התאוששות נייד באמצעות פרופילים תוכן גבוהה מיקרוסקופית
14 במאי 2017
מאמר זה מציג עבודה תוכן גבוהה מיקרוסקופ לכימות בו זמנית של רמות ROS תאיים, כמו גם פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריה ומורפולוגיה - המכונים במשותף כמו morphofunction המיטוכונדריה - בתאים חסיד חיים באמצעות מולקולרית פלואורסצנטי חוברת מולקולות כתב 5- (ו - 6) -כלורומיליל -2 ', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, אסתר אצטיל (CM-H 2 DCFDA) ו tetramethylrhodamine methylester (TMRM).
המטרה הכללית של שיטה זו, המבוססת על מיקרוסקופיה בעלת תוכן גבוה (high-content microscopy), היא לכמת בו-זמנית את המורפופונקציה המיטוכונדריאלית ואת הרמות התאיות של רדיקלים חופשיים של חמצן (reactive oxygen species), כדי לבסס טביעת אצבע רדוקסית (redox fingerprint) חזקה עבור שורות תאים החשופות להפרעות ניסיוניות שונות. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בביולוגיה של רדוקס, כגון האם מצבים פתוגניים או טיפולים בתרכובות מעוררים עקה חמצונית, ובאיזו מידה המבנה והתפקוד המיטוכונדריאליים מושפעים מכך. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן למדוד את כל הפרמטרים בתוך אותו התא ובאותו זמן.
כדי להתחיל את הפרוצדורה, זרעו 8,000 עד 10,000 פיברובלסטים של עור אנושי ב-60 בארות פנימיות של פלטת 96 בארות שחורה בעלת תחתית דקה ורציפה מפוליסטירן או זכוכית. בעת שימוש בתנאים, טיפולים או קווי תאים שונים, פזרו את מיקומי הזריעה שלהם באופן הומוגני על הפלטה כדי למזער את השפעות הפלטה. לאחר מכן, זרעו 8,000 עד 10,000 תאים נוספים בבאר B01 לשימוש לצורך כיוון פוקוס.
בשלב הבא, מלאו את הבארים החיצוניות הריקות במצע כדי למזער את המדרגות שבין הבארים לסביבה. הקישו בעדינות על הפלטה שלוש פעמים לפני החזרתה לדגירה כדי למנוע מהתארגנות התאים בכתמים. גדלו את התאים למשך 24 שעות, או עד שיגיעו ל-70%confluency.
לאחר מכן, שמרו את פרטי הטיפול עבור הניסוי בגיליון אלקטרוני בשם setup. כדי להגדיר את המיקרוסקופ, כוילו תחילה את במת ה-XY באמצעות התוכנה. לאחר מכן, צרו פרוטוקול דימיג עבור פלטה רב-בארים באמצעות תוכנת הרכישה.
פרוטוקול זה מאפשר רכישה אוטומטית של מיקומים מוגדרים ובארות נבחרות בלוח של 96 בארות. כעת, בחרו את הסוג המתאים של לוח הרב-בארות מרשימת הלוחות הזמינים המסופקת בתוכנה. לחלופין, הגדירו את פורמט לוח הרב-בארות באמצעות מידות הלוח והבארות.
לאחר מכן, יישרו את פלטת הבארות על ידי הגדרת שתי פינות מתוך ארבע הבארות שבפינות החיצוניות. לאחר מכן, בחרו את הבארות שיש לרכוש מהן נתונים, והגדירו פרוטוקול רכישה המורכב מרכישת אורכי גל רצופים. ודאו שערוץ ה-GFP מוגדר ראשון.
לאחר מכן, הגדירו לולאת פלטת בארות (well plate loop) כדי לרכוש ארבע תמונות ללא חפיפה, במרווחי זמן קבועים, הממוקמות מסביב למרכזו של כל באר שנבחרה, תוך שימוש בפרוטוקול הרכישה שהוגדר. בשלב זה, הכינו את תמיסת הצביעה עבור 60 בארות על ידי הוספת תמיסות מלאי של CM-H2DCFDA ו-TMRM לתמיסת HBSS HEPES buffer. לאחר מכן, השליכו את מצע התרבית מהתאים על ידי הפיכת הפלטה למצב הפוך בתנועה אחת רציפה.
שטפו בעדינות את התאים פעמיים עם באפר HH. אל תשכחו את באר A01 עם התאים ששימשו לכוונון המיקוד. השליכו את באפר HH בין שלבי השטיפה.
לאחר מכן, טענו את התאים ב-CM-H2DCFDA וב-TMRM על ידי הוספת 100 microliters של תמיסת הצביעה לכל באר. שוב, אל תשכחו את באר A01. דגרו את התאים למשך 25 דקות בחשכה בטמפרטורת החדר.
לאחר 25 דקות, שטפו את התאים פעמיים עם 100 µL של HH buffer והוסיפו 100 µL של HH buffer לכל 60 הבארים הפנימיים. כדי לבצע את המדידה בפועל, התקינו את הפלטה במיקרוסקופ. לאחר מכן, הפעילו את מערכת המיקוד האוטומטי (autofocus) מבוססת החומרה וכווננו את ה-autofocus offset באמצעות באר B01 וערוץ ה-TMRM עד לקבלת תמונה חדה.
לאחר מכן, הרץ את פרוטוקול הדימיון. מערך נתוני הדימיון שיתקבל יספק מידע על רמות ROS בסיסיות, פוטנציאל ממבנית המיטוכונדריה ומורפולוגיה מיטוכונדריאלית. כעת, כדי למדוד את רמות ה-ROS המושרות, הוצא בזהירות את פלטת 96 הבארים מהמיקרוסקופ.
הוסיפו 100 µL של תמיסת TBHP בריכוז 40 µM לכל באר והמתינו לפחות שלוש דקות כדי לאפשר תגובה מלאה של ה-TBHP עם ה-CM-H2DCFDA. במהלך זמן זה, הוסיפו 100 µL של תמיסת העבודה של הנוגדן לבאר A01. כעת, החזירו את הפלטה למיקרוסקופ ובדקו שוב את המיקוד באמצעות באר B01.
לאחר מכן, רכשו את אותן העמדות כפי שבוצע בסבב הדמיון הראשון תוך שימוש באותו פרוטוקול דמיון. מערך נתוני התמונות המתקבל יספק מידע על רמות ה-ROS שהשראו. לאחר מכן, רכשו תמונות שדה שטוח (flat field) בבאר A01.
יש לוודא שהאותות נמצאים היטב בתוך הטווח הדינמי, על ידי התאמת הגדרות הרכישה. לאחר מכן, יש לייצא את מערכי הנתונים שנרכשו לתיקייה אחת כקבצי TIFF נפרדים, תוך שימוש בנומנקלטורה סטנדרטית.
זה כולל התייחסות לפלטה, לפני או אחרי טיפול ב-TBHP, באר, שדה וערוץ המופרדים על ידי קווים תחתונים. כמו כן, שמרו את תמונות השדה השטוח (flat field) באותה תיקייה כקבצי TIFF בודדים תוך שימוש במינוח הסטנדרטי. בשלב זה, פתחו את התוכנה לעיבוד תמונות והתקינו את סט המאקרו למדדי חמצון-חיזור (redox metrics).
לאחר מכן, פתחו את ממשק ההגדרה כדי לקבוע את הגדרות הניתוח על ידי לחיצה על כפתור ה-S. בחרו את סוג התמונה, מספר הערוצים ואת הבאר ששימשה לרכישת תמונות השטח השטוח (flat field). לאחר מכן, ציינו באיזה ערוץ נמצאים התאים או המיטוכונדריה.
סמנו את תיבות הסימון של background ו-enhance כדי לבצע הפחתת רקע והשוואת היסטוגרמה אדפטיבית מוגבלת ניגודיות (CLAHE), בהתאמה. לאחר מכן, הגדירו sigma עבור טשטוש גאוסיאני של התאים והגברה לפלאסיינית של המיטוכונדריה. בחרו אלגוריתם לסף אוטומטי ומלאו את גבולות הדירוג לפי גודל (size exclusion limits).
לאחר מכן, יש לבחון את הגדרות הסגמנטציה על מספר תמונות נבחרות מתוך מערכי הנתונים שנרכשו, על ידי פתיחת התמונות ולחיצה על כפתורי C או M בתפריט עבור סגמנטציה של תאים או מיטוכונדריה, בהתאמה. לאחר מכן, בצעו ניתוח אצומה (batch analysis) על התיקייה הרלוונטית על ידי לחיצה על כפתור הסולמית ובחירת התיקייה המכילה את התמונות. ודאו את ההגדרות ולחצו על אישור.
לאחר ניתוח הסדרה, ודאו ויזואלית את ביצועי הסגמנטציה בערימה של אימות על ידי לחיצה על כפתור V ובחירת התיקייה עם התמונות. עברו על ערימת האימות כדי לאשר אם הסגמנטציה הצליחה. ניתוח ראשוני של הנתונים שחולצו מבוצע באופן אוטומטי באמצעות אפליקציית Shiny נלווית.
דבר זה מאפשר פרשנות מהירה של התוצאות. כדי להתחיל, פתחו את האפליקציה ב-R Studio. בחרו להריץ אותה בדפדפן חיצוני.
בעמוד הקלט, בחר את הספריה שבה נמצאים קבצי התוצאות. ודא שקובץ ההגדרות נמצא גם הוא בספריה זו. קבצי התוצאות ומידע ההגדרות מיובאים, מקומפלים ומוצגים באופן ויזואלי באופן אוטומטי.
דף הגדרת הניסוי מציג את פריסת הניסוי. הדף הבא מציג את רמות ה-ROS וכן מספר פרמטרים מיטוכונדריאליים עבור כל פלטה בנפרד. בחרו את הפלטה שברצונכם להציג באמצעות התפריט הנפתח.
הנתונים מוצגים בפורמט של פלטת בארות רב-בארית, וכן בתרשימי קופסה (box plots) שבהם נקודות חריגות מסומנות באמצעות מספר הבאר ומספר התמונה. דף תוצאות הניסוי המלא מציג את התוצאות הנורמליזציה מכל הפלטות המשולבות, יחד עם ניתוח סטטיסטי בסיסי. אם סופק קובץ השמטות (drop file) דרך דף הקלט, נקודות הנתונים שצוינו יוחרגו.
בדף ניתוח האשכולות (cluster analysis), נוצר פרופיל רדוקס רגיש באמצעות רכיב עיקרי וניתוח של נתונים מחמישה פרמטרים. לבסוף, דף הורדת הנתונים מאפשר שמירה של הנתונים המעובדים והמסודרים לשימוש עתידי. מוצגים כאן תוצאות מניסוי שבו פיברובלסטים עוריים אנושיים טופלו במעכב הפרוטאז של HIV, Saquinavir.
בשימוש בפרוטוקול המתואר, זוהתה עלייה משמעותית הן ברמות ה-ROS הבסיסיות והן ברמות ה-ROS המושרות, בהשוואה לתאי הבקרה שטופלו ב-DMSO. Saquinavir השפיע באופן משמעותי גם על המורפופונקציה המיטוכונדריאלית.
פוטנציאל ממברנת המיטוכונדריה, שנמדד כאות TMRM ממוצע לכל פיקסל מיטוכונדריאלי, עלה באופן משמעותי. בנוסף, המיטוכונדריה אימצו תבנית שבורה (fragmented) מאוד, שהתבטאה כמותית בעגוליות גבוהה יותר ובגודל ממוצע קטן יותר של מיטוכונדריה בודדות. כאשר שילבו את הפרמטרים שהוזכרו לעיל באמצעות ניתוח רכיבים ראשיים (principal component analysis), ניתן היה להבחין בבירור בין תנאי הבקרה לתנאי ה-Saquinavir על סמך טביעות האצבע החמצוניות-חיצוניות (redox fingerprints) שלהם.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שההארה עצמה גורמת לעקה חמצונית. לפיכך, יש למזער את תנאי החשיפה ולשמור אותם קבועים לאורך כל הניסוי. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לצבוע ולדגום עד 20 פלטות של 96 בארות ביום אחד.
בעקבות סבב הדימוג השני, ניתן לקבע את התאים ולהשתמש בהם לצביעה אימונופלואורסצנטית בהמשך. דבר זה מגדיל את מספר הפרמטרים הנמדדים באותם תאים בדיוק, ומאפשר להשיב על שאלות נוספות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להיות מסוגלים לבצע מדידות משולבות של ROS ותפקוד-מורפולוגיה מיטוכונדריאלית בתרביות תאים נצמדות באמצעות מיקרוסקופיה בעלת תוכן גבוה (high-content microscopy).
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג תהליך עבודה של מיקרוסקופיה בעלת תוכן גבוה (high-content microscopy) לכימות סימולטני של רמות ROS תוך-תאיות ותפקוד מורפולוגי של מיטוכונדריה בתאים דבקים חיים. השיטה משתמשת במולקולות דשיישות פלואורסצנטיות חודרות תאים כדי להשיג זאת.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה של רדוקס
רקע
- מינים של חמצן ריאקטיבי (ROS) ממלאים תפקיד קריטי באיתות תאי ובהומיאוסטזיס.
- התפקוד המיטוכונדריאלי קשור קשר הדוק לעקה חמצונית ולבריאות התא.
- הבנת המורפופונקציה המיטוכונדריאלית יכולה לספק תובנות לגבי מצבים פתולוגיים שונים.
- מיקרוסקופיה בעלת תוכן גבוה (High-content microscopy) מאפשרת ניתוח מפורט של פרמטרים תאיים בזמן אמת.
מטרת המחקר
- להקמת טביעת אצבע רדוקס (redox) חזקה עבור שורות תאים תחת תנאים ניסויים שונים.
- לבדיקת ההשפעות של תנאים פתוגניים או טיפולים על עקה חמצונית.
- למדידה סימולטנית של צורה ותפקוד מיטוכונדריאליים בתוך אותו תא.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תהליך עבודה של מיקרוסקופיה בעלת תוכן גבוה (High-content microscopy) לכימות ROS ופרמטרים מיטוכונדריאליים.
- שימוש במולקולות דיווח פלואורסצנטיות CM-H2DCFDA ו-TMRM.
- זריעה של פיברובלסטים עוריים אנושיים בלוח 96 בארות לצורך ניתוח.
- כיוון פוקוס באמצעות אוכלוסיית תאים נפרדת בניסוי.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת מדידה סימולטנית של רמות ROS ותפקוד מיטוכונדריאלי.
- היא מספקת תובנות לגבי האופן שבו טיפולים שונים משפיעים על עקה חמצונית תאית.
- ניתן להעריך את כל הפרמטרים בתוך אותו התא, דבר המשפר את מהימנות הנתונים.
- השיטה מקימה מסגרת למחקרים עתידיים בביולוגיה של רדוקס.
מסקנות
- שיטה זו של מיקרוסקופיה בעלת תוכן גבוה (high-content microscopy) יעילה לבחינת המורפופונקציה של מיטוכונדריה.
- היא יכולה לסייע בהבהרת הקשר שבין עקה חמצונית לבריאות המיטוכונדריה.
- גישה זו בעלת ערך עבור חוקרים הבוחנים ביולוגיה של רדוקס בהקשרים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסגרת ניהולית
שיטה זו של מיקרוסקופיה בעלת תוכן גבוה (high-content microscopy) מאפשרת כימות סימולטני של רמות ROS תוך-תאיים ושל המורפופונקציה המיטוכונדריאלית, ובכך מספקת "טביעת אצבע" רדוקסית חסונה להערכת בריאות התא. על ידי מדידת פרמטרים מרובים בתוך אותו תא, השיטה מגבירה את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים במהלך שלבי הגילוי המוקדמים. גישה זו תומכת בקבלת החלטות go/no-go מבוססות נתונים, על ידי קישור תגובות למעקה חמצוני לתפקוד מיטוכונדריאלי במערכות הרלוונטיות למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות באמצעות ביסוס "טביעות אצבע" של רדוקס המבדילות בין מצבים תאיים לאחר הפרעה כימית.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף של מטרות פונקציונליות באמצעות מדידות מתואמות של ROS ופוטנציאל ממבצת המיטוכונדריה בתאים חיים.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי זיהוי הטרוגניות של תתי-אוכלוסיות באמצעות ניתוח רב-משתני של ROS, מורפולוגיה מיטוכונדריאלית ופוטנציאל ממבצת.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לתהליכי עבודה המשכיים באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה רחבת שדה (widefield) אוטומטית בפלטות רב-בארות.
- תוצרים כמותיים: אספקת נתונים ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה על רמות ROS בסיסיות ומושרות, פוטנציאל ממברנת המיטוכונדריה ומורפולוגיה לצורך סריקת תרכובות.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: מאפשרת קמפיינים של סריקה הניתנים להרחבה ולשחזור, עם פרוטוקולים סטנדרטיים לרכישת תמונות וניתוח על פני קווי תאים וטיפולים שונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: משתמש בפיברובלסטים עוריים אנושיים כדי למדל תגובות למעקה חמצוני, ובכך מספק מערכת ניתנת להעברה עבור תיקוף של מטרות טרפויטיות בשלב הפרה-קליני.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מקשר בין העלייה ב-ROS המושרה על ידי התרכובת לבין פרגמנטציה מיטוכונדריאלית ושינויים בפוטנציאל הממברנה, ובכך מבהיר קשרים פתופיזיולוגיים.
- המשכיות תרגומית: תומך בהחלטות קידום מותאמות-סיכון על ידי יצירת פרופילים רב-משתנים של חמצון-חיזור המתואמים עם תוצאות בריאות תאיות.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ועד לזיהוי מובילים (lead identification), ומאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית לפני השקעה בשלב הפרה-קליני על ידי ביסוס קשרים סיבתיים בין מצב החמצון-חיזור (redox state) לבין תפקוד מיטוכונדריאלי.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי כימות השפעתן של תנאים פתוגניים או טיפולים על עקה חמצונית ועל צורה ותפקוד מיטוכונדריאליים באותו תא.
- סריקה: מספק מוכנות לבדיקה באמצעות רכישה אוטומטית של ROS ופרמטרים מיטוכונדריאליים, מה שמבטיח פלטים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשר השוואה סטטיסטית של תנאים באמצעות ניתוח רכיבים ראשיים (PCA) על חמישה פרמטרים, המייצר פרופילי רדוקס רגישים להבחנה בין תתי-אוכלוסיות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין הגילוי לרציפות פרה-קלינית על ידי הלימה של טביעות אצבע של רדוקס עם שינויים מורפו-פונקציונליים מיטוכונדריאליים הרלוונטיים למצבים פתולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כיכולת הניתנת לשימוש חוזר לפרופיל רדוקס בסוגים שונים של תאים דבקים, ובכך מפחית פיתוח כפול של בדיקות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת עמימות מכניסטית באמצעות מדידה סימולטנית של ROS ומטוכונדריה.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות מיקרוסקופיה אוטומטית ותהליכי עבודה סטנדרטיים לניתוח תמונות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות המשך (go/no-go) על ידי קישור סממנים ביולוגיים של סטרס חמצוני לבריאות המיטוכונדריה, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד סדרי עדיפויות מותאם סיכון באמצעות פרופיל רדוקס רב-משתני המזהה שינויים במצב התאי המושרים על ידי טיפול.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה בעלת תוכן גבוה (high-content microscopy), טיפול בגששים פלואורסצנטיים וניתוח נתונים מבוסס תמונות.
- נחוצה מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בשדה רחב עם בקרת סביבה, מיקוד אוטומטי ותאימות לפלטות עם מספר בארות.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי צביעה, הגדרות רכישה ומקרואים של ניתוח להשגת תוצאות הדירות.
- כולל שיקולי התאמה לסוגי תאים ראשוניים או תאים שאינם נצמדים, מעבר לפיברובלסטים של עור אנושי.
- כולל מגבלות מעשיות כגון פוטוטוקסיות כתוצאה מההארה, דבר המחייב תנאי חשיפה מינימליים וקבועים.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
10:38
Conclusion
9:35
Results: Effect of Saquinavir on Primary Human Fibroblasts
0:47
Seeding Cells in a 96-well Plate
1:48
Setting Up the Microscope and Acquisition Protocol
3:10
Loading of the Cells with CM-H2DCFDA and TMRM
4:18
First and Second Live Imaging Rounds
6:22
Image Processing and Analysis
