התאוששות נייד באמצעות פרופילים תוכן גבוהה מיקרוסקופית
14 במאי 2017
מאמר זה מציג עבודה תוכן גבוהה מיקרוסקופ לכימות בו זמנית של רמות ROS תאיים, כמו גם פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריה ומורפולוגיה - המכונים במשותף כמו morphofunction המיטוכונדריה - בתאים חסיד חיים באמצעות מולקולרית פלואורסצנטי חוברת מולקולות כתב 5- (ו - 6) -כלורומיליל -2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, אסתר אצטיל (CM-H 2 DCFDA) ו tetramethylrhodamine methylester (TMRM).
המטרה הכוללת של שיטה מבוססת מיקרוסקופיה בעלת תוכן גבוה היא לכמת בו זמנית את התפקוד המיטוכונדריאלי ואת הרמות התאיות של מיני חמצן תגובתיים כדי ליצור טביעת אצבע חזקה של חמצון חיזור עבור קווי תאים החשופים להפרעות ניסיוניות שונות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה של חמצון חיזור כגון האם מצבים פתוגניים או טיפולים מורכבים מעוררים מתח חמצוני, ובאיזו מידה הצורה והתפקוד של המיטוכונדריה מושפעים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן למדוד את כל הפרמטרים באותו תא בו זמנית.
כדי להתחיל את ההליך, זרע שמונה עד 10,000 פיברובלסטים עוריים אנושיים ב-60 בארות פנימיות של צלחת שחורה של 96 בארות עם פוליסטירן רציף דק או תחתית זכוכית. בעת שימוש בתנאים, טיפולים או קווי תאים שונים, פזרו את מיקומי הזריעה שלהם בצורה הומוגנית על הצלחת כדי למזער את השפעות הצלחת. לאחר מכן, זרעו עוד שמונה עד 10,000 תאים בבאר B01 שישמשו להתאמת המיקוד.
לאחר מכן, מלאו את הבארות החיצוניות הריקות במדיום כדי למזער את השיפועים בין הבארות לסביבה. הקש בעדינות על הצלחת שלוש פעמים לפני שתחזיר אותה לאינקובטור כדי למנוע מהתאים לצמוח בכתמים. תרבית התאים למשך 24 שעות, או עד שהם מגיעים למפגש של 70%.
לאחר מכן, שמור את המידע הטיפולי עבור הניסוי בגיליון אלקטרוני הנקרא הגדרה. כדי להגדיר את המיקרוסקופ, כייל תחילה את ה-XYTAGה באמצעות התוכנה. לאחר מכן, צור פרוטוקול הדמיה עבור צלחת מרובת בארות באמצעות תוכנת הרכישה.
פרוטוקול זה מאפשר רכישה אוטומטית של מיקומים מוגדרים ובארות נבחרות של צלחת 96 בארות. כעת, בחר את הסוג הנכון של צלחת מרובת בארות מתוך רשימה של לוחות זמינים המסופקים בתוכנה. לחלופין, הגדר את פורמט הצלחת מרובת הבארות באמצעות מידות הצלחת והבאר.
לאחר מכן, יישר את לוחית הבאר על ידי הגדרת שתי פינות של ארבע בארות הפינה החיצוניות. לאחר מכן, בחר את הבארות שצריך לרכוש, והגדר פרוטוקול רכישה המורכב מרכישת אורך גל רציף. ודא שערוץ ה-GFP מוגדר תחילה.
לאחר מכן, הגדר לולאת לוח באר כדי לרכוש ארבע תמונות במרווחים קבועים ללא חפיפה הממוקמות סביב מרכז כל באר שנבחרה באמצעות פרוטוקול הרכישה המוגדר. בשלב זה, הכינו את תמיסת הצביעה ל-60 בארות על ידי הוספת תמיסת מלאי CM-H2DCFDA ו-TMRM למאגר HBSS HEPES. לאחר מכן, השליכו את מדיום התרבית מהתאים על ידי הפיכת הצלחת בתנועה נוזלית אחת.
שטפו בעדינות את התאים פעמיים עם מאגר HH. אל תשכח היטב את A01 עם התאים המשמשים להתאמת מיקוד. השלך את מאגר ה-HH בין שלבי הכביסה.
לאחר מכן, טען את התאים ב-CM-H2DCFDA ו-TMRM על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של תמיסת הצביעה לכל באר. שוב, אל תשכח היטב את A01. דגרו על התאים למשך 25 דקות בחושך בטמפרטורת החדר.
לאחר 25 דקות, שטפו את התאים פעמיים עם 100 מיקרוליטר של מאגר HH והוסיפו 100 מיקרוליטר של מאגר HH לכל 60 הבארות הפנימיות. כדי לבצע את המדידה בפועל, התקן את הצלחת על המיקרוסקופ. לאחר מכן, הפעל את מערכת המיקוד האוטומטי מבוססת החומרה והתאם את היסט המיקוד האוטומטי באמצעות באר B01 וערוץ TMRM עד לקבלת תמונה חדה.
לאחר מכן, הפעל את פרוטוקול ההדמיה. מערך נתוני התמונה שיתקבל יספק מידע על רמות ROS בסיסיות, פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית ומורפולוגיה מיטוכונדריאלית. לאחר מכן, כדי למדוד את רמות ה-ROS המושרות, הסר בזהירות את צלחת 96 הבאר מהמיקרוסקופ.
הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת TBHP ב-40 מיקרומולר לכל באר והמתן לפחות שלוש דקות כדי לאפשר תגובה מלאה של ה-TBHP עם ה-CM-H2DCFDA. במהלך תקופה זו, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת הנוגדן לבאר A01. כעת, הרכיבו את הצלחת בחזרה על המיקרוסקופ ובדקו שוב את המיקוד באמצעות באר B01.
לאחר מכן, רכוש את אותן עמדות כמו בסבב ההדמיה הראשון באמצעות אותו פרוטוקול הדמיה. מערך נתוני התמונה המתקבל יספק מידע על רמות ה-ROS המושרות. לאחר מכן, רכוש תמונות שדה שטוח בבאר A01.
ודא שהאותות נמצאים היטב בטווח הדינמי. על ידי התאמת הגדרות הרכישה. לאחר מכן, ייצא את מערכי הנתונים שנרכשו בתיקיה אחת כקבצי TIFF בודדים באמצעות מינוח סטנדרטי.
זה כולל התייחסות לצלחת, לפני או אחרי טיפול TBHP, באר, שדה וערוץ המופרדים על ידי קווים תחתונים. כמו כן, שמור את תמונות השדה השטוח באותה תיקייה כמו קובצי TIFF בודדים באמצעות המינוח הסטנדרטי. בשלב זה, פתח את תוכנת עיבוד התמונה והתקן ערכת מאקרו של מדדי חיזור.
לאחר מכן, פתח את ממשק ההתקנה כדי להגדיר את הגדרות הניתוח על ידי לחיצה על כפתור S. בחר את סוג התמונה, את מספר הערוצים ואת הבאר ששימשה לרכישת תמונות השדה השטוח. לאחר מכן, ציין איזה ערוץ מכיל תאים או מיטוכונדריה.
סמן את תיבות הסימון של הרקע ושפר כדי לבצע השוואת היסטוגרמה אדפטיבית מוגבלת ברקע וניגודיות בהתאמה. לאחר מכן, הגדירו סיגמא לגאוס וטשטוש התאים ושיפור הלפלסיאני של המיטוכונדריה. בחר אלגוריתם סף אוטומטי ומלא את מגבלות אי-הכללת הגודל.
לאחר מכן, בדוק את הגדרות הפילוח בכמה תמונות נבחרות של מערכי הנתונים שנרכשו על ידי פתיחתן ולחיצה על כפתורי C או M בתפריט לפילוח תאים או מיטוכונדריה בהתאמה. לאחר מכן, מניתוח האצווה בתיקיה המעניינת על ידי לחיצה על כפתור ה-hash ובחירת התיקיה עם התמונות. אמת את ההגדרות ולחץ על אישור.
לאחר ניתוח האצווה, אמת חזותית את ביצועי הפילוח בערימת אימות על ידי לחיצה על כפתור V ובחירת התיקיה עם תמונות. עברו על מחסנית האימות כדי לוודא אם הפילוח הצליח. ניתוח ראשוני של הנתונים שחולצו נעשה באופן אוטומטי עם אפליקציה מבריקה חינם.
זה מאפשר פרשנות מהירה של התוצאות. כדי להתחיל, פתח את היישום ב-R Studio. בחר להפעיל אותו בדפדפן חיצוני.
בדף הקלט, בחר את הספרייה שבה ממוקמים קבצי התוצאות. ודא שקובץ ההתקנה קיים גם בספרייה זו. קובצי התוצאות ונתוני ההתקנה מיובאים, מהודרים ומוצגים באופן אוטומטי.
דף הגדרת הניסוי מציג את פריסת הניסוי. העמוד הבא מציג רמות ROS וכן מספר פרמטרים מיטוכונדריאלים עבור כל צלחת בנפרד. בחר את הצלחת שברצונך לדמיין באמצעות התפריט הנפתח.
הנתונים מוצגים בפורמט צלחת מרובת בארות, כמו גם בעלילות קופסאות עם חריגים המסומנים בבאר ומספר תמונה. דף התוצאות כולו של הניסוי מציג את התוצאות המנורמלות מכל הלוחות ביחד, יחד עם ניתוח סטטיסטי בסיסי. אם קובץ שחרור מסופק דרך דף הקלט, נקודות הנתונים שצוינו לא ייכללו.
בדף ניתוח האשכולות מורכב פרופיל חמצון חיזור רגיש באמצעות רכיב עיקרי וניתוח נתונים מחמישה פרמטרים. לבסוף, דף נתוני ההורדה מאפשר שמירת הנתונים המעובדים והמסודרים מחדש לשימוש נוסף. מוצגות כאן תוצאות מניסוי שבו פיברובלסטים עוריים אנושיים טופלו במעכב פרוטאז HIV Saquinavir.
באמצעות הפרוטוקול המתואר, זוהתה עלייה משמעותית הן ברמות ה-ROS הבסיסיות והן ברמות ה-ROS המושרה. בהשוואה לתאי הביקורת, שטופלו ב-DMSO. Saquinavir השפיע באופן משמעותי גם על תפקוד המורפו-המיטוכונדריה.
פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית שנמדד כאשר אות ה-TMRM הממוצע לפיקסל מיטוכונדריאלי גדל משמעותית. בנוסף, המיטוכונדריה רכשה דפוס מקוטע מאוד, המסומן כמותית על ידי מעגליות גבוהה יותר וגודל ממוצע קטן יותר של מיטוכונדריה בודדת. כאשר משלבים את הפרמטרים הנ"ל באמצעות ניתוח רכיבים עיקריים, ניתן היה להפריד בבירור הן את תנאי הבקרה והן את תנאי Saquinavir זה מזה על ידי טביעות האצבע של חמצון החיזור שלהם.
בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שהתאורה עצמה גורמת למתח מחומצן. לכן, יש למזער את תנאי החשיפה ולשמור עליהם קבועים לאורך כל הניסוי. לאחר השליטה, ניתן להכתים ולרכוש עד 20 96 צלחות באר ביום אחד.
לאחר סבב ההדמיה השני, ניתן לתקן את התאים ולהשתמש בהם לצביעה אימונו-פלואורסצנטית במורד הזרם. זה מגדיל את מספר הפרמטרים הנמדדים באותם תאים בדיוק, ומאפשר לענות על שאלות נוספות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל לבצע את המדידות המשולבות של ROS ותפקוד מיטוכונדריאלי בתרביות תאים דבקות באמצעות מיקרוסקופיה בעלת תוכן גבוה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג זרימת עבודה של מיקרוסקופיה בעלת תוכן גבוה לכימות סימולטני של רמות ROS תוך תאיים ומורפופונקציה של מיטוכונדריה בתאים נאחזים חיים. השיטה ממנפת מולקולות רפוטר פלואורסצנטיות חדירות לתאים כדי להשיג זאת.
מרכיבי הלימוד העיקריים
תחום המדע
- נוירו-מדע
- ביולוגיית תאים
- ביולוגיית רדוקס
רקע
- מינים תגובתיים של חמצן (ROS) ממלאים תפקיד קריטי באיתות תאי ובאיזון.
- תפקוד מיטוכונדריה קשור קשר הדוק לעומס חמצוני ולבריאות תאית.
- הבנת מורפופונקציה של מיטוכונדריה יכולה לספק תובנות לגבי מצבים פתולוגיים שונים.
- מיקרוסקופיה בעלת תוכן גבוה מאפשרת ניתוח מפורט של פרמטרים תאיים בזמן אמת.
מטרת המחקר
- לייצר טביעת אצבע רדוקס יציבה לקווי תאים בתנאי ניסוי שונים.
- לחקור את ההשפעות של תנאים פתוגניים או טיפולים על עומס חמצוני.
- למדוד צורה ותפקוד מיטוכונדריאלי בו זמנית בתוך אותו תא.
שיטות בהן נעשה שימוש
- זרימת עבודה של מיקרוסקופיה בעלת תוכן גבוה לכימות ROS ופרמטרים של מיטוכונדריה.
- שימוש במולקולות רפוטר פלואורסצנטיות CM-H2DCFDA ו-TMRM.
- זריעת פיברובלסטים עוריים אנושיים בצלחת 96 בארות לצורך ניתוח.
- התאמת פוקוס באמצעות אוכלוסיית תאים נפרדת בניסוי.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת מדידה סימולטנית של רמות ROS ותפקוד מיטוכונדריאלי.
- היא מספקת תובנות לגבי האופן שבו טיפולים שונים משפיעים על עומס חמצוני תאי.
- ניתן להעריך את כל הפרמטרים בתוך אותו תא, תוך שיפור מהימנות הנתונים.
- מקימה מסגרת למחקרים עתידיים בביולוגיית רדוקס.
מסקנות
- שיטת מיקרוסקופיה בעלת תוכן גבוה זו יעילה ללימוד מורפופונקציה מיטוכונדרית.
- ניתן להשתמש בה כדי להבהיר את הקשר בין עומס חמצוני לבריאות מיטוכונדרית.
- הגישה בעלת ערך עבור חוקרים החוקרים ביולוגיית רדוקס בהקשרים שונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This high-content microscopy method enables simultaneous quantification of intracellular ROS levels and mitochondrial morphofunction, providing a robust redox fingerprint for cellular health assessment. By measuring multiple parameters within the same cell, it enhances predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking during early discovery. The approach supports data-driven go/no-go decisions by linking oxidative stress responses to mitochondrial function in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by establishing redox fingerprints that differentiate cellular states after chemical perturbation.
- Operational Value: Enables functional target validation through correlated ROS and mitochondrial membrane potential measurements in live cells.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by detecting subpopulation heterogeneity via multivariate analysis of ROS, mitochondrial morphology, and membrane potential.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows using automated widefield fluorescence microscopy in multi-well plates.
- Quantitative Outputs: Delivers high spatiotemporal resolution data on basal and induced ROS levels, mitochondrial membrane potential, and morphology for compound screening.
- Platform Reuse: Enables scalable, reproducible screening campaigns with standardized image acquisition and analysis protocols across cell lines and treatments.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses human dermal fibroblasts to model oxidative stress responses, providing a translatable system for preclinical target validation.
- Mechanistic De-risking: Links compound-induced ROS elevation to mitochondrial fragmentation and membrane potential changes, clarifying pathophysiological interconnections.
- Translational Continuity: Supports risk-adjusted advancement decisions by generating multivariate redox profiles that correlate with cellular health outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, enabling mechanistic de-risking before preclinical investment by establishing causal links between redox state and mitochondrial function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how pathogenic conditions or treatments affect oxidative stress and mitochondrial form/function in the same cell.
- Screening: Delivers assay readiness through automated acquisition of ROS and mitochondrial parameters, ensuring reproducible quantitative outputs for compound evaluation.
- Analytics: Enables statistical comparison of conditions via principal component analysis on five parameters, generating sensitive redox profiles for subpopulation discrimination.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by aligning redox fingerprints with mitochondrial morphofunction changes relevant to pathological conditions.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for redox profiling across diverse adherent cell types, reducing redundant assay development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through simultaneous ROS and mitochondrial measurement.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via automated microscopy and standardized image analysis workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking oxidative stress biomarkers to mitochondrial health, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through multivariate redox profiling that detects treatment-induced cellular state changes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in high-content microscopy, fluorescent probe handling, and image-based data analysis.
- Needs widefield fluorescence microscopy with environmental control, autofocus, and multi-well plate compatibility.
- Demands cross-team standardization of staining protocols, acquisition settings, and analysis macros for reproducible results.
- Involves adaptation considerations for non-adherent or primary cell types beyond human dermal fibroblasts.
- Includes practical limitations such as phototoxicity from illumination, necessitating minimized and constant exposure conditions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
10:38
Conclusion
9:35
Results: Effect of Saquinavir on Primary Human Fibroblasts
0:47
Seeding Cells in a 96-well Plate
1:48
Setting Up the Microscope and Acquisition Protocol
3:10
Loading of the Cells with CM-H2DCFDA and TMRM
4:18
First and Second Live Imaging Rounds
6:22
Image Processing and Analysis
