונים ממוקדת חותכים את המינרל, מכינים חתך דק לתצפית TEM.

סעיף זה משמש להשגת דפוס עקיפה סלקטיבי של האזור. היתרון העיקרי של טכניקה זו או שיטות בדיקה קונבנציונליות כמו ספקטרוסקופיה של עקיפה של קרני רנטגן בתפזורת הוא בכך שהיא מספקת תצפית ישירה על מבנים ספציפיים שנצפו בשיטות מיקרוסקופיה אופטית ואלקטרונים, ומכאן שניתן ללמוד אירועי הסתיידות בדידים ישירות ברמה הזמנית והמרחבית כאחד. כאשר מסתיידים נחקרים עם סידן ומדדי pH תוך-תאיים, אנו יכולים לזהות את ציר הזמן של אירועים פיזיולוגיים רלוונטיים אלה.

שימור הדגימה בזמן הנכון הוא קריטי לניתוח SEM פורה. כאשר מחפשים את האירוע הראשון של הסתיידות ביולוגית, ניתן להשתמש ב-SEM/EDX כדי לסנן את התפלגות היסודות לסידן. מיקום שיש בו יותר סידן עשוי להצביע על נוכחות של סידן פחמתי, אולם רק נוכחות של דפוס עקיפה של קרני רנטגן יכולה לאשר שיש מבנה גבישי.

ניתן להשיג מידע כזה באמצעות EBSD ו-TEM. עקיפה של פיזור אחורי אלקטרונים היא טכניקת אפיון קריסטלוגרפית לזיהוי חומר גבישי או פולי-גבישי, כל עוד המיקרו-מבנה וזווית ה-REM של האלקטרונים עומדים בתנאי עקיפה של בראג. בדרך כלל, אלקטרונים מפוזרים לאחור נאספים בהטיה של זווית של 70 מעלות על דגימה מלוטשת עם מפות כיוון גרגר או גביש.

עבור מדגם לא מלוטש קשה ליצור מפה כזו ממשטחים לא אחידים אלה, מכיוון שלא כל סדרות השירות עומדות בדרישות זווית EBSD. עם זאת, בצורה של IG נקודתי עדיין ניתן לאסוף דפוס עקיפה של קקוצ'י מהמשטחים הלא אחידים הללו כל עוד דרישת זווית ה-EBSD מתקיימת. דפוס העקיפה של קקוצ'י מספק אישור חד משמעי לכך שהמינרל הגבישי קיים.

השיטה שלנו ישירה ומהירה, וניתן לרמוז עליה לרקמות מינרליזציה אחרות. כאן, קרן יונים ממוקדת משמשת לייצור מיקרו-דגימה, שהיא גם שיטה ישירה מאוד להכנת קטע TEM. כדי לבחון את תהליך המטמורפוזה, תולעי צינור תורבבו במעבדה במשך כחמישה ימים.

הזחלים המוסמכים ישחו בכיוון קדימה במקום בתנועה מעגלית. זה אומר שהם מוכנים למטמורפוזה. דגרו זחלים מוכשרים בתמיסה הפלואורסצנטית במי ים, כסו את המיכלים בנייר כסף כדי למנוע פוטוהלבנה ודגרו על בעלי החיים למשך הלילה.

זחלי תולעי הצינור נשטפים כנגד רשת הניילון שתשמור על הזחלים אך תאפשר לתמיסה לעבור דרכה. שטפו את הזחלים במי ים מסוננים פעמיים כדי להסיר עודפי תמיסת צבע. לחץ את המסננת לצלחת הפטרי כדי ליצור אטימה הדוקה לפני שחרור החותם כדי להשליך את תמיסת הכביסה.

הקפד לא לייבש את הזחלים. לאחר מכן מניחים כל אחד מ -10 עד 20 הזחלים בתבנית תחתית זכוכית דקה עם IBMX ומכסים את המנה עד להדמיה. לאחר מכן, הכנס את קוביות המסנן המתאימות עם המראות הדיכרואיות המתאימות כדי לזהות את האותות הפלואורסצנטיים.

מטב את זמן התריס כך שיהיה מהיר מספיק כדי לצלם תמונות עבור אורגניזם חי. לאחר מכן, בחר את פרמטרי החיתוך האופטיים באפשרות Z-Stack, הזז את השלב המיקרוסקופי למעלה ולמטה כדי להגדיר את מיקום ההתחלה והעצירה של רכישת התמונה. הגדר מרחק של מיקרומטר אחד בין שכבות.

לאחר ההדמיה, ייצא את כל הנתונים כקבצי TIF בגווני אפור. ניתן לבצע זאת על-ידי בחירה באפשרות קובץ, ייצוא. ודא/י שסוגי הקבצים מופיעים כתמונות TIF ולחץ/י על ״התחל״.

התמונה בגווני אפור בכל ערוץ, בכל שכבה של Z-Stack תהיה באותה תיקיית תמונות מוכנה לניתוח תמונה. לבסוף, צור תמונה מורכבת עבור כל אחד מערוצי הפלורסנט, באמצעות ImageJ. סרטוני JoVE הבאים מדגימים כיצד לבצע כיול ומדידות עבור pH תוך-תאי.

שימור תולעי הצינור העוברות מטמורפוזה באמצעות קיבוע צולב, באמצעות תמיסה של 4% פרפורמלדהיד במי ים. כל שעליך לעשות הוא לערבב חלק אחד של 16% פרפורמלדהיד בשלושה חלקים של מי ים ולאפשר לקיבוע להתרחש למשך הלילה. השלך את הקיבוע העיקרי ותקן מחדש את הדגימה למשך 30 דקות בתמיסה מימית של 1% אוסמיום טטרוקסיד כדי לייצב עוד יותר את מבני הרקמה.

הקפידו לעבוד במכסה אדים ולהחזיק בקבוקי פסולת נפרדים המסומנים בבירור, הכינו פורמלדהידים ואוסמיום טטרואוקסיד. לאחר מכן, ייבשו את הדגימות באמצעות סדרת אתנול מדורגת, המאפשרת חמש דקות בין שינויים. השלב הבא הוא לייבש את הדגימות בתמיסה של 1:1 של אתנול ו-HMDS, בדיוק מספיק כדי לכסות את הדגימה.

המתן עד שהדגימה תתאדה יבשה במכסה האדים, ולאחר מכן חזור על ההליך עם HMDS טהור. כדי ליצור שבר מבוקר של הדגימה, הפעל את להב היהלום כנגד הצלחת, וסגור כמה פרטים כדי לבצע חתך משולש. כשצלחת הפטרי מכוסה, מניחים את צלחת התרבות על בדל אלומיניום, לוחצים בעדינות כדי ליצור שבר מבוקר.

התבונן באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה, הרם בזהירות חתיכת שבר המכילה כמה תולעי צינור שלמות. בעזרת צבע כסף, הדביקו את הדגימה למחזיק הדגימה של SEM, צבעו סביב הקצוות בצבע כסף כדי להפחית את הטעינה. הדגימה מוכנה כעת להדמיה לניתוח SEM-EDS.

הכנס את הדגימה במחזיק למיקרוסקופ. כוון את הדגימה והנח את הדגימה מתחת לעמוד האלקטרונים. נתח את המדגם במצב VP SEM.

מטב את המיקוד והאסטיגמציה לפי הצורך. בחר את ההגדלה כך שאורגניזם יחיד ימלא את כל שדה הראייה. נתח את התפלגות היסודות של סידן על הדגימה על ידי רכישת מפה של כל שדה הראייה, הפעל את המפה במשך 15 דקות או יותר או עד שהנתונים מראים לוקליזציה ברורה של סידן בתוך האורגניזם.

לקבלת כימות נקודות לאזור עניין, בחר באפשרות Point ID באמצעות הכלי Single Point. לחץ על אזור העניין כדי לבצע סריקה. רשום בקפידה את המיקום על-ידי לכידת סדרה של תמונות בהגדלות הולכות ופוחתות.

כדי להכין את הדגימות ל-EBSD, הסר את הדגימה ממחזיק ה-SEM השטוח והדבק אותה על בדל מוטה מראש של 45 מעלות באמצעות צבע כסף. באמצעות הייחוס, תמונות SEM מאתרות את החיה המעניינת ואת האזור המדויק של החיה שיש לבדוק. הטה את השלב ב-25 מעלות כך שמשטח הדגימה יהיה כעת כ-70 מעלות לאלומת האלקטרונים.

הרם את הבמה. בחר במצב EBSD בתוכנת AZtec. בחר ארגוניט כשלבי העניין.

הכנס את מצלמת ה-EBSD, הגדר את תנאי המצלמה כדי להשיג אות של כ-90%באמצעות רסטר קרן מהיר, רכוש רקע ולאחר מכן צלם תמונה באצטקית. באמצעות הכלי Spot Analysis לחץ על מיקום הדגימה שהראתה אות סידן גבוה יותר. סרקו כדי לראות אם זוהו דפוסי קקוצ'י.

אם קיימות תבניות התואמות לאחד מהשלבים שנבחרו במסד הנתונים, הן ייכללו באינדקס באופן אוטומטי. הגן על דגימת ה-SEM המוכנה בשכבת פלטינה על ידי ציפוי מקרטע לפני שתמשיך להכנת מיקרו-דגימה באמצעות קרן יונים ממוקדת. הכנס את הדגימה לתא FIB SEM, מקם את הדגימה ורכוש תמונת אלקטרונים משנית חיה המושרה על ידי יונים.

אתר את אזור העניין מהתמונות המוזכרות כפי שנקבע בעבר על ידי מיפוי EDS ב-EBSD. סובב את הבמה לפי הצורך כדי לקבל את התכונות המעניינות בקנה אחד עם מסגרת החלון, התאם את ההגדלה כדי להראות את האזור כך שיתאים לתכונות המעניינות, ואז הגדר קופסה להפקדת פחמן וטונגסטן. צלם תמונת מצב של FIB, ולאחר מכן צייר תבנית של ארבע קופסאות סביב מכסה הטונגסטן כדי להגדיר את מיקום המיקרו-דגימה.

לאחר מכן הטה את הבמה ב 58 מעלות וחתוך את החלק התחתון של המיקרו דגימה. הטה את ה-stage בחזרה לאפס, הכנס את בדיקת המיקרו-דגימה של טונגסטן, ולאחר מכן הורד אותה עד שהיא תיצור קשר עם הדגימה. חבר את בדיקת הטונגסטן והדגימה על ידי הפקדת טונגסטן בין קצה הגשושית לציפוי הטונגסטן, ולאחר מכן בצע את החיתוך הסופי, נתק את המיקרו-דגימה משאר האי והרם את הגשושית עם מיקרו-דגימה מצורפת.

הנח חצי רשת נחושת TEM לתוך מחזיק כניסה צדדי, הורד את בדיקת הטונגסטן עד שהמיקרו-דגימה תיצור קשר עם רשת TEM. המיקרו-דגימה נטחנת עוד יותר עד שהיא הופכת לשקופה אלקטרונית. לפני ניתוח TEM, מלא את שני ה-dewars בחנקן נוזלי והגדר את מתח ההאצה ל-300 קילו-וולט.

הנח את חצי הרשת עם הלמלות המחוברות במחזיק ה- TEM הסטנדרטי. מרכז את הקרן על מסך הזרחן, כווץ והרחיב את הקרן וודא שכל תנועת הקרן היא קונצנטרית. השתמש בכפתורי התנועה של הבמה כדי לנווט ולאתר את הדגימה, להגדיל את ההגדלה על הדגימה ולהתאים את ה-Z-Height עד שהדגימה תהיה בפוקוס.

השתמש בעיניות האופטיות לפי הצורך. הכנס את המצלמה והסר את מסך הזרחן. הרחב את האלומה לפי הצורך כדי למנוע רוויה יתר של המצלמה.

התאם את המיקוד ואת פרמטרי המצלמה כדי לצלם תמונה. כדי לרכוש דפוס עקיפה, מרכז את תכונת העניין, הסר את צמצם המטרה והכנס את צמצם העקיפה. עברו למצב Diffraction Lens.

הכנס את הריקון כדי למנוע ממרכז תבנית העקיפה לשרוף את המצלמה או את מסך הזרחן. צלם תמונה של התבנית לניתוח קריסטלוגרפי. להלן כמה תצפיות על תהליך ההסתיידות במהלך המטמורפוזה של תולעת הצינורית.

ערכי ה-pH של תולעי הצינור עלו לאחר גירוי המטמורפוזה של IBMX וה-pH התוך תאי החל לעלות מעבר ל-8 לאחר 31 שעות. הרקמה הרלוונטית להסתיידות היא אזור הצווארון. מפה על אותות SEM-EDS מראה שביום הראשון של תולעת הצינור הייתה התפלגות הומוגנית של סידן, מה שמצביע על כך שתהליך ההסתיידות עדיין לא החל.

יומיים לאחר גירוי המטמורפוזה, חלק מתולעי הצינור כבר הסתיידו יותר מדי ואינן מתאימות עוד לתצפית על חומרים חדשים שהסתיידו. בדגימה של תולעת צינור, כמו זו ששימשה בדוגמה זו, ההסתיידות עדיין בשלב המוקדם שלה, ולכן כימות הסידן עזר לקבוע את מיקום העניין לאפיון נוכחותם של מינרלים. כאשר נבדק באמצעות SEM-EBSD, לאזור המקומי עם אות הסידן החזק היה גם מבנה גבישי של ארגוניט.

באמצעות קרן יונים ממוקדת, הדגימה הוכנה ל-TEM ודפוס העקיפה ממינרל הארגוניט נותח בפירוט קריסטלוגרפי רב יותר. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לאתר אירוע מינרליזציה באורגניזם רב תאי. כאשר משתמשים במיקרוסקופ אופטי ואלקטרונים יחד אנו יכולים לרכוש רמה גבוהה של הבנה פיזיולוגית וחומרית על תהליך ההסתיידות.