שיטה חישובית לכמת פעילות היממה לעוף
October 28th, 2017
שיטה לכמת את התכונות העיקריות טמפורלית ראיתי במקצבים גינקולוגיות היממה לטוס מוצג. כימות מושגת על ידי התאמת הפעילות לטוס עם צורת גל מודל רב פרמטרית. הפרמטרים דגם מתארים את הצורה ואת הגודל של הבוקר ושל פסגות ערב של פעילות יומית.
ברוב בעלי החיים, שעונים ביולוגיים מתזמרים תהליכים התנהגותיים ומולקולריים ומסנכרנים אותם למחזור האור-חושך היומי. בזבובי פירות, השעון נחקר בדרך כלל באמצעות הקלטות תנועתיות. הנה דוגמה לתנועה ממוצעת של סוג פרא שנמדדת במחזור אור של 12 שעות, מחזור חושך של 12 שעות, מחזור האור-חושך מוצג עם פס צהוב-שחור למעלה.
תיעוד זבוב טיפוסי מראה דפוס ביומודאלי מורכב עם שני שיאים של פעילות, שיא בוקר המתרחש בסביבות עלות השחר ושיא ערב המתרחש בשעות בין ערביים. שתי הפסגות הללו יחד יוצרות צורת גל שונה מאוד מתנודות סינוסואידיות שנצפו בגנים של השעון, מה שמרמז על כך שלמנגנונים, בנוסף לשעון, יש השפעה עמוקה ביצירת הדפוס הנצפה בנתונים התנהגותיים. כאן אנו מציגים את השיטה הראשונה המתארת מתמטית טפיחות זמניות בפעילות זבובים.
אנו מתאימים את נתוני הפעילות לצורת גל מודל המחקה תנועת זבובים. המודל שלנו מורכב מארבעה מונחים מעריכיים, שני מונחים משיא הבוקר ושני מונחים משיא הערב. יחד עם המחזור הצירקדי, למודל שלנו יש תשעה פרמטרים בלתי תלויים.
פרמטרים B מגדירים את קצב עליית הבוקר, דעיכת הבוקר, עליית הערב ודעיכת הערב. TM ו-TE מגדירים את רוחבי הפסגות בבוקר ובערב, ו-HM ו-HE מגדירים את גבהי הפסגות. יחד פרמטרים אלה מתארים באופן מלא את הגודל והצורה של שיאי הבוקר והערב בדפוס הפעילות.
ניתן ליישם את השיטה שלנו כדי להבהיר את המנגנונים והמצע העומדים בבסיס דפוס הפעילות הבימודאלי הנפוץ בקריאות תנועתיות של זבובים. לניסוי התנועה, הכינו צינורות בודדים עם אוכל בקצה אחד וכותנה בקצה השני. לשם כך, ראשית, הכניסו חמישה עד שישה גרם מזון זבובים לכוס של 50 מיליליטר.
חותכים אוכל לחתיכות קטנות, כך שיהיה קל יותר להמיס אותו במיקרוגל. מוניטור פעילות יחיד מתאים ל-32 צינורות בודדים. לכן, קח 32 צינורות וחבר אותם יחד באמצעות גומיה.
ממיסים את האוכל בכוס במיקרוגל. מחממים את האוכל כ-10 עד 15 שניות. עצרו את המיקרוגל כל חמש שניות, ונערו מעט את הכוס עם האוכל כדי להבטיח המסה שווה של המזון.
וודאו שכל המזון נמס ולא נותרו חתיכות מזון מוצקות בכוס. בזמן שהאוכל עדיין נוזלי, הכניסו צינורות לכוס עם מזון. הזיזו את הצינורות למעלה ולמטה מעט, כך שהם יהיו מלאים באותה מידה.
תנו לאוכל להתקרר ולהתמצק כשעה. לאחר שהמזון מוצק, הסר את הצינורות מהכוס בתנועה סיבובית כדי שהמזון לא יידבק לתחתית הכוס. ואז הסר את הגומייה.
אוטמים את הקצה במזון בעזרת שעווה. לשם כך, ראשית, נגב בזהירות את הצינור בעזרת מגבת נייר. ואז לחץ את הצינור על השעווה.
בדוק חזותית את איכות החותם, ובמידת הצורך חזור שוב על האיטום. בעזרת טכניקה זו, אטום את כל הצינורות לניסוי. הקצה השני של הצינורות נסגר עם הכותנה.
הכותנה תאפשר לאוויר לעבור תוך שמירה על הזבובים נעולים בתוך הצינורות. קל גם להסיר ולהחזיר פנימה, מה שיהיה שימושי כאשר נעמיס את הצינורות עם הזבובים לניסוי. כעת, לאחר שהצינורות מוכנים, העמיסו אותם בזבובים לניסוי.
לשם כך, פרקו זבובים על המשטח עם CO2. לאחר מכן, בעזרת מברשת, הכניסו בזהירות זבוב בודד לכל צינור בודד. הכניסו את הצינור עם הזבוב לצג.
באותו סדר כמו בצג, תנועת זבוב תירשם בקובץ הפלט על ידי מערכת הצג. חבר את הצג למחשב, והנח אותו באינקובטור השומר על טמפרטורה ולחות קבועים. בהתבסס על הניסוי, הגדר את תנאי האור/חושך המתאימים.
עבור ניסוי אור/חושך, שמור זבובים במחזור אור-חושך במשך כל הניסוי. אל תשתמש ביום הראשון של המדידות בניתוח. לניסוי חושך מתמיד, ראשית, שמור זבובים במשך יומיים בתנאי אור/חושך לצורך אימון וסנכרון של השעונים, ולאחר מכן עבור לחושך קבוע.
אל תשתמש במדידות מהיום הראשון של חושך מתמיד בניתוח. לפני המעבר לסעיף הבא, מומלץ לקרוא את הפרוטוקול. מערכת המוניטור תפיק קובץ יחיד המכיל פעילות של כל הזבובים בצג.
32 העמודות האחרונות של קובץ הפלט מכילות פעילות של זבובים בודדים. התוכנית שלנו עובדת עם פעילויות זבוב בודד. לכן, פצל את קובץ הפלט למספר קבצי פעילות זבוב בודדים.
כל קובץ צריך להיות קובץ TXT בעל עמודה אחת. כעת, לאחר שנכין את קבצי הפעילות, נוכל להריץ את הניתוח שלנו. הפעל את הפונקציה ModelFitPS3 בחלון הפקודה של MATLAB עם פרמטרי הקלט הבאים.
קצב דגימה, שים מרווח זמן דגימת נתונים בשניות. לדוגמה, הנתונים שלנו נלקחו עם קצב דגימה של 20 שניות. לכן, שמנו כאן 20.
כמרווח סל, הגדר מרווח זמן בדקות, שאליו יאוחסנו נתונים לאחסנה לצורך תצוגה חזותית טובה יותר. אנו ממליצים ל-binning ל-20 או 30 דקות, אבל, לעת עתה, אשים כאן 10, רק כדי להראות לך מאוחר יותר כיצד ניתן לשנות את זה בקלות. עבור מגמה, שים אחד אם הנתונים הראו מגמת בסיס ואפס אחרת.
לנתונים שלנו אין שום מגמה בסיסית. לכן, שמתי כאן אפס. לחץ על Enter כדי להפעיל את הפונקציה.
בחלון המוקפץ, בחר קובץ פעילות זבוב בודד ולחץ על פתח. התוכנית תחשב ותשרטט את ספקטרום הספק הנתונים. בחלון זה, קבע את התקופה העיקרית בנתונים.
לשם כך, לחץ עם כפתור העכבר השמאלי בשיא בתקופה הצירקדית או עם כפתור העכבר הימני בשיא בהרמוניה שנייה, משוכפל בערך בתקופה הצירקדית חלקי שתיים. במקרה שלנו, שיא בהרמוניה שנייה הוא הרבה יותר גדול וחד מהשיא בתקופה הצירקדית. לכן אנו משתמשים באפשרות השנייה.
לאחר מכן, התוכנית תתווה נתונים מאוחסנים למרווח הסל שנבחר. כפי שאתה יכול לראות, במרווח סל של 10 דקות, שיא הבוקר והערב אינם נראים היטב. לכן, ברצוננו לשנות ערך זה.
כדי לעשות זאת, פשוט לחץ לחיצה ימנית במקום כלשהו בגרף. בתיבת הדו-שיח החדשה, הקלד את הערך החדש עבור מרווח הזמן בין הסלים. אנו ממליצים על binning למרווח זמן של 20 דקות.
לכן, שמנו כאן 20. לחץ על אישור. התוכנית משרטטת מחדש מיד את הנתונים עם הערך החדש של מרווח הסל. כדי לקבל ערך זה, פשוט לחץ באמצעות לחצן העכבר השמאלי במקום כלשהו בגרף.
התוכנית כעת תשרטט מחדש את הנתונים ותציג רק חמישה ימי מדידה. בחלון זה, בחר את שיא הבוקר הראשון שישמש בניתוח. לפעמים יש צורך לדלג על יום או יומיים ראשונים, שלוקח לזבוב להסתגל למחזור האור-חושך.
כדי לבחור את שיא הבוקר, פשוט לחץ על הפסגה המועדפת. התוכנית תשרטט מחדש את הנתונים, וכעת תציג רק שלושה ימים של מדידות החל משיא הבוקר שנבחר. הקווים האנכיים הכחולים והאדומים מציגים את שיא הערב הראשון ואת שיא הבוקר השני בהתבסס על התקופה שנבחרה בחלון הראשון.
בחלון זה, בחר את הנקודה שבה הצינור שימש להתאמה ראשונית של הנתונים לפונקציית המודל. לשם כך, לחץ על הנקודות הבאות בסדר הספציפי הזה. ראשית, לחץ על החלק העליון של שיא הבוקר הראשון.
הקליק מסומן עם הכוכב האדום בתחתית, המציג את מיקום הלחיצה. לאחר מכן לחץ על סוף שיא הבוקר, ואז על תחילת שיא הערב, ואז על פסגת הערב, ואז בסוף שיא הערב, ולבסוף על פסגת הבוקר של היום שלמחרת. התוכנית תשרטט שוב את ספקטרום ההספק מכיוון שהפרמטרים הסופיים מתקבלים מהתאמה ספקטרלית.
הספקטרום משורטט כעת כתדר על ציר ה-x, והשיא הצירקדי ממוקם בצד שמאל של העלילה. התקופה שנקבעה בשלב הראשון מוצגת בקו אנכי אדום. כדי לבחור נקודות התאמה, ראשית, קבע בערך את התקופה העיקרית.
לשם כך, לחץ לחיצה ימנית על שיא בתקופה הצירקדית, או לחץ לחיצה ימנית על שיא בהרמוניה שנייה. נשתמש שוב באפשרות השנייה. לאחר מכן, יופיע מחוון בתחתית לבחירת הנקודות להתאמה הספקטרלית.
הנקודות יוצגו בעיגולים אדומים ויופיעו לאחר הזזת המחוון. הזיזו את המחוון שמאלה וימינה, ומקמו את הנקודות קרוב ככל האפשר לראשי הפסגות הספקטרליות. לאחר השגת התמונה הטובה ביותר, לחץ על כפתור קבל, והתוכנית תתאים את הנקודות שנבחרו עם הביטוי האנליטי עבור ספקטרום הספק הדגם.
לאחר ההתאמה, התוכנית תוציא שני גרפים נוספים. הראשון הוא ספקטרום הספק של המודל שנבנה עם הפרמטרים שחולצו. השני הוא נתונים המותאמים למודל.
הנתונים מוצגים בקו שחור, והמודל מוצג בקו אדום. ניתן לראות כי התפקוד דומה מאוד לנתונים, במיוחד בשלושת ימי הפעילות האחרונים. הפרמטרים שחולצו נשמרים בקובץ TXT של פרמטרי התאמת המודל.
לאחר שם הקובץ, הפרמטרים נשמרים בסדר הבא, תחילה b של דעיכת הבוקר, לאחר מכן b של זריחת הבוקר, b של עליית הערב, b של דעיכת הערב, התקופה הצירקדית, ואז רוחב שיא הבוקר חלקי התקופה הצירקדית, רוחב שיא הערב חלקי התקופה הצירקדית, גובה שיא הבוקר, גובה שיא הערב, וטעות ההתאמה של ההתאמה הספקטרלית. בנוסף לקובץ הפרמטרים של התאמת הדגם, התוכנית תוציא גם שני קבצים נוספים. הראשון, הוא התאמת הנתונים לפונקציית המודל, והשני הוא התאמה ספקטרלית.
בצע ניתוח זה עם קבצי פעילות אחרים. כל הפרמטרים שחולצו נשמרים בקובץ TXT של פרמטרי התאמת המודל וניתן להשתמש בהם עוד כדי לחבר פלט התנהגותי למנגנונים בסיסיים המווסתים את התנהגות הזבוב היומיומית הנשלטת על ידי דפוס פעילות המודל.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
המחקר הזה מציג שיטה חדשה לכימות התכונות הזמניות של מקצבי תנועה צירקדיים בזבובי פרי. על ידי התאמת נתוני הפעילות של הזבובים לגל מודלי רב-פרמטרי, המחקר מתאר את שיא הפעילות בבוקר ובערב של הפעילות היומית.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירולוגיה
- כרונוביולוגיה
- ניתוח התנהגותי
רקע
- שעונים צירקדיים מסדירים תהליכים התנהגותיים ומולקולריים בבעלי חיים.
- זבובי פרי משמשים כאורגניזם מודלי לחקר מקצבים צירקדיים.
- תיעוד תנועתי חושף דפוסי פעילות מורכבים בתגובה למחזורי אור-חושך.
- הבנת מקצבים אלו יכולה לספק תובנות לגבי מנגנונים ביולוגיים רחבים יותר.
מטרת המחקר
- לפתח מודל מתמטי לתיאור דפוסי פעילות של זבובי פרי.
- לכמת את שיא הפעילות המובחן שנצפה בזבובי פרי.
- לשפר את ההבנה של מנגנוני המקצבים הצירקדיים מעבר למודלים מסורתיים.
שיטות ששימשו
- תיעוד תנועתי של זבובי פרי מסוג בר.
- ניתוח דפוסי פעילות תחת מחזור אור/חושך של 12 שעות.
- התאמת נתוני פעילות לגל מודלי רב-פרמטרי.
- אפיון שיא פעילות בוקר וערב.
תוצאות עיקריות
- זיהוי של שני שיאים מובחנים של פעילות במקצב היומי.
- הוכחה של דפוס מורכב, דו-שיאים, בתנועת הזבובים.
- פרמטרים של המודל מתארים ביעילות את הצורה והגודל של שיא הפעילות.
- תובנות לגבי מנגנונים נוספים המשפיעים על דפוסי התנהגות.
מסקנות
- השיטה המוצעת מספקת מסגרת חזקה לניתוח מקצבים צירקדיים.
- הממצאים תורמים להבנת נתוני התנהגות ביחס לשעונים צירקדיים.
- מחקר עתידי יכול לבנות על מודל זה כדי לחקור היבטים נוספים של ביולוגיה צירקדית.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Quantifying circadian locomotor patterns in Drosophila enables mechanistic de-risking of target validation by linking behavioral outputs to underlying kinetic parameters. This computational approach enhances predictive confidence in preclinical models by providing quantitative, reproducible metrics for pathway interrogation. The method supports early discovery workflows by standardizing complex bimodal activity data into interpretable parameters for cross-functional collaboration.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying morning and evening peak kinetics in fly locomotor rhythms.
- Operational Value: Provides nine independent parameters that fully describe peak shape and size for consistent biological de-risking.
- Strategic Value: Supports predictive confidence in target selection by elucidating substrate mechanisms beyond core clock oscillations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative outputs from complex bimodal patterns for reliable compound screening readiness.
- Operational Value: Enables assay reproducibility through model-based fitting of activity data to a four-exponential waveform.
- Strategic Value: Facilitates platform reuse by extracting comparable parameters across genetic or pharmacological conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects behavioral phenotypes to mechanistic substrates underlying circadian-regulated processes in disease-relevant systems.
- Operational Value: Supports translational biomarker alignment by correlating extracted parameters with molecular or pathway readouts.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by reducing mechanistic ambiguity in locomotor-based preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification by converting raw locomotor data into quantifiable parameters for downstream analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by modeling activity peaks as outputs of kinetic substrate interactions.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs via model-fitted parameters that capture morning and evening peak dynamics.
- Analytics: Provides statistical outputs including peak height, width, and decay rates for comparative condition analysis.
- Translational Research: Enables preclinical continuity by linking behavioral metrics to mechanistic de-risking in circadian-related pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable computational framework for standardizing circadian behavioral analysis across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through mechanistic insight into bimodal activity regulation beyond transcriptional clocks.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via nine-parameter model fitting of locomotor waveforms.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing biological ambiguity in behavioral phenotypes.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative dissection of morning and evening peak contributions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in circadian biology and MATLAB-based spectral and model fitting.
- Depends on activity monitoring infrastructure and controlled light/dark incubation systems.
- Necessitates cross-team standardization of binning, trend correction, and peak selection protocols.
- Involves adaptation considerations when applying the model to non-standardized fly strains or environmental conditions.
- Includes practical limitations such as sensitivity to baseline trends and initial transient adaptation periods in locomotor data.
