Name: כימות מהיר של Blastogenesis mitogen-Induced T לימפוציטים לזיהוי סמים המערכת החיסונית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: למדו שיטה מהירה לכימות בלסטוגנזה של לימפוציטי T באמצעות מונה תאים אוטומטי. שיטה זו מאפשרת הערכת יעילות תרופות מעכבות חיסון בדגימות בודדות בתוך ארבע דקות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ללוסיל רנשל על השימוש בקורא הלוחות, לננסי ביגלי על הדיון המועיל, ולטום בראון על המתנה של עכברי ICR. עבודה זו מומנה על ידי מענק 1R01AI114804 מהמכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות ועל ידי קרנות פיתוח הפקולטה של WSU (ל-J.A.K). J.N.G. נתמך בחלקו על ידי מענק המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית R25GM090122.

<ol><li>Weiss, A., Samelson, L. E. T-lymphocyte activation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeiss%2C+A+%22Fundamental+Immunology%22">Fundamental Immunology</a>. Paul, W. E. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. Fifth ed 321-364 (2003).</li>
<li>Gergely, P., Ernberg, I., Klein, G., Steinitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastogenic+response+of+purified+human+T-lymphocyte+populations+to+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Blastogenic response of purified human T-lymphocyte populations to Epstein-Barr virus (EBV).</a> Clin Exp Immunol. 30 (3), 347-353 (1977).</li>
<li>Sanderson, R. J., Rulon, K., Groeneboer, E. G., Talmage, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+response+of+murine+splenic+lymphocytes+to+concanavalin+A+and+to+co-stimulator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The response of murine splenic lymphocytes to concanavalin A and to co-stimulator.</a> J Immunol. 124 (1), 207-214 (1980).</li>
<li>Decoursey, T. E., Chandy, K. G., Gupta, S., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogen+induction+of+ion+channels+in+murine+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitogen induction of ion channels in murine T lymphocytes.</a> J Gen Physiol. 89 (3), 405-420 (1987).</li>
<li>Nibbering, P. H., Zomerdijk, T. P., Tilburg, A. J., Furth, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mean+cell+volume+of+human+blood+leucocytes+and+resident+and+activated+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Mean cell volume of human blood leucocytes and resident and activated murine macrophages.</a> J Immunol Methods. 129 (1), 143-145 (1990).</li>
<li>Segel, G. B., Cokelet, G. R., Lichtman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+measurement+of+lymphocyte+volume%3A+importance+of+reference+particle+deformability+and+counting+solution+tonicity%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The measurement of lymphocyte volume: importance of reference particle deformability and counting solution tonicity.</a> Blood. 57 (5), 894-899 (1981).</li>
<li>Cooper, H. L., Braverman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+in+resting+and+growth-stimulated+human+peripheral+lymphocytes.+Evidence+for+regulation+by+a+non-messenger+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis in resting and growth-stimulated human peripheral lymphocytes. Evidence for regulation by a non-messenger RNA.</a> Exp Cell Res. 127 (2), 351-359 (1980).</li>
<li>Cooper, H. L., Braverman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Close+correlation+between+initiator+methionyl-tRNA+level+and+rate+of+protein+synthesis+during+human+lymphocyte+growth+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Close correlation between initiator methionyl-tRNA level and rate of protein synthesis during human lymphocyte growth cycle.</a> J Biol Chem. 256 (14), 7461-7467 (1981).</li>
<li>Teague, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+changes+the+spectrum+but+not+the+diversity+of+genes+expressed+by+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Activation changes the spectrum but not the diversity of genes expressed by T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12691-12696 (1999).</li>
<li>Tzur, A., Kafri, R., Lebleu, V. S., Lahav, G., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+growth+and+size+homeostasis+in+proliferating+animal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell growth and size homeostasis in proliferating animal cells.</a> Science. 325 (5937), 167-171 (2009).</li>
<li>Messele, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonradioactive+techniques+for+measurement+of+in+vitro+T-cell+proliferation%3A+alternatives+to+the+%5B3H%5Dthymidine+incorporation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nonradioactive techniques for measurement of in vitro T-cell proliferation: alternatives to the [3H]thymidine incorporation assay.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 7 (4), 687-692 (2000).</li>
<li>Maghni, K., Nicolescu, O. M., Martin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suitability+of+cell+metabolic+colorimetric+assays+for+assessment+of+CD4%2B+T+cell+proliferation%3A+comparison+to+5-bromo-2-deoxyuridine+%28BrdU%29+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Suitability of cell metabolic colorimetric assays for assessment of CD4+ T cell proliferation: comparison to 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) ELISA.</a> J Immunol Methods. 223 (2), 185-194 (1999).</li>
<li>Weichert, H., Blechschmidt, I., Schröder, S., Ambrosius, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MTT-assay+as+a+rapid+test+for+cell+proliferation+and+cell+killing%3A+application+to+human+peripheral+blood+lymphocytes+%28PBL%29%5BTitle%5D)+AND+%22Allerg+Immunol+%28Leipz%29%22%5BJournal%5D)">The MTT-assay as a rapid test for cell proliferation and cell killing: application to human peripheral blood lymphocytes (PBL).</a> Allerg Immunol (Leipz). 37 (3-4), 139-144 (1991).</li>
<li>Huang, K. T., Chen, Y. H., Walker, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inaccuracies+in+MTS+assays%3A+major+distorting+effects+of+medium%2C+serum+albumin%2C+and+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Inaccuracies in MTS assays: major distorting effects of medium, serum albumin, and fatty acids.</a> Biotechniques. 37 (3), 406, 408 410-412 (2004).</li>
<li>Rampersad, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+applications+of+Alamar+Blue+as+an+indicator+of+metabolic+function+and+cellular+health+in+cell+viability+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Multiple applications of Alamar Blue as an indicator of metabolic function and cellular health in cell viability bioassays.</a> Sensors (Basel). 12 (9), 12347-12360 (2012).</li>
<li>Quent, V. M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrepancies+between+metabolic+activity+and+DNA+content+as+tool+to+assess+cell+proliferation+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research.</a> J Cell Mol Med. 14 (4), 1003-1013 (2010).</li>
<li>Augustine, N. H., Pasi, B. M., Hill, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+ATP+production+in+whole+blood+and+lymphocyte+proliferation+in+response+to+phytohemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Lab+Anal%22%5BJournal%5D)">Comparison of ATP production in whole blood and lymphocyte proliferation in response to phytohemagglutinin.</a> J Clin Lab Anal. 21 (5), 265-270 (2007).</li>
<li>Sottong, P. R., Rosebrock, J. A., Britz, J. A., Kramer, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+T-lymphocyte+responses+in+whole-blood+cultures+using+newly+synthesized+DNA+and+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Measurement of T-lymphocyte responses in whole-blood cultures using newly synthesized DNA and ATP.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 7 (2), 307-311 (2000).</li>
<li>Wallace, P. K., Muirhead, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+tracking+2007%3A+a+proliferation+of+probes+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Invest%22%5BJournal%5D)">Cell tracking 2007: a proliferation of probes and applications.</a> Immunol Invest. 36 (5-6), 527-561 (2007).</li>
<li>Quah, B. J., Warren, H. S., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+lymphocyte+proliferation+in+vitro+and+in+vivo+with+the+intracellular+fluorescent+dye+carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester.</a> Nat Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).</li>
<li>Teague, T. K., Munn, L., Zygourakis, K., Mcintyre, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+lymphocyte+activation+and+proliferation+by+video+microscopy+and+digital+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Analysis of lymphocyte activation and proliferation by video microscopy and digital imaging.</a> Cytometry. 14 (7), 772-782 (1993).</li>
<li>Böhmer, R. M., Bandala-Sanchez, E., Harrison, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+light+scatter+is+a+simple+measure+of+T-cell+activation+and+proliferation+but+is+not+universally+suited+for+doublet+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Forward light scatter is a simple measure of T-cell activation and proliferation but is not universally suited for doublet discrimination.</a> Cytometry A. 79 (8), 646-652 (2011).</li>
<li>Lee, J., Sadelain, M., Brentjens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+transduction+of+murine+primary+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral transduction of murine primary T lymphocytes.</a> Methods Mol Biol. 506, 83-96 (2009).</li>
<li>Gunzer, M., Weishaupt, C., Planelles, L., Grabbe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+negative+enrichment+of+CD4%2B+and+CD8%2B+T+cells+from+murine+spleen+via+nylon+wool+adherence+and+an+optimized+antibody+cocktail%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail.</a> J Immunol Methods. 258 (1-2), 55-63 (2001).</li>
<li>Trickett, A., Kwan, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+stimulation+and+expansion+using+anti-CD3%2FCD28+beads%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">T cell stimulation and expansion using anti-CD3/CD28 beads.</a> J Immunol Methods. 275 (1-2), 251-255 (2003).</li>
<li>Pène, J., Rahmoun, M., Temmerman, S., Yssel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+anti-CD3%2FCD28+mAb+coupled+magnetic+beads+permitting+subsequent+phenotypic+analysis+of+activated+human+T+cells+by+indirect+immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of anti-CD3/CD28 mAb coupled magnetic beads permitting subsequent phenotypic analysis of activated human T cells by indirect immunofluorescence.</a> J Immunol Methods. 283 (1-2), 59-66 (2003).</li>
<li>Sigal, N. H., Dumont, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclosporin+A%2C+FK-506%2C+and+rapamycin%3A+pharmacologic+probes+of+lymphocyte+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cyclosporin A, FK-506, and rapamycin: pharmacologic probes of lymphocyte signal transduction.</a> Annu Rev Immunol. 10 (1), 519-560 (1992).</li>
<li>Fruman, D. A., Klee, C. B., Bierer, B. E., Burakoff, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcineurin+phosphatase+activity+in+T+lymphocytes+is+inhibited+by+FK+506+and+cyclosporin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Calcineurin phosphatase activity in T lymphocytes is inhibited by FK 506 and cyclosporin A.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (9), 3686-3690 (1992).</li>
<li>Pollizzi, K. N., Waickman, A. T., Patel, C. H., Sun, I. H., Powell, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+size+as+a+means+of+tracking+mTOR+activity+and+cell+fate+of+CD4%2B+T+Cells+upon+antigen+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cellular size as a means of tracking mTOR activity and cell fate of CD4+ T Cells upon antigen recognition.</a> PLoS One. 10 (4), e0121710(2015).</li>
<li>Pollizzi, K. N., Powell, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+T+cells+by+mTOR%3A+the+known+knowns+and+the+known+unknowns%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of T cells by mTOR: the known knowns and the known unknowns.</a> Trends Immunol. 36 (1), 13-20 (2015).</li>
<li>Mandala, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+lymphocyte+trafficking+by+sphingosine-1-phosphate+receptor+agonists%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alteration of lymphocyte trafficking by sphingosine-1-phosphate receptor agonists.</a> Science. 296 (5566), 346-349 (2002).</li>
<li>Qin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+and+FTY720+are+potent+inhibitors+of+the+transient+receptor+potential+melastatin+7+%28TRPM7%29+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Sphingosine and FTY720 are potent inhibitors of the transient receptor potential melastatin 7 (TRPM7) channels.</a> Br J Pharmacol. 168 (6), 1294-1312 (2013).</li>
<li>Wulff, H., Kolski-Andreaco, A., Sankaranarayanan, A., Sabatier, J. M., Shakkottai, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulators+of+small-+and+intermediate-conductance+calcium-activated+potassium+channels+and+their+therapeutic+indications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Modulators of small- and intermediate-conductance calcium-activated potassium channels and their therapeutic indications.</a> Curr Med Chem. 14 (13), 1437-1457 (2007).</li>
<li>Petho, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-proliferative+effect+of+cation+channel+blockers+in+T+lymphocytes+depends+on+the+strength+of+mitogenic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">The anti-proliferative effect of cation channel blockers in T lymphocytes depends on the strength of mitogenic stimulation.</a> Immunol Lett. 171, 60-69 (2016).</li>
<li>Wulff, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+potent+and+selective+inhibitor+of+the+intermediate-conductance+Ca2%2B-activated+K%2B+channel%2C+IKCa1%3A+a+potential+immunosuppressant%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Design of a potent and selective inhibitor of the intermediate-conductance Ca2+-activated K+ channel, IKCa1: a potential immunosuppressant.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97 (14), 8151-8156 (2000).</li>
<li>Lang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+significance+of+cell+volume+regulatory+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional significance of cell volume regulatory mechanisms.</a> Physiol Rev. 78 (1), 247-306 (1998).</li>
<li>Hue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+liver+carbohydrate+and+fatty+acid+metabolism+by+cell+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Control of liver carbohydrate and fatty acid metabolism by cell volume.</a> Biochem Soc Trans. 22 (2), 505-508 (1994).</li>
<li>O'Flaherty, J. T., Kreutzer, D. L., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+aggregation+and+swelling+induced+by+chemotactic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil aggregation and swelling induced by chemotactic agents.</a> J Immunol. 119 (1), 232-239 (1977).</li>
<li>Hsu, L. S., Becker, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+changes+induced+in+rabbit+polymorphonuclear+leukocytes+by+chemotactic+factor+and+cytochalasin+B%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Volume changes induced in rabbit polymorphonuclear leukocytes by chemotactic factor and cytochalasin B.</a> Am J Pathol. 81 (1), 1-14 (1975).</li>
<li>Rosengren, S., Henson, P. M., Worthen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration-associated+volume+changes+in+neutrophils+facilitate+the+migratory+process+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Migration-associated volume changes in neutrophils facilitate the migratory process in vitro.</a> Am J Physiol. 267, 6 Pt 1 C1623-C1632 (1994).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאן אנו מתארים טכניקת האיתור וכימות המהיר של טרנספורמציה T-cell blastogenic באמצעות דלפק תא אוטומטי. בתנאים שלנו (250 ng / ml PMA ו -250 ננומטר ionomycin גירוי), באזור תא השטח הוגדל כפולה ושלושה פי נפח לאחר 48 שעות של הפעלה. Assay הוא רגיש מספיק כדי לזהות פיצוץ במהלך ההפעלה 12 שעות של הראשון, כאשר נפח התא גדל רק 1.25 פי לעומת נח (2D איור). מנגנון רלוונטי יותר פיסיולוגי של הפעלת תאי T באמצעות אנטי CD3 ו חרוזים מגנטיים מצופה נוגדן אנטי CD28 היוצר תגובת blastogenic משמעותית, עם גידול פי 2.3 בממוצע בנפח (72 שעות לאחר הפעלה, איור 3D). תאים mononuclear אדם הראה שינוי 2.6 של פי נפח על PMA / ionomycin גירוי במשך 48 שעות (איור 4). הקוטר הממוצע של תאי T טחול עכבר ICR והנפח נקבעו6.9 מיקרומטר ו 1.9 x 10 -4 NL, בהתאמה. PBMCs אדם (מתורם בריא אחד) היה בקוטר ממוצע של 7.7 מיקרומטר ו היקף ממוצע של 2.7 x 10 -4 NL. שימוש בפרוטוקול זה, אנחנו גם נבדק ריכוז גדל והולך של PMA על יכולתם להפעיל תאי T. תוצאות חד-תאיים אלה עלו בקנה אחד עם מבחני התפשטות ביצע בריכוזים PMA דומה. תרכובות דיווחו מספר להשפיע שגשוג התאים נבדקו: FTY720 31,32; א ציקלוספורין immunosuppressants, FK506, ו Rapamycin 27,28; וחשמלית-34, חוסם ערוצי KCa3.1 המופעל סידן 33,35. מצאנו כי, בריכוזים שנבדקו, המעכבים החזקים ביותר של blastogenesis היו CSA ו FK506. היה Rapamycin השפעה מדכאת קטנה אך משמעותית מבחינה סטטיסטית על blastogenesis. טראם-34, מצד שני, לא השפיע blastogenesis. CsA דיכא גם blastogenesis ו- proliferation, אבל לא לגמרי (האיור 2B ו 2C), ההוכחה כי מדידה נגד תא אוטומטי הוא לתאם טוב של יעילות תרופה בהתרבות תאי T. בנוכחות rapamycin יחד עם CSA, blastogenesis היה מופנם לחלוטין, דבר המצביע על כך NFAT- ושבילים בתיווך mTOR בשילוב יכול להסביר באופן מלא להגדלת תאי T על גירוי mitogenic עם PMA / ionomycin (איור 3 ג). הטווח הדינמי של מבחני התפשטות כמה מוגבל (ראה איור 2). מבחני הפצת נשק, כמו זו השתמשנו (איור 2 ג), לדווח אות הכוללת תרומות תאים אפופטוטיים ו נמקי. מדידות שינוי בקוטר אוטומטיות אין מגבלה, כמו המדידות נוגעות תאי קיימא בלבד. כדאיות התא מוערך על ידי הרחקה של כתם כחול trypan מתאי בריא, בר קיימא. במדידות גודל, באמצעות קדימהפיזור אור בתזרים cytometry אפלית תא כפיל יכול להיות בעייתי 22. בשנת המדידות נגד תא האוטומטי, לא אוכלוסיית כפיל נמצאה (איור 1). כמו כן, המדידה הייתה מדויקת מספיק כדי להבחין בין ההשפעות של 100 ו -200 ננומטר ציקלוספורין (טבלת 1), וכדי לזהות blastogenesis בתוך 12 שעות של גירוי mitogenic (איור 2 ד). assay חדש תכונה זו שימושית במיוחד עבור מספר קטן של דוגמאות. עד 15 דגימות יכולות להימדד 1 hr. עם זאת, assay יש מגבלות, שרובן ניתן למתן. למרות שזה יכול למעשה לפתור קטן (&lt;1 מיקרומטר) ההבדל בקוטר התא, מודל המכונה השתמשנו שסף זיהוי ותחתון של 5 מיקרומטר. מגבלה זו יכולה לגרום יתר של גדלי תאים קטנים מאוד, שכן הוא יעיל כולל את כל תאים עם בקטרים ​​קטנים. עם זאת, הדגמים החדשים של הדלפק תא יש דיש זיהויבנים של ~ 2 מיקרומטר, אשר אמור להקל על בעיה זו. אם יש יותר מדי פסולת במדגם, המכשיר מתייחס אליהם תאי קיימא כמו. בנוסף, בועות אוויר יכולות לקבל מדי פעם לתוך תא הזרימה ולגרום לעיוות של תמונות התא שנתפסו על ידי מכונה. העיוות אינה מופיעה כדי להשפיע על קביעת הכדאיות, אבל זה יכול להשפיע על בקטרים ​​הנמדדים. לכן, מומלץ כי כל התמונות להיבדק על ידי הנסיין בועות אוויר לפני נתוני כל ניסוי מתקבלים לניתוח. מאז התוכנה רק שואבת במעגלים סביב התאים, בקטרים ​​של תאים שאינם כדוריים עשויים להיות מוטים כלפי ציר הזמן, מה שהופך את assay פחות מתאים תאים שאינם כדוריים. assay זה הוא מהיר, לוקח דקות 4 כ לדגימה, לעומת מבחני התפשטות, אשר דורשים מספר שעות. איסוף נתונים הוא גם די פשוט באמצעות התוכנה מצורפת להתקן. התוכנה יכולה לייצא נתוני מדידה על spreadsheet לניתוח. לבסוף, הוא תא בודד, בניגוד אוכלוסייה, מדידה; הן blastogenesis ושגשוגם נמדדים; והיא מבדילה בין תאי קיימא ומתים בעת ובעונה אחת. ניתן להשתמש בו כדי להעריך זני עכבר שונים על יכולת הר תגובה חיסונית. Assay יכול לשמש גם בהצלחה לשקילה blastogenesis בתאי T מתורמי אדם (איור 4), והוא יכול לשמש גם סוגי תאים אחרים. נפח עליות ניידות ידועות לתרום בוויסות של חילוף חומרים: נפיחות תא יעודד את סינתזת הגליקוגן נגרמת גלוטמין ו lipogenesis ב hepatocytes 36,37. נויטרופילים להציג עליות נפח הקשורים הגירה של 35-60%, ואילו סוכני chemotactic לגרום 10-15% נפיחות 38-40. את assay הנוכחי יכול לשמש פוטנציאל ללמוד תהליכים אלה.

לימפוציטים מסוג T הם תאים ראשוניים אחראי חסינות אדפטיבית ביונקים. זה ידוע כי הם מגיבים פפטידים ספציפיים אנטיגני שהציגו מולקולות MHC על פני השטח של תאי מציגי אנטיגן. עם הפעלת קולטן T-cell מאותו מקור (TCR), התא מגדיל ב תהליך שמכונה טרנספורמציה blastogenic, או blastogenesis. תהליך זה ניתן לגלות כבר בתוך השעה הראשונה ~ 6 לאחר הגירוי מוחל 1. במהלך blastogenesis, היקפי תאי T פרט להגדיל 2 עד פי 4 2-6. לימפוציטים מתחילים להתרבות בתהליך הנקרא שיבוטים, שמטרתו היא ליצור שיבוטים כמה שיותר תאי TCR נושאות אנטיגן ספציפי ככל האפשר. התאים הצאצאים ואז להפעיל פונקציה אימונולוגית שלהם תוך הבחנה לתוך ציטוטוקסיות (CD8 +) או עוזר לימפוציטים מסוג T מפעיל (CD4 +). לפיכך, לימפוציטים מסוג T נאיבי בדם אנושי או עכבר נמצא בשלב G 0 (מנוחה) של התאמחזור ופעילות מטבולית תמיכה מינימלית. בחשיפה אנטיגנים או mitogens, תאי T להזין מחדש את מחזור התא, עם גירוי בו זמני של סינתזת שעתוק וחלבוני 7-10. Mitogens, כגון phorbol 12-myristate 13-תצטט (PMA) ו ionomycin לעורר את לימפוציטים דרך ההפעלה של C פרוטאין קינאז (PKC) ו Ca 2 + איתות תלויה מסלולי 1. הפעלת תאי T עם PMA / ionomycin עוקפת את צעדי איתות TCR. בהתרבות במבחנת מבחנים נמצאים בשימוש נרחב לצורך הערכת תפקוד לימפוציטים בתגובה לגירויים. קריאות הפצה נלקחות בדרך כלל אחד עד שלושה ימים לאחר תחילת גירוי תאי T ומשקפות את המדינה הקולקטיבית של מאה או אלף תאים. עוצמתה של mitogens השונה ותרופות אימונו במבחנה ניתן להעריך פשוט על ידי מדידת שיעורי התפשטות בנוכחות תרכובות אלו. חלק של אלהssays והמגבלות שלהם הם דנו בהמשך. בדבר ספירת מספר סלולארי ישירה, ההליך הוא גוזל זמן בהסתברות גבוהה של טעויות מפעיל. עבור סינתזה של DNA, assay ההתאגדות thymidine-3H מודד סינתזה של DNA, אך המגבלה העיקרית שלה היא radiotoxicity שלה. חלופה לא רדיואקטיבי הוא BrdU, אבל בטווח של התגובה ליניארי עבור צמיחת תאים מוגבל, וטיפול נוגדן נדרש, אשר מגדילה את מספר השלבים בהליך 11,12. עבור פעילות מטבולית, מלחים tetrazolium (MTT, MTS, XTT, ו WST-1) ו resazurin מבחני colorimetric מבוסס הצבע ולדווח על המצב המטבולי הכללי של חלוקת אוכלוסיות תאים. עם זאת, MTT אינו מסיס במדיום התרבות, המחייב שלבים לשטוף נוספים, ובכך שילוב שגיאות במדידה; XTT צריך מרכיבים נוספים כדי להפחית ביעילות; MTS-, WST-1-, ומדידות מבוססי resazurin הם משפיעיםאד על ידי ה- pH בינוני תרבות ואדום 13-16 בסרום, אלבומין או פנול מרכיביו. מבחנים אלה לא מודדים את המספר האמיתי של תאי קיימא אלא לאמידה של פעילויות אנזים בשילוב. לפיכך, שיעור ההתפשטות לא ניתן לקבוע במדויק על ידי מבחני מטבולית בגלל המתאם שאינו ליניארי בין מספר תא לצבוע הפחתת 12,17. למדידת ריכוז ה- ATP, עליות תאי T-induced ההפעלה ATP לתאם עם התפשטות. עם זאת, העלאת רמת ה- ATP התאי היא אחד הצעדים הראשונים של הפעלת תא T; שלבים רבים מאחורי הוא ההתפשטות בפועל 17,18. עבור assay דילול צבע, צבע פלואורסצנטי CFSE מכתים תאים באמצעות קשירת קוולנטית חלבונים תאיים. לצבוע מראה ירידה תלוית התפשטות העוצמת פלורסנט, אשר יכול לעקוב אחר מספר חלוקות תא. עם זאת, בשל תיוג חלבון קוולנטיים, התפקידים אלהאפשר להתפשר חלבונים. צבען הוא רעיל לתאים בריכוזים גבוהים. בריכוזים לצבוע נמוכים, לעומת זאת, את עוצמת הקרינה הראשונית מצטמצמת, ומקטינה את מספר חלוקות תא שניתן לעקוב אחריהם. בנוסף, לאחר תיוג עם CFSE, יש אובדן 50% ~ עצמאית-התפשטות קרינה ראשונית במהלך התקופה 24 עד 48 השעות הראשונות, אשר מגבילה את הטווח הדינמי של assay זה 19,20. רוב המבחנים אלה משקפים את המצב הקולקטיבי של מספר הגדול של תאים ודורשים לטיפול בתאים עם צבעי ניאון. תאי נימקי אפופטוטיים עשויים גם לתרום מדידות אלה, אלא אם כן הם מוסרים מן הניתוח על ידי צביעה עם כימיקלים או נוגדנים. Blastogenesis לימפוציטים יכול להיות מוערך על ידי מגוון שיטות, כגון מיקרוסקופיה אופטית או cytometry זרימה 4,21,22. כאן אנו מתארים שיטה מהירה למדידת גדלים תאי T באמצעותn אוטומטית דלפק תא, אשר אוסף תמונות תא בזמן אמת מאוחסן וניתן מחדש נתחו במועד מאוחר יותר. בנוסף מדידות גודל, המכשיר הזה מספק מספרים סלולריים מדויקים באחוז תאי קיימא, כפי שנקבע על ידי הרחקת כתם הכחולה trypan. המכשיר בשימוש בפרוטוקול זה זמין מסחרי, ואת היצרנית נבדקת הדיוק של המכשיר באמצעות שלושה כלים שונים ובקרות ריכוז כדאיים כמה. תוצאות המחקרים הללו הפגינו מקדם שונה כי היה בדרך כלל מתחת ל -6%. כפי שצוין בפרוטוקול, המכשיר הוא מכויל על בסיס קבוע עם 6 מיקרומטר ו -8 מיקרומטר בקוטר חרוזי פוליסטירן. היתרונות של שימוש מונה תא להבדיל בין תאי T מנוחת lymphoblasts T מבוססים על קוטר תא הוא קלות שימוש ואת האופי האוטומטי של הניתוח. התוכנה מסוגלת של ציור עיגול סביב כל תא וחישוב קוטר התא. בנוסף, imגילים גלויים למפעיל, אשר יכול לאמת את הדיוק של המכשיר בזיהוי התא ונכון ציור עיגול סביבם. במונחים של מגבלות, המכשיר לא יכול כשלעצמו להבדיל בין פסולת ותאים; ולכן, חשוב כי המפעיל רואה בכל תמונה כפי שהיא מעובדת. קיים פוטנציאל לשילוב בועות אוויר, אשר יקטין את מספר תחומים אפשריים לניתוח; עם זאת, זה נדיר אם החזקת השטיפה הרגילה מבוצעת. במחקר זה, קבוצות של לימפוציטים מסוג T הטחול היו מגורה עם ionomycin והגדלת ריכוזי PMA עבור 12-48 שעות. ריכוזי PMA נמוכים כמו 2 ng / ml הוא מושרה תגובה blastogenic חזקה ושגשוגם משמעותי. מדידות של תופעות של מספר תרופות, כגון ציקלוספורין A immunosuppressants (CsA), FK506 (tacrolimus), ו rapamycin (sirolimus), כמו גם טראם-34 חוסמי תעלות יונים FTY720 (fingolimod), על blastogenesis הפגין הסכם טוב עם אפקטים דיווחו על התפשטות. תגובת blastogenic של PBMCs אדם PMA / ionomycin ו murine גירוי תאי T עם אנטי CD3 ואנטי-CD28 מצופה נוגדנים חרוזים מגנטיים נמדדה גם. את assay דלפק התא מכמת הוא blastogenesis ואת קצב ההתפשטות (צפיפות תאים) בו זמנית, אך בנפרד, להבדיל מהשיטות הנ&quot;ל, אשר להסתכל שילוב של השפעות אלו. הפרוטוקול המובא מספק טכניקה מהירה וחזקה על מנת לאמוד את עוצמת סוכני mitogenic ואת המערכת החיסונית.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640&nbsp;</td><td>לונזה</td><td>BW12-702F</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; מסנני תאי ניילון M&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>עמודי סיבי צמר ניילון</td><td>Polysciences, Inc.&nbsp;</td><td>21759-1</td><td></td></tr><tr><td>צינורות חרוטיים 50 מ"ל&nbsp;</td><td>מחסן המעבדה</td><td>TLD431697</td><td></td></tr><tr><td>צלחות שטופלו בתרבית תאים עם 6 בארות</td><td>ארה"ב Scientific</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>צלחות מטופלות בתרבית תאים 96 בארות</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td> <td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous תמיסה אחת מבחן ריבוי תאים&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td>MTS מבוסס בדיקה</td></tr><tr><td>Cyclosporine A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30024</td><td></td></tr><tr><td>FK506</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>104987-11-3</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-3504</td><td></td></tr><tr><td>TRAM-34</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6700</td><td></td></tr><tr><td>FTY720</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0700</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28</td><td>Gibco</td><td>11456D</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)&nbsp;</td><td>אקרוס אורגניקס&nbsp;</td><td></td><td></td>356150010</tr><tr><td>יונומיצין מלח סידן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>MP ביו-רפואיים&nbsp;</td><td>ICN1670049</td><td>מלאי פי 100</td></tr><tr><td>Dulbecco' s פוספט חוצץ מלח (DPBS)&nbsp;</td><td>HyClone</td><td>SH30378.02</td><td>מלאי פי 10</td></tr><tr><td>1,4-דיתיותרייטול (DTT)&nbsp;</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>12/3/3483</td><td>חומר הפחתה</td></tr><tr><td>8 ומיקרו; M תקן גודל חלקיקים מיקרו&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>84192-5ML-F</td><td>בפועל&nbsp; 8.02 ומיקרו; M</td></tr><tr><td>6 ומיקרו; M תקן גודל חלקיקים מיקרו&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>89756-5ML-F</td><td>בפועל 6.084 ומיקרו; m</td></tr><tr><td>מעמד הפרדה מגנטי יחיד לצינור 1.5 - 2 מ"ל</td><td>V& פי סיינטיפיק בע"מ</td><td></td><td></td>VP772F5</tr><tr><td>חממת תרביות תאים</td><td>Forma Scientific&nbsp;</td>קורא היברידי <td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1&nbsp;</td><td>מנתח</td> כדאיות תאים Bio Tek <td>BTH1M</td><td></td></tr><tr><td>Vi-CELL&nbsp;</td><td>בקמן קולטר</td><td>731050</td><td></td></tr></tbody></table>

כימות מהיר של blastogenesis mitogen-induced t לימפוציטים לזיהוי סמים המערכת החיסונית

Rapid Quantification of Mitogen-induced Blastogenesis in T Lymphocytes for Identifying Immunomodulatory Drugs

התפשטות לימפוציטים בתגובה אנטיגני או גירוי mitogenic היא תופעה לכימות בקלות שימושי המערכת החיסונית בדיקות (כלומר, אימונוסופרסיבי או immunostimulatory) תרכובות כימיות התרופות הביולוגיות. אחד הצעדים המוקדמים במהלך mitogenesis הוא הגדלת תא או שינוי blastogenic, ואז עולה נפח תא לפני החלוקה. זה בדרך כלל לגילוי בשעות המספר הראשונה של גירוי T-לימפוציטים. כאן אנו מתארים שיטה מהירה לכמת blastogenesis בלימפוציטים T המבודדים טחול עכבר ותאי הדם היקפיים mononuclear אדם (PBMCs) באמצעות דלפק תא אוטומטי. מבחני התפשטות שונים הנפוץ על פי רוב הם מייגע ורק לשקף את השפעת האוכלוסייה הכללית ולא תופעות הסלולר הפרט בתוך אוכלוסיה. לעומת זאת, assay נגד תא האוטומטי הציגה מספקת מדידות מהירות, ישירות, ומדויקות של קטרי תא שיכול להיותהמשמש להערכה האפקטיבית של mitogens השונה ותרופות אימונו במבחנה.

השתמשנו assay זה להשוות את תהליך יצירת הפיצוץ לימפוציטים במהלך גירוי עם PMA, אסתר phorbol, ו ionomycin, ionophore סידן. איור 1 א מציג את התפלגות תדירות בקטרים של המנוחה ותאי הטחול T פרמקולוגית מופעל. טיפול של תאים עם PMA / ionomycin עבור ~ 2 ימים הביא שינוי משמעותי בהרכב החציון של ההתפלגות כלפי בקטרים גדולים יותר (ראה, למשל התייחסות 4). מספר התאים עם בקטרים ​​קטנים הופחת בהתאם. על מנת לוודא כי המכשיר שלנו דיווח על בקטרים הנכונים, בצענו שני כיולים עם חרוזי פוליסטירן של 6 מיקרומטר ו -8 מיקרומטר בקטרים (ראה לוח חומרים). דמויות 1B ולהראות 1C קריאות מתאי מופעל T גבי עם 8 מיקרומטר סטנדרטיים נח תאי T גבי עם תקן 6 מיקרומטר. דמות1D מציג את גדלי חרוז בקרה חלו ידי היצרן זממו נגד בקטרים החציוני נמדדו עם דלפק התא האוטומטי שלנו. נראה שגודל 6 מיקרומטר היה להפריז מעט במדידות שלנו, ככל הנראה בשל סף המדידה של המכשיר שיש גבול תחתון של 5 מיקרומטר. עם זאת, סטיית ההתקן של הקטרים ​​החרוזים שנמדדים מדידות תא הדלפק הייתה בהסכמה עם סטיית תקן דיווח על ידי היצרן. אנו מסיקים מניסויים אלה שמכשיר זה יכול לשמש באופן מהימן להשוות מנוחה וגדל T-cell עכבר מגורה mitogen ושהמכשיר יכול למדוד את קטרי תא בפועל במדויק. אנחנו מכן המשכנו לבחון את התלות של עליית הקוטר הממוצעת על ריכוז PMA ומצאנו כי, בריכוז קבוע ionomycin של 250 ננומטר, השפעת PMA לא שונתה באופן משמעותי על ידי הרמת f ריכוזוROM 2 250 מל / ng (איור 2 א). באמצעות assay MTS המבוסס, מדדנו התפשטות תאי T ב -50 ו -250 ng / ml PMA ולא מצאנו הבדל ניכר (איור 2 ג), בהסכם עם נתוני קוטר תא שלנו. א &#39;ציקלוספורין תרופות מעכב calcineurin (300 ננומטר) FK506 (1 ננומטר) דיכא גם blastogenesis (תרשים 2B) ושגשוגם (איור 2 ג). עיכוב לא להשלים בשני המקרים, עם זאת. המדידות שבוצעו 12 שעות לאחר PMA / בנוסף ionomycin הראה גידול של 7.2% ו -6.8% בקוטר 50 ng / ml ו -250 ng / ml PMA, בהתאמה (איור 2 ד). גודל עליות בשני ריכוזים אלה לא היו שונים משמעותית, כפי שהיה נהוג במשך 48 שעות גירוי (להשוות איור 2 א). נתוני קוטר התא שנאספו נח ותאי T מופעלים לאחר 48 שעות של גירוי PMA / ionomycin מסוכמים <strong&gt; טבלה 1. שטח הפנים הממוצע והנפח של נח תאי T טחול עכבר ICR היו 151.4 מיקרומטר 2 ו -1.9 x 10 -4 NL, בהתאמה. שטח הפנים הממוצע והנפח של תאים מופעלים T היו 300.6 מיקרומטר 2 ו -5.9 x 10 -4 NL, בהתאמה. הגידול בקוטר הממוצע הכולל כל התאים המופעלים היה 40.92% (טבלה 1). גם בדקנו תרכובות כימיות אחרות דיווחו להיות אימונוסופרסיבי: CSA, FK506, rapamycin, FTY720, וחשמלית-34. באיור 3, מדידות גודל תא שהושגו מנוחה והופעלו תאי T בהעדר והנוכחות של תרופות אלו מוצגות. CSA ו FK506, אשר למקד את הפקטור הגרעיני תלוי calcineurin של תאי T מופעלים (NFAT) 27,28, היו החזק ביותר, עיכוב תגובת blastogenic בכמעט 72% (איור 3 א ו 3 ב). מעניין, עםריכוזים PMA גדל, את העוצמה של CSA ו FK506 ירד מעט, למרות לא היה גידול בקוטר תא נוסף בהעדר תרופות אלו (איור 2 א ו -2). Rapamycin, גידול חיסון מעכב יעד יונק of rapamycin (mTOR) 29,30, היה השפעה מתונה אך מובהקת סטטיסטית (איור 3 א, 3 ב ו -3 ג). FTY720 הוא אגוניסט קולטן 1-פוספט sphingosine המעכבת יציאה הלימפוציטים למחזור 31 ו נמצא לאחרונה לעכב TRPM7, ערוץ קטיון מבוטא בכמות גבוהה ב T לימפוציטים 32. שניהם FTY720 ו rapamycin היתה השפעה דומה על blastogenesis, צמצום זה מן הממוצע של גידול של 52% בקוטר של כ 34% (איור 3 א ו 3 ב). טראם-34 הוא חוסם של תעלות אשלגן המופעל סידן KCa3.1 33. נבדק ב 700 ננומטר, טראם-34 לא היה יעיל בתאי T בעכברים, אניn בהתאם מחקר התפשטות תאי T האנושיים אחרון; העוצמה שלה יכולה להיות תלויה באופי וכוח של גירוי mitogenic 34 (איור 3 א ו 3 ב). טראם-34 700 ננומטר היה יעיל בחסימת ערוצי KCa3.1 בניסויים electrophysiology מהדק תיקון שלנו (מידע לא מוצג). השוואה זו נעשתה בין מנוחה ותאים שנחשפו תרופה בניסוי מרובה באותו הניסוי ב 48 שעות. כאשר Rapamycin ו CSA שמש יחד, blastogenesis היה מופנם לחלוטין (איור 3 ג). הפעלה של תאים T בעכברים עם חרוזים מגנטיים אנטי CD3 / אנטי-מצופה-CD28 במשך 72 שעות המיוצר עלייה של 27% ב הקוטר הממוצע, אשר הופחת ל 5% בנוכחות של CSA (איור 3D). תאי mononuclear אדם באקטיבציה PMA / ionomycin במשך 48 שעות גדלו קוטר ב -33%, והפעלה בנוכחות של CSA ירד התגובה ל -23% ( <stron<html> g&gt; איור 4). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55212/55212fig1.jpg" /> איור 1: הפצות תדר של קטרי T-cell טחול Murine. (א) עמודות שחורות הצביע המנוחה ועמודות אדומות עולות PMA / ionomycin המופעל תאים (48 שעות). (ב) הפצות של תאי T הטחול מופעל על גבי תקן כיול גודל החלקיקים 8 מיקרומטר. (ג) הפצות של נח תאי T על גבי סטנדרט כיול 6 מיקרומטר. המספרים של תאים וחרוזים בשימוש מסומנים בקופסאות. (ד) חציון בקוטר נמדדת דלפק התא זמם נגד קוטר החרוז דיווח על ידי היצרן. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55212/55212fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <html> בתוך-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55212/55212fig2.jpg" /> איור 2: תלות של הפעלת תאי T בעכברים על ריכוז PMA. (א) בקטרים Mean של תאי T או מטופל או מטופלת עם 2, 50, ו 250 ng / ml PMA בכל ionomycin ריכוז קבוע (250 ננומטר). (ב) מדידות תא הדלפק של המנוחה והופעל (2, 50, 250 ng / ml PMA) תאי T בהעדר ונוכחות של CSA 300 ננומטר או 1 ננומטר FK506. (C) MTS assay התפשטות ב -50 ו -250 ng / ml PMA עם 250 ננומטר ionomycin בהעדר ונוכחות של 300 ננומטר CSA. הבדלים משמעותיים (p &lt;0.001) מסומן עם כוכביות. n הוא המספר הכולל של ניסויים. הממצאים מתוך תאים מבודדים מן 3 עכברים. (ד) בקטרים תא של המנוחה ותאי T מופעל (250 ng / ml PMA ו -250 ionomycin ננומטר) 12 שעות לאחר הפעלת בהעדר ונוכחות של CSA 300 ננומטר.<html> &quot;Target =&quot; pload / 55,212 / 55212fig2large.jpg _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55212/55212fig3.jpg" /> איור 3: השפעות של CSA, FK506, FTY720, rapamycin, וחשמלית-34 על גודל התא. (A ו- C) בקטרים ממוצעים של מנוחת PMA / ionomycin המופעל תאים בעכברים T בהעדר והנוכחות של תרופות. ריכוזים מוצגים בתיבה. (ב) נתונים מתוך מבוטא הגידול האחוז לעומת קוטר תאי T מנוחה. הפעלת לימפוציטים בוצעה עם 250 ng / ml PMA ו -250 ננומטר ionomycin, ואת המדידות נלקחו לאחר 48 שעות. (ד) מדידות דלפק תא של מנוחה אנטי CD3 / תאי T המופעל CD28, 72 שעות לאחר הפעלת בהעדר ונוכחות של CSA 300 ננומטר.rge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55212/55212fig4.jpg" /> איור 4: Blastogenesis ב PBMCs אדם על גירוי mitogen. (א) עמודות שחורות הצביע המנוחה ועמודות אדומות עולות PBMCs מופעל. (ב) בקטרים Mean של מנוחה PBMCs מופעל בהעדר ונוכחות של CSA 300 ננומטר. תאים הופעלו עם 250 ng / ml PMA ו -250 ננומטר ionomycin, ואת המדידות נלקחו לאחר 48 שעות של הפעלה. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55212/55212fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Column1 </td><td> מנוחה </td><td> מוּפעָל </td><td> CsA 100 ננומטר </td><td> CsA 200 ננומטר </td></tr><tr><td> קוטר ממוצע </td><td> 6.94 מיקרומטר </td><td> 9.78 מיקרומטר </td><td> 8.19 מיקרומטר </td><td> 7.92 מיקרומטר </td></tr><tr><td> עלייה ממוצעת קוטר </td><td></td><td> 40.92% </td><td> 17.88% </td><td> 14.09% </td></tr><tr><td> שטח פנים ממוצע </td><td> 151.37 μm² </td><td> 300.61 μm² </td><td> 210.56 μm² </td><td> 197.22 μm² </td></tr><tr><td> עלייה ממוצעת שטח פנים </td><td></td><td> 98.59% </td><td> 39.00% </td><td> 30.16% </td></tr></tbody></table> טבלה 1: סיכום של קוטר התא הממוצע ועליות יחסיות שטח פנים. מדידות בוצעו 48 שעות לאחר הפעלת עם 250 ng / ml PMA ו -250 ננומטר ionomycin.

מיטוגנזה של לימפוציטים מסוג T מלווה בטרנספורמציה בלסטוגנית, שבה נפח התא גדל לפני חלוקת התא. כאן, אנו מתארים שיטה לכימות בלסטוגנזה בלימפוציטים מסוג T באמצעות מונה תאים אוטומטי עם יכולת מדידת קוטר תאים.

כימות מהיר של Blastogenesis mitogen-Induced T לימפוציטים לזיהוי סמים המערכת החיסונית

Lymphocyte proliferation in response to antigenic or mitogenic stimulation is a readily quantifiable phenomenon useful for testing immunomodulatory (i.e., ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להעריך את הסמיכות של תרופות אימונומודולטוריות באמצעות סופר תאים אוטומטי, על ידי מדידה של בלאסטוגנזה או טרנספורמציה של בלאסטים של לימפוציטים T. בדיקה זו מספקת שיטה מהירה לכימות של אקטיבציה של לימפוציטים T באמצעות סופר תאים אוטומטי המצויד למדידת קטרי תאים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מדידה מהירה, פשוטה וישירה של תאים בודדים, בניגוד לבדיקות נפוצות של פרוליפרציה של לימפוציטים T.טיפול בלימפוציטים בתרופות אימונומודולטוריות יעלה או יוריד את הקצב וההיקף של בלאסטוגנזה תאית. באמצעות בדיקת ספירת תאים, ניתן למדוד את היקף הבלאסטוגנזה הזו תוך כארבע דקות לדגימה. בתוך עשר דקות מההקרבה, רססו את בטנו של העכבר ב-70 percent אתנול והשתמשו במספריים כדי לבצע חתך בפרווה ובעור בצדו השמאלי של בעל החיים.הרחק את העור הצידה ולאחור כדי לחשוף את הפריטונאום. לאחר מכן, מרח כלורהקסידין בריכוז 4% על אזור החתך. באמצעות סט שני של מספריים ופינצטה, בצע חיתוך של 2 עד 3 סנטימטרים לאורך מרכז הבטן כדי לפתוח את הפריטונאום.לאחר מכן, הסר את ההסנפות הוויסרליות ואת השומן העודף המקיף את הטחול והעבר את הרקמה לכלי עם DPBS. בשלב הבא, הוסף עשרה מיליליטר של מצע RPMI 1640 מלא לצCלחת תרבית של עשרה סנטימטרים ומעך את הטחולים בין שתי זכוכיות מיקרוסקופ מטופלות (frosted glass slides) שעברו סטריליזציה. סנן את תרחיל הרקמה דרך מסננת תאים מניילון סטרילית של 40 מיקרון אל תוך צלחת תרבית חדשה של עשה סנטימטרים כדי להסיר רקמות חיבור ופסולת, והעבר את תרחף התאים הבודדים לשפופרת קונית של 50 מיליליטר לצורך סנטריפוגה.השביו מחדש את המשקע ב-20 milliliters של באפר לליזיס של תאי דם אדומים. לאחר עשר דקות בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין, אספו את התאים על ידי סבב צנטריפוגציה נוסף והשביו מחדש את המשקע ב-ten milliliters של מצע טרי. לאחר מכן, צנטריפוגו את התאים שוב לצורך השביה מחדש ב-two milliliters של מצע מלא בטמפרטורה של 37 degree Celsius.כדי לטהר את תאי ה-T, יש לשטוף תחילה אחת עד שתיים מעמודי צמר ניילון עבור כל טחול פעמיים עם 5 mL של RPMI מלא, ולהניח את העמודים באינקובטור לתרביות תאים בטמפרטורה של 37 °C ובריכוז של 5% CO2 למשך שעה אחת. בסיום האינקובציה, טוענים 2 mL של תרחיף הספלנוציטים המבודד לחלק העליון של כל עמוד, ומאפשרים לתאים לעבור דרך העמוד עד שהנוזל מגיע לקצה הצמר. לאחר מכן, מוסיפים 2 mL של מצע מלא טרי בטמפרטורה של 37 °C לחלק העליון של העמודים, ומאפשרים למצע לעבור דרך צמר הניילון עד שהנוזל בראש העמוד מגיע לקצה הצמר.כעת כסו את הצמר בשלושה מיליליטרים של מצע מלא בטמפרטורה של 37 °C והחזירו את העמודה לאנקובטור לתרבית תאים, כדי לאפשר לתאי ה-B, לפיברובלסטים ולתאי העזר להיצמד לסיבי הצמר. לאחר שעה, בתוך מבחנה קונית חדשה של 50 מיליליטר, שטפו את העמודה פעמיים עם חמישה מיליליטרים של מצע מלא טרי כדי לשטוף החוצה את תאי ה-T שאינם נצמדים. לאחר מכן, אספו את התאים באמצעות סרכזגה.לאחר שטיפה אחת של תאי T בעזרת עשרה מיליליטרים של מצע מלא, השביה מחדש את המשקע בשני מיליליטרים של מצע מלא טרי. לאחר מכן, ספור את התאים ודלל את התמיסה לריכוז של 0.5 × 10⁶ תאים למיליליטר במצע מלא טרי, לצורך זריעה בלוח תרבית תאים בעל 6 או 24 בארות, בהתאם לדרישות הניסוי. בתוך 24 שעות מהבידוד, הפעל את תאי T שבודדו בעזרת עמודי nylon wool באמצעות הגירוי המתאים והתרופה הניסויית הרלוונטית.לאחר 12 עד 72 שעות, השתמשו בפיפט של מיליליטר אחד כדי לערבב בעדינות את התאים המטופלים והמופעילים כדי להסיר גושים. כדי למדוד את קטרי התאים באמצעות סופר תאים אוטומטי, העבירו מיליליטר אחד של התאים המטופלים מכל באר לכוסות דגימה נפרדות והניחו את כוסות הדגימה במתקן הדגימות (carousel) של סופר התאים האוטומטי. הזינו את מזהה הדגימה ומידע על סוג התא כדי לרשום את הדגימות והתחילו בהרצתן.לאחר ערבוב trypan blue עם תרחיף התאים, מעבירים את התאים על פני שדה דימוי עד לאיסוף של כ-100 תמונות תאים מכל דגימה. התוכנה משרטטת מעגל סביב כל תא מזוהה, צבוע או לא צבוע ב-trypan blue, כדי לקבוע את קוטר התא. כאשר כל התאים נמדדו, הנתונים מיוצאים לגיליון אלקטרוני המציג את התוצאות כספירת התאים הכוללת והחיונית עבור כל קוטר שנמדד.ניתן להציג את הנתונים כהיסטוגרמות. לאחר יומיים של גרייה באמצעות PMA ו-ionomycin, נצפה שינוי משמעותי בחציון של התפלגות התדירויות לכיוון קטרי תאים גדולים יותר, כאשר מספר תאי ה-T בעלי קטרים קטנים יותר פוחת בהתאם. בריכוז קבוע של 250 nanomolar של ionomycin, השפעתו של ה-PMA אינה משתנה באופן משמעותי עם העלאת ריכוז גירוי ההפעלה מ-2 ל-250 nanograms per milliliter.אין גם הבדל ניכר בשגשוג תאי ה-T שנצפה. תרופות מעכבות קלקינורין מדכאות באופן חלקי הן את בלאסטוגנזה והן את השגשוג של תאי T. טיפול בתאי T באמצעות תרכובות אימונוסופרסיביות המכוונות לגורם הגרעיני של קלקינורין בתאי T מופעלים מעכב את התגובה הבלאסטוגנית בכמעט 72 אחוזים.Rapamycin ו-FTY720 מראים השפעות מתונות אך מובהקות סטטיסטית על בלאסטוגנזה. לעומת זאת, נראה כי TRAM34 אינו משפיע על פרוליפרציה של תאי T עכבריים, אפילו בריכוזים של 700 nanomolar. כאשר משתמשים ב-rapamycin וב-cyclosporin A יחד, הבלאסטוגנזה נבלמת לחלוטין.תוצאות דומות נצפו בתאי T עכבריים שהופעלו באמצעות חרוזי מגנט המצומדים ל-anti-CD3 ו-anti-CD28. ניתן להשתמש במבחן זה כדי לכמת בהצלחה את ההשפעות של תרופות אימונומודולטוריות שונות, מה שמאפשר הערכה טובה יותר של עוצמת התרופה בהשוואה למבחני פרוליפרציה טיפוסיים, הכוללים גם תרומות של תאים אפופטוטיים ונקרוטיים. בשיטה זו, ניתן למדוד עד 15 דגימות בתוך ומחוץ למערכת, מה שמאפשר כימות סימולטני ועוקב של קצבי הבלסטוגנזה והפרוליפרציה כאחד.מדי פעם עלולות חדירה של בועות אוויר לתא הזרימה להפוך את המדידה לבלתי שמישה, לפיכך יש לבחון את כל התמונות לאיתור בועות אוויר לפני קבלת הנתונים מכל ניסוי לניתוח. מגבלה אחת של פרוצדורה זו היא שבמידה וישנם יותר מדי שברים (debris) בדגימה, המדידה עלולה להתייחס לשברים כתאים חיים. באמצעות התאמות מתאימות, ניתן להתאים בדיקה זו ללימוד שינויים בגודל התאים בנאוטרופילים ובהפטוציטים.

rapid-quantification-mitogen-induced-blastogenesis-t-lymphocytes-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים את ההקרנה של תרכובות אימונומודולטוריות באמצעות בדיקה מבוססת פלורסנט. לימפוציטים T שמקורם בעכבר מהונדס עם קלטות ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק מטופלים בתרכובות אלה. אותות ה-GFP המשופרים והמופחתים מאפשרים לזהות את ההשפעות הממריצות והמעכבות של התרכובות, בהתאמה.

בדיקה מבוססת פלואורסצנטיות המשתמשת בלימפוציטים מהונדסים לבדיקת תרכובות אימונומודולטוריות

הסרטון מדגים שיטה אימונולוגית לניטור in vivo adjuvant-induced cytotoxic T lymphocyte או CTL production. עכבר מוזרק מראש עם לימפוציטים CD8+ T מהונדסים גנטית, מוכתמים בצבע מתרבים. הזרקה תת עורית של אובלבומין עם אדג'ובנטים מייצרת לימפוציטים ציטוטוקסיים CD8+ T המזוהים לאחר הקציר באמצעות אימונוסטיין וציטומטריית זרימה.

טכניקה אימונולוגית לניטור יצירת לימפוציטים ציטוטוקסיים מסוג T בתיווך אדג'ובנטי

דורות רומן של מבחני פונקציונליים, כגון אינטרפרון גמא (IFN-γ) ELISPOT, אשר לזהות ייצור ציטוקינים ברמת התא הבודד ולספק גם אפיון כמוני ואיכותי של תגובות תא T יכולים לשמש כדי להעריך תגובה חיסונית בתיווך תא המכוון נגד אבעבועות רוח זוסטר וירוס (VZV).

פיתוח של חסינות ELISPOT Assay להעריך γ-IFN אבעבועות רוח, זוסטר וירוס ספציפי לתא בתיווך לאחר השתלת דם טבורים

לימפוציטים הם השחקנים העיקריים בתגובות חיסוניות נרכשות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול טיהור לימפוציטים כדי לקבוע את הפונקציות הפיזיולוגיות של המולקולות הרצויות בהפעלת לימפוציטים במבחנה וב-vivo. הליכי הניסוי המתוארים מתאימים להשוואת יכולות תפקודיות בין לימפוציטים בקרה ללימפוציטים מהונדסים גנטית.

בידוד ההפעלה של Murine לימפוציטים

אנו מציגים במחקר הנוכחי הוא assay קרינה מבוססת רומן באמצעות לימפוציטים נגזר עכבר מהונדס. Assay זה מתאים להקרנה תפוקה גבוהה (HTS) של מולקולות קטנות ניחן קיבולת אחד עיכוב או קידום ההפעלה הלימפוציטים.

Assay לימפוציטים הקרינה מבוסס מתאים להקרנה תפוקה גבוהה של מולקולות קטנות

אנו מציגים כאן יישום טכניקה סטנדרטית אימונולוגי (CFSE צבעונית OT-אני התפשטות) נועד לפקח במהירות בתיווך אדג'וונט ציטוטוקסיות לימפוציטים-T (CTL) דור ויוו. זו הערכה מהירה של CTL קיבולות שימושית עבור פיתוח חיסונים מניעתי נגד פתוגנים תאיים, כמו גם חיסונים נוגדי סרטן טיפולית.

מהירה In Vivo ובחינת יכולות הדור של לימפוציטים T ציטוטוקסיות של אדג'וונט לפיתוח חיסון

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מצפני ויוו תמים CD4 T התא (תא T) הפעלה, התפשטות, בידול Th1 המושרה על ידי מח העצם GM-CSF (מוניטור)-נגזר תאים דנדריטים (Dc). בנוסף, פרוטוקול זה מתאר בידוד מוניטור ו- T-cell דור DC, DC ו- T-cell העברה המאמצת.

מודל העכבר In Vivo הפעלת תא T CD4 תמים מידה, התפשטות של בידול Th1 הנגרם על ידי תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם

כאן, אנו מתארים את פרוטוקולי האימות גנטי וכימי של c-פוס, Dusp1 כמטרה סמים בלוקמיה באמצעות העכבר גנטי, humanized במבחנה ויוו מודלים. בשיטה זו ניתן ליישם כל מטרה עבור אימות הגנטי ופיתוח טיפולית.

שיטות להערכת את התפקיד של c-פוס, Dusp1 התלות אונקוגן

הציגו כאן הוא פרוטוקול למדידת תאים מתרבים CD4+ T בתגובה לחלבונים אנטיגניים או פפטידים באמצעות דילול צבען. שיטת הפעולה רגישה במיוחד לתאי T נדירים הספציפיים לאנטיגן וניתן לשנותם כדי להקל על השכפול של תאים ספציפיים לאנטיגן.

קוונפיקציה של מתרבים אנטיגן אנושי-ספציפי CD4+ T תאים באמצעות Carboxyפלואורומיתאת הדיקן אסתר

ניתן לחקור ביו-אנרגטיקה של תאי CD8 T באמצעות מבחן מאמץ מיטו. ניתן להשתמש במתודולוגיה זו כדי לחקור תכנות מטבולי אקוטי וכרוני. פרוטוקול זה מתאר גישות לבחינת הקשרים בין ביולוגיה של קולטני תאי T לניתוח ביו-אנרגטי.

מדידת תפקוד מיטוכונדריאלי של תאי CD8 T נאיביים ואפקטורים

אנו מתארים הליך להערכת היכולת של חומרים פרמקולוגיים לייצר תאים דנדריטיים טולרוגניים מתאים דנדריטיים נאיביים שמקורם במונוציטים במבחנה ולאמת את עוצמתם על ידי יצירת תאי T רגולטוריים אוטולוגיים.

שיטה פשוטה ויעילה לבדיקת חומרים אימונומודולטוריים ליצירת תאים דנדריטיים טולרוגניים ממונוציטים CD14+ אנושיים

למדו שיטה מהירה לכימות בלסטוגנזה של לימפוציטי T באמצעות מונה תאים אוטומטי. שיטה זו מאפשרת הערכת יעילות תרופות מעכבות חיסון בדגימות בודדות בתוך ארבע דקות.

כימות מהיר של Blastogenesis mitogen-Induced T לימפוציטים לזיהוי סמים המערכת החיסונית

גלה סרטונים נוספים