מסנן ראפיד הכנס מבוססת מערכת 3D תרבות התמיינות תאי ערמונית ראשית

המטרה הכוללת של מערכת תרבית תלת מימדית מבוססת מסנן זו עבור תאים ראשוניים שמקורם בחולה היא להקים מערכת מודל חוץ גופית רלוונטית יותר מבחינה ביולוגית לחקר סרטן הערמונית. על ידי שימוש בתאים אנושיים ראשוניים, שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה התפתחותית של הערמונית כמו גם בסרטן הערמונית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר במתודולוגיה מהירה יחסית במבחנה להקמת תאי ערמונית ראשוניים מובחנים המאפשרת גם בידוד מהיר של ביומולקולות כגון RNA, DNA וחלבון.

הדגמה חזותית של שיטות אלה היא קריטית מכיוון שעיבוד התאים על תוספת המסנן להיסטולוגיה או לאיסוף RNA וחלבונים הם עדינים ורגישים לזמן. כדי לעזור להגביל את הדיפוזיה בין התאים בארון בטיחות ביולוגי, יש למרוח שכבה דקה של 0.1% ג'לטין על הצד התחתון של התוספות ולאפשר להן להתייבש. חזור על הליך זה פעמיים נוספות.

לאחר מכן מרחו את התאים על החדר הפנימי של התוספות המצופות ג'לטין ותרבו אותם עד שבועיים. לאחר שבועיים החל את תוספות המסנן המתורבת ישירות על אחד היישומים המתאימים במורד הזרם המפורטים להלן. כדי להתחיל בהליך זה, שאפו PBS מהתא החיצוני והוציאו בזהירות PBS מהתא הפנימי.

ניתן לשמור את התוספות המתורבתות לזמן קצר ב-PBS עד שהמריחה מוכנה להתחיל, אך אינן מאפשרות לקרום להתייבש. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין EDTA לכל תא פנימי. לאחר מכן דגרו אותם במשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן מגרדים בקצרה ובזהירות את התאים על פני הממברנה בעזרת פיפטה של 200 מיקרוליטר תוך כדי פיפטה למעלה ולמטה. לאחר מכן דגרו אותם למשך דקה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר דקה אחת הוסף 250 מיקרוליטר של מדיה ממוזגת לתא הפנימי הראשון ופיפטה למעלה ולמטה בעדינות כדי לשטוף את המסנן.

לאחר מכן העבירו את התאים המרחפים לתא הסינון הסמוך המכיל את אותם תנאי מדיה וחזרו על הפיפטינג למעלה ולמטה. חזור על הליך זה עבור כל אחת מהתוספות של תנאי יחיד. לאחר מכן אוספים את התאים ומעבירים אותם לצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.

שטפו כל תא פנימי עם 100 עד 200 מיקרוליטר נוספים של מדיה ממוזגת כדי לאסוף את כל התאים שנותרו ולהוסיף אותם לצינור הצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן סובב את התאים במיקרו-צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר מכן שאפו את הסופרנטנט ושטפו את כדור התא פעם אחת עם 1,000 מיקרוליטר PBS.

סובב את התאים שוב במיקרו-צנטריפוגה בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות יש לשאוב את ה-PBS ולהקפיא את הדגימה במינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר. בהליך זה, הוסף 200 מיקרוליטר של גואנידיניום תיוציאנט, פנול, כלורופורם או מגיב מיצוי דומה לתא הפנימי וערבב לזמן קצר את התאים על פני הממברנה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.

לאחר מכן דגרו את התאים במגיב המיצוי למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר והשאירו את החדר החיצוני יבש. לאחר מכן שטפו את קרום המסנן על ידי פיפטינג של תמיסת החילוץ למעלה ולמטה. אסוף כמה שיותר ממגיב המיצוי על ידי הטיית צלחת שש הבארות ושאיבת כל נוזל שנותר.

שימו לב שהמסנן עלול להתנתק מהתוספת. שטפו את קרום המסנן המנותק אם הוא מחובר. לאחר מכן אסוף כמה שיותר מגיב המיצוי ופעל לפי פרוטוקול היצרן לטיהור ושחזור של DNA, RNA או חלבון.

יש לנקוט משנה זהירות בעת שטיפת התאים ולסנן עם גואנידיניום תיוציאנט מכיוון שתסיסה מוגזמת עלולה להניב RNA באיכות ירודה. על מנת לבודד חלבון מתוספת המסנן, הנח את תוספת המסנן בצלחת שש הבארות על קרח. לאחר מכן הוסף 10 מיקרוליטר של מאגר ליזה חלבון לתא הפנימי.

לערבב ולגרד את התאים על פני הממברנה בעזרת פיפטה של 20 מיקרוליטר תוך כדי פיפטה למעלה ולמטה והימנע מיצירת בועות במאגר הליזיס. לאחר מכן דגרו את צלחת שש הבארות עם תוספות פילטר על קרח למשך עשר דקות. חזור על הגירוד ולאחר מכן שטוף את משטח הממברנה עם מאגר הליזיס.

אוספים את הליזטים מששת התוספות ומעבירים אותם לצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר על קרח. לאחר מכן, שטפו את הממברנה הראשונה עם 10 מיקרוליטר נוספים של מאגר ליזה והעבירו אותה למסנן הבא. חזור על הליך זה עבור כל התוספות של מצב ניסוי נתון, אסוף כל תמיסת חיץ ליזה שיורית והוסף לצינור של 1.5 מיליליטר.

דגרו את הדגימה על קרח למשך חמש דקות נוספות. ואז סובב אותו במהירות מקסימלית למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בסיום, פיפטה את הליזאט לצינור טרי של 1.5 מילימטר.

לאחר מכן המשך לניתוח ריכוז החלבון או אחסן את הליזטים במינוס 80 מעלות צלזיוס. בהליך זה הוסף 500 מיקרוליטר ומיליליטר אחד של 10% NBF לתא הפנימי והחיצוני בהתאמה. דגרו אותם למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

למחרת שאפו NBF מהתא החיצוני והוסיפו מיליליטר אחד של ג'ל לעיבוד HEA לצינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. ממיסים לאט את האגרוז במיקרוגל באמצעות הספק נמוך וחוזרים על פעימות של 10 שניות עד שהאגרוז נמס. שמור את ה-HEA באמבטיה חמה של 37 מעלות צלזיוס כדי למנוע התמצקות עד שהוא מוכן לשימוש.

לאחר מכן הסר את NBF מהתא הפנימי. מרחו 25 מיקרוליטר של HEA מותך על החדר הפנימי ואפשרו לאגרוז להתמצק במשך שתיים עד חמש דקות. לאחר מכן הרטיבו שתי רפידות היסטולוגיות קצף ב-10% NBF והניחו פד אחד בקלטת הטבעה.

שמירה על שלמות שכבות התאים על תוספת המסנן באמצעות היסטוג'ל היא צעד קריטי לשימור שכבת התא השלמה לצורך חתך היסטולוגי. לאחר מכן השתמש באזמל להב מספר 11 כדי להבקיע את המסנן מהצד התחתון של תא הכנסת הפלסטיק, ושחרר אותו חלקית. מניחים 100-200 מיקרוליטר NBF בצלחת פטרי וטובלים את המסנן שנעקר חלקית ב-NBF.

בעזרת אזמל להב מספר 10, לחץ בעדינות על אמצע המסנן מהחלק הפנימי של תא ההכנסה כדי לעקור את המסנן במלואו מחבית ההכנסה. אם יש חלק כלשהו במסנן שעדיין מחובר לקנה, חתכו אותו עם האזמל. לאחר מכן חותכים את המסנן המצופה HEA לשניים.

הנח כל מחצית של המסנן על כרית הקצף בקלטת ההיסטולוגיה המוכנה. לאחר מכן הוסיפו את הספוג הספוג השני של 10% NBF לקלטת, וסנדוויץ' את המסנן. לאחר מכן, אטום את הקסטה.

מניחים אותו ב-NBF ומדגרים אותו למשך הלילה. תמונת שדה בהירה זו מציגה שכבות תאים רב-שכבתיות על גבי הממברנה הנקבובית. התמונות הפלואורסצנטיות הבודדות של גרעינים, P63 וקולטן האנדרוגן מוצגות, כמו גם המיזוג של כל שלושת סמני הקרינה.

לבסוף מוצג שדה בהיר מרוכב וכיסוי אימונופלואורסצנטי, המבסס את הלוקליזציה של האות הפלואורסצנטי ביחס לתאים ולמסנן. כאן מוצגת תמונת חתך רוחב של תוספת המסנן שלנו, בהשוואה לשכבות האפיתל הצינוריות של ערמונית שלמה. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבועיים, עם בידוד סופי של התאים והכנסת המסנן או הביו-מולקולה הרצויה, תוך פחות מ-30 דקות אם מבוצעת כראוי.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור תמיד לנקוט משנה זהירות בעת עבודה עם תוספות המסנן, כך שלא ייגרם נזק לשכבת התא או למסנן הבסיסי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון כתמים מערביים, מיקרו-מערך RNA וניתוחי פרוטאום על מנת לענות על שאלות נוספות הנוגעות לניתוח מסלולים ותאים סרטניים. טכניקה זו תעזור לסלול את הדרך לחוקרים בתחום סרטן הערמונית לחקור טוב יותר את הביולוגיה של הערמונית כמו גם את היסודות של סרטן הערמונית באמצעות תאי ערמונית ראשוניים.

לאחר צפייה בסרטון זה אמורה להיות לך הבנה מצוינת כיצד להגדיר ולשחזר כראוי תאי ערמונית ראשוניים מתורבתים ממערכת תרבית תלת מימדית זו.