זיהוי רגיש מאוד, כמותית של חלבונים ושל שלהם איזופורמים בשיטה התמקדות לגירויי כאב נימי

התמקדות לגירויי כאב נימי הוא שיטת התפוקה נוגדן מבוסס, העדינה, גבוהה, המאפשרת אפיון מפורט של חלבונים ו שלהם איזופורמים של דגימות ביולוגיות קטן מאוד. להלן מתאר פרוטוקול זיהוי, כימות של חלבונים ספציפיים, איזופורמים שלהם באופן אוטומטי ו- robotized.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המחקר הביו-רפואי, כגון גילוי סמן ביולוגי, גילוי תרופות, אבחון, הקרנה של תרופות או נוגדנים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה תפוקה גבוהה והוא יכול לזהות isoforms חלבון בצורה מאוד להתרבות. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לקראת אבחנה של מחלות רבות כי זה יכול למדוד חלבונים מושפעים או isoforms שלהם.

למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לתוך מסלולים איתות התא, זה יכול להיות מיושם גם על מערכות אחרות שבהן חלבונים ספציפיים צריכים להיות מנותחים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כמו צעדי בדיקה קשה ללמוד בגלל הטריקים, כגון הסרת בועות, טעינת הצלחת, וכו '. ראשית, להכין תערובת diluent מדגם על ידי הוספת microliter אחד של תערובת מעכבי DMSO ושני microliters של מעכבי פרוטאז ל 47 microliters של דלואנט מדגם, כך הריכוז הסופי של מעכבי DMSO ופרוטאז הוא אחד X.Dilute ליאזטים חלבון מבודד בעבר באמצעות תערובת דלורנט מדגם כדי להשיג את הריכוזים הרצויים.

לאחר מכן, להוסיף 3.325 microliters של סולם סטנדרטי, שישה microliters של מעכבי פרוטאז, ושלושה microliters של מעכבי DMSO ל 137.675 microliters של premix אנתוליטי. מערבולת המדגם לפחות 15 שניות ולשמור על קרח. מערבבים את שני הפתרונות המוכנים ביחס של אחד עד שלושה כך שהריכוזים הסופיים של מעכבי הפרוטאז של DMSO והסולם הסטנדרטי של הנקודה האיסואלקטרית הם X אחד וחלבונים בנימים מגיעים לריכוזים הרצויים הסופיים.

לאחר הוספת החלבונים לתערובת המדגם, כל השלבים יבוצעו על קרח או בארבע מעלות צלזיוס. מניחים צלחת 384 באר על קרח. לטעון עשרה microliters של תערובת המדגם לתוך באר המתאימה של הלוח, על פי פריסת תבנית הבדיקה תוכנן עם תוכנת מערכת סופג מערבית אוטומטית.

לאחר מכן, לדלל את הנוגדנים העיקריים והמשניים עם דילול נוגדנים. לאחר מכן, פיפטה עשרה מיקרוליטרים של נוגדנים ראשוניים ו -15 מיקרוליטרים של נוגדנים משניים לתוך כל באר. לאחר מכן, מערבבים לומינול ו- XDR של חמצן ביחס של אחד לאחד.

פיפטה 15 מיקרוליטרים של תערובת מי חמצן luminol לתוך כל באר. לאחר הדגימות ואת reagants נוספו לצלחת, צנטריפוגה במשך עשר דקות ב 2500 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס כדי לסובב את הנוזל ולהסיר את הבועות. אם בועות עדיין קיימות, הסר אותן ידנית באמצעות קצה פיפטה דק.

פתח את תוכנת מערכת הכתמים המערבית האוטומטית ולחץ על חדש'מתפריט הקובץ. עבור אל חלונית הפריסה והקצה מיקומים עבור רייגן ודוגמאות בצלחת 384 הבאר. בצע משימת רייגן על ידי לחיצה על באר בכל מקום בבלוק.

בחר בלוק שורה של 12 בארות כל אחת. לאחר מכן, עבור אל סרגל הכלים של חלונית הפריסה והוסף בלוק שורה לדוגמה, ראשי, משני או זוהר. עבור אל חלונית הפרוטוקול ובחר מיקום רייגן בצלחת.

לאחר מכן, לחץ על התא בעמודה לדוגמה ובחר את ה- reagant מהתפריט הנפתח. באותו אופן, בחר את מיקומי רייגן עבור הראשי, משני, ו luminol עבור כל מחזור. לחץ על התאים בזה אחר זה בעמודת הנוגדנים הראשית או המשנית ושנה את זמני הדגירה במידת הצורך.

לאחר מכן, הוסף מחזורים על-ידי לחיצה על לחצן הוסף במקטע פרוטוקול. בחלונית התבניות, הזן מידע הנוגע לדגימה, כגון זהות הנוגדנים הראשיים והמשניים, מספרי הקטלוג והדילולים שלהם. שמור את קובץ ההקשה החדש.

לפני שתלחץ על לחצן התחל,בדוק במהירות את הפריסה כדי לוודא שהכל נכון. כעת, לחץ על התחל כדי להתחיל בהפעלה. התוכנה תנחה את המשתמש להסיר את הפסולת, כדי למילוי מחדש את המים ואת תיבת נימי, להוסיף אנוליט ו catholite למגש המשאבים, להוסיף חיץ לשטוף, כדי לטעון את הצלחת לתוך מגש מדגם מקורר.

שורת מצב של כלי נגינה תוצג על מסך המחשב מספר דקות לאחר תחילת הריצה. לחץ על מסך סיכום הריצה כדי לראות את החלוניות של המצב וההפרדה. כדי לבחון את הפרדת האלקטרופורזה נימי, הפעל את סרט ההפרדה עבור נימי זה על ידי לחיצה על המחזור הרצוי ולאחר מכן לחיצה על כפתור ההפעלה בלוח הבקרה.

פתח את קובץ הריצה ובחר את כרטיסיית מסך הניתוח. לחץ על ערוך ולאחר מכן על ניתוח'כדי לשנות את טווח הנקודות האיסואלקטרי. החל את תקן הנקודה האיסואלקטרית המתאים.

הוסף התאמה שיא והוסף שם שיא. לבסוף, בחר את הנתונים לשימוש בכרטיסיה פסגות וייצא את הנתונים לניתוח נוסף. האלקטרופרוגרמה של קינאזות מווסתות אותות חוץ-תאיים זרחניים מגורם הגדילה ה אנדותל כלי הדם מגורה ליאזטים מוצג כאן.

יש אינדוקציה גבוהה מאוד של חלבונים זרחניים שנצפו עם גורם גדילה אנדותל כלי דם. ההסטה מציגה את בקרת הטעינה הא אנדוגנית, HSP 70, המציינת טעינה דומה של דגימות עבור דגימות לא מטופלות ומטופלות. באימונובלו קונבנציונלי, זוהו רק שתי רצועות, למרות חלבוני קינאז חוץ-תאיים מווסתים בזרחן נפתרו לארבע פסגות על ידי ניתוח התמקדות איסואלקטרי נימי.

האלקטרופרוגרמה של קינאזות מווסתות אותות חוץ-תאיים מגורם הגדילה ה אנדותל כלי הדם מגורה ליאזטים מוצג כאן. ה- Inset מציג את אותו פקד טעינה המשמש במקביל. אימונובלו קונבנציונלי מראה רק שתי רצועות המתאימות לקינאז מווסת אותות חוץ-תאיים אחד וקינאז מווסת אותות חוץ-תאיים 2.

בעוד שעם ההתמקדות האיסואלקטרית נימית, חלבוני הקינאז המווסתים על-ידי אותות חוץ-תאיים נפתרו לשש פסגות, בהתאם לכל ארבע הפסגות השונות עם זרחן ושתי פסגות לא זרחיות. לאחר השליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות בעוד כמה שעות, בהתאם למספר המחזורים, אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בריכוזי נוגדנים גבוהים יותר בהשוואה לאימונובלוצים קונבנציונליים.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כמו צעדי בדיקה קשה ללמוד בגלל טריקים, כגון הסרת בועות, טעינת הצלחת, וכו '. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך לעצב חקירה, להכין דגימות, להפעיל את ההתזה, ולנתח את הנתונים כדי לבחון isoforms שונים של החלבון שלך.