כימות מהיר של Blastogenesis mitogen-Induced T לימפוציטים לזיהוי סמים המערכת החיסונית

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את העוצמה של תרופות אימונומודולטוריות באמצעות מונה תאים אוטומטי על ידי מדידת בלסטוגנזה של לימפוציטים מסוג T או טרנספורמציה של פיצוץ. בדיקה זו מספקת שיטה מהירה לכימות הפעלת לימפוציטים מסוג T באמצעות מונה תאים אוטומטי המצויד למדידת קוטר התאים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מדידה מהירה, פשוטה וישירה מתאים בודדים, בניגוד למבחני התפשטות לימפוציטים מסוג T נפוצים.

טיפול בלימפוציטים באמצעות תרופות אימונומודולטוריות יגדיל או יקטין את הקצב וההיקף של הבלסטוגנזה התאית. באמצעות מבחן מונה התאים ניתן למדוד את היקף הבלסטוגנזה הזו תוך כארבע דקות לכל דגימה. תוך עשר דקות מההקרבה, רססו את בטן העכבר ב-70 אחוז אתנול והשתמשו במספריים כדי לבצע חתך בפרווה ובעור בצד שמאל של החיה.

החזיקו את העור בנפרד ולאחור כדי לחשוף את הצפק. לאחר מכן מרחו כלורהקסידין של ארבעה אחוזים על מקום החתך. בעזרת סט שני של מספריים ומלקחיים, בצע חתך של שניים עד שלושה סנטימטרים לאורך הבטן המרכזית כדי לפתוח את הצפק.

לאחר מכן, הסר את החיבורים הקרביים ועודפי השומן המקיפים את הטחול והעביר את הרקמה למיכל DPBS. לאחר מכן, הוסיפו עשרה מיליליטר של מדיום RPMI 1640 שלם לצלחת תרבית של עשרה סנטימטרים ומועכים את הטחול בין שתי מגלשות זכוכית חלבית מעוקרות. סנן את תרחיף הרקמות דרך מסננת תאי ניילון סטרילית של 40 מיקרון לתוך צלחת תרבית חדשה של עשרה סנטימטרים כדי להסיר את רקמות החיבור והפסולת ולהעביר את התרחיף החד-תאי לצינור חרוטי של 50 מיליליטר לצנטריפוגה.

השעו מחדש את הגלולה ב-20 מיליליטר של מאגר ליזה של כדוריות דם אדומות. לאחר עשר דקות בטמפרטורת החדר עם נדנוד עדין, אספו את התאים בעזרת צנטריפוגה נוספת והשעו מחדש את הגלולה בעשרה מיליליטר של מדיום טרי. ואז צנטריפוגה שוב את התאים להשעיה מחדש בשני מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס מדיום שלם.

כדי לטהר את תאי ה-T, יש לשטוף תחילה עמוד צמר ניילון אחד עד שניים לטחול פעמיים עם חמישה מיליליטר RPMI מלא ולהניח את העמודים בחממת תרבית תאי פחמן דו חמצני של 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים למשך שעה. בתום הדגירה, העמיסו שני מיליליטר של מתלה הטחול המבודד על החלק העליון של כל עמוד ואפשרו לתאים לעבור דרך העמוד עד שהנוזל מגיע לראש הצמר. לאחר מכן, הוסיפו שני מיליליטר של מדיום שלם טרי של 37 מעלות צלזיוס לראש העמודים ואפשרו למדיום לעבור דרך צמר הניילון עד שהנוזל בראש העמוד מגיע לראש הצמר.

כעת מכסים את הצמר בשלושה מיליליטר של מדיום שלם של 37 מעלות צלזיוס ומחזירים את העמוד לחממת תרבית התאים לכל תאי B, פיברובלסטים ותאי אביזרים כדי להיצמד לסיבי הצמר. לאחר שעה, בצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר, שטפו את העמוד פעמיים עם חמישה מיליליטר של מדיום שלם טרי כדי לחסל את תאי ה- T שאינם נדבקים. ואז אוספים את התאים על ידי צנטריפוגה.

לאחר שטיפת תאי ה- T פעם אחת עם עשרה מיליליטר של מדיום שלם, השעו מחדש את הגלולה בשני מיליליטר של מדיום שלם טרי. לאחר מכן ספרו את התאים ודללו את התרחיף ל-0.5 כפול עשרה עד שישה תאים לריכוז מיליליטר במדיום שלם טרי לזריעה לתוך צלחת תרבית תאים של שש או 24 בארות לפי הצורך בניסוי. תוך 24 שעות מבידודם, הפעל את עמוד צמר הניילון שבודד תאי T עם הגירוי המתאים והתרופה הניסיונית המעניינת.

לאחר 12 עד 72 שעות, השתמש בפיפטה של מיליליטר אחד כדי לערבב בעדינות את התאים המטופלים המופעלים כדי להסיר גושים. כדי למדוד את קוטר התאים על ידי מונה תאים אוטומטי, העבירו מיליליטר אחד של התאים המטופלים מכל באר לכוסות דגימה בודדות והניחו את כוסות הדגימה בקרוסלת הדגימה של מונה התאים האוטומטי. הזן את מזהה הדגימה ואת פרטי סוג התא כדי לרשום את הדגימות ולהתחיל להפעיל את הדגימות.

לאחר ערבוב טריפן כחול עם תרחיף התאים, התאים מועברים על פני שדה הדמיה עד שנאספות כ-100 תמונות תאים מכל דגימה. התוכנה מציירת עיגול סביב כל תא טריפן מוכתם בכחול ולא מוכתם כדי לקבוע את קוטר התא. לאחר שכל התאים נמדדו, הנתונים מיוצאים לגיליון אלקטרוני המציג את התוצאות כספירת התאים הכוללת והקיימא עבור כל קוטר שנמדד.

לאחר מכן ניתן להציג את הנתונים כהיסטוגרמות. לאחר יומיים של גירוי עם PMA ויונומיצין, נצפה שינוי משמעותי בחציון התפלגות התדר לעבר קוטר תאים גדול יותר כאשר מספר תאי T בקוטר קטן יותר מופחת בהתאם. בריכוז קבוע של 250 ננו-מולרי יונומיצין, אפקט ה-PMA אינו משתנה באופן משמעותי על ידי העלאת ריכוז גירוי ההפעלה מ-2 ל-250 ננוגרם למיליליטר.

כמו כן, אין הבדל ניכר בהתפשטות תאי ה-T שנצפה. תרופות מעכבות קלצינורין מדכאות חלקית הן את הבלסטוגנזה של תאי T והן את ההתפשטות. טיפול בתאי T עם תרכובות מדכאות חיסון המכוונות לגורם הגרעיני קלצינורין של תאי T מופעלים מעכב את התגובה הבלסטוגנית בכמעט 72 אחוזים.

רפמיצין ו-FTY720 מציגים השפעות מתונות אך מובהקות סטטיסטית על בלסטוגנזה. בעוד ש-TRAM34 ככל הנראה אינו משפיע על התפשטות תאי T של עכברים אפילו בריכוזים של 700 ננו-מולרים. כאשר משתמשים ברפמיצין ובציקלוספורין A יחד, הבלסטוגנזה מעוכבת לחלוטין.

תוצאות דומות נצפות עם תאי T של עכברים המופעלים עם חרוזים מגנטיים מצומדים נגד CD3 ואנטי CD28. ניתן להשתמש בבדיקה זו כדי לכמת בהצלחה את ההשפעות של תרופות אימונומודולטוריות שונות, ולתת הערכה טובה יותר של עוצמת התרופה בהשוואה לבדיקות התפשטות טיפוסיות הכוללות גם תרומות של תאים אפופטוטיים ונמקים. בשיטה זו, ניתן למדוד עד 15 דגימות פנימה והחוצה מה שמאפשר כימות בו-זמני ומאוחר יותר של שיעורי הבלסטוגנזה וההתפשטות.

מדי פעם בועות אוויר יכולות להיכנס לתא הזרימה מה שהופך את המדידה לבלתי שמישה, לכן יש לבחון את כל התמונות לאיתור בועות אוויר לפני שהנתונים מכל ניסוי מתקבלים לניתוח. מגבלה אחת של הליך זה היא שאם יש יותר מדי פסולת בדגימה, המדידה עשויה להתייחס לפסולת כתאים ברי קיימא. עם שינויים מתאימים, לבדיקה זו יש פוטנציאל להיות מותאם לחקר השינוי בגודל התא בנויטרופילים ובהפטוציטים.