מדידת כמותית של התגובה החיסונית ובשינה דרוזופילה

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להעריך את השינה ותפקוד מערכת החיסון בדרוזופילה. זה מושג תחילה על ידי רישום פעילות תנועתית של זבובים נגועים כדי למדוד שינה והישרדות כשלב שני לאחר שזבובים נגועים הומוגניים, מדוללים ומתפשטים על צלחות אגר LB. מספר היחידות היוצרות מושבה שגדלות מעיד על יכולתם של זבובים לנקות את הזיהום.

לאחר מכן, זבובים נגועים המבטאים טרנסגן המכיל את מדווח NF kappa b luciferase מתווספים לצלחת של 96 בארות המכילה לוציפריאן, המצע של לוציפראז. מדידה בזמן אמת של קאפה b לוציפראז מצביעה על הפעלה של מסלול איתות NF kappa B במהלך הזיהום לחלוטין תוצאת הישרדות שינה. פינוי חיידקים ופעילות מדווח NF KB הם מדידות המספקות תובנה מכניסטית לגבי הקשר המולקולרי בין תפקוד חיסוני להתנהגות.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו או מתקשים מכיוון שלוקח זמן ותרגול ללמוד כיצד להדביק זבובים באופן ידני בעקביות. היתרון העיקרי של הטכניקה המדווחת של לוציפר על פני שיטות קיימות כגון QPCR הוא שניתן למדוד את פעילות NF Kappa B באופן רציף בזמן אמת בחיים. זבובים מתחילים בדגירה של תרביות דרוזופילה מבוימות של אישונים מאוחרים במשך שלושה עד ארבעה ימים, כך שהבוגרים מסתגלים לתנאי הסביבה.

כאן הזבובים ממוקמים תחת אור קבוע כדי לבטל את השפעת השעון הביולוגי על התגובה החיסונית וההתנהגות. העומס הבא זבוב בן יום עד ארבעה ימים לפעילות. מוניטורים מתעדים את פעילותם לפחות שלושה ימים לפני ההדבקה יום אחד לפני ההדבקה המתוכננת.

בחר מושבת SIA בודדת עם קצה פיפטה סטרילי וטבל את הקצה בצינור תרבית המכיל חמישה מיליליטר של מדיום LB כדי לאמת טכניקה סטרילית. אל תשכח להכין תרבית מדומה בקרה ללא חיידקים. לגדל חיידקים בן לילה עד שהם מגיעים לשלב הצמיחה האקספוננציאלי למחרת.

מדוד את ספיגת התרבית ב-600 ננומטר. כלול וטרינר Q שני כריק. הוא מוכן כאשר הריכוז הוא בין 0.5 ל-1 יחידות ספיגה, תת-תרבות, או להאריך את זמן התרבית לפי הצורך.

כעת הכינו את תמיסת החיידקים כדי להדביק את הזבובים. לדלל את החיידקים עם PBS לספיגה צפויה של 0.1 ב-600 ננומטר. לאחר מכן הוסף צבעי מאכל לבקרת ההזרקה.

החלף את החיידקים במדיום LB. אחסן את שני הפתרונות על קרח. לאחר מכן, בעזרת מושך מיקרו פיפטה, הכינו מחטי הזרקה עם קצה דק מתחת למיקרוסקופ מנתח.

השתמש במלקחיים עדינים כדי לנתק את קצה כל מחט כך שהפתח יהיה גדול מספיק כדי להתמלא בנוזל הזרקה באמצעות יניקה, אך גם קטן מספיק כדי למזער את הנזק לזבוב. חבר מחט זכוכית למזרק פלסטיק של שלושה סמ"ק באורך צינור באמצעות המזרק. זרימת אמצעי ההזרקה נשלטת באופן ידני.

הימנע מזיהום צינורות הגומי בנוזל הזרקה מכיוון שמנגנון המזרק משמש הן להזרקה זיהומית והן להזרקת בקרה. ודא את זרימת אמצעי ההזרקה באמצעות רקמת מגבון קים. שני פרטים קריטיים להזרקות מוצלחות הם שימוש בגודל המחט האופטימלי והאיטום המאובטח בין המחט למזרק.

לאחר שמערכת ההזרקה מוכנה במלואה, הרדמו את הזבובים באמצעות זרימה מינימלית של פחמן דו חמצני, המשיכו במהירות כך שלא ירדימו זבובים יותר מחמש דקות. כעת הזריקו זבובים על ידי תקיעת מחט הזכוכית לאזור שמעל הטלום המוטה של בית החזה הגבי. מעבר אמצעי ההזרקה לזבוב מאומת על ידי צבעי המאכל, אותם ניתן לראות ככל שהתמיסה המוזרקת מתפשטת.

לפני שמתחילים, וודאו כי כל החומרים המשמשים להליך זה עברו חיטוי גם לפחות יום מראש. הכינו צלחות פטרי בגודל 10 סנטימטר עם מדיום אגר LV. ביום הניסוי יש להרדים ולהניח זבובים בצינורות צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.

הכן מינימום שתי קבוצות של 10 זבובים כל אחת לכל תנאי ניסוי. הכינו גם קבוצת ביקורת של זבובים ללא זיהום, במיוחד כאשר משתמשים בזן חיידקים ללא עמידות לאנטיביוטיקה. אחסן את כל הצינורות העמוסים על קרח.

לאחר מכן, הוסף 400 מיקרוליטר של מדיום LB לכל צינור טעון זבוב. הומוגניזציה של הזבובים באמצעות קליפה קטנה ועשו זאת ליד להבה כדי למנוע זיהום. כעת באמצעות קצות הפיפטה החתוכים, מדללים את ההומוגנאט בגורמים של 10 בנפחים של 200 מיקרוליטר.

אם ההומוגנאט נוצר מיד לאחר ההדבקה בסיה, הכינו דילו עד 1 עד 1000, אך במשך 24 שעות, לאחר ההדבקה הומוגנית, היוו עד 100,000. הזרע הבא, שני הדלו הגדולים ביותר על צלחות של 10 סנטימטר באמצעות כדורי זכוכית כדי להבטיח חלוקה אחידה, דוגרים את הצלחות למשך הלילה. למחרת, ספרו את מספר המושבות על הצלחת על ידי תצפית ישירה או באמצעות תוכנת ספירת מושבות.

לאחר מכן חשב את מספר היחידות היוצרות מושבה לכל זבוב. בדיקה זו משתמשת בזבובים טרנסגניים הנושאים את מדווח ה-kappa b luciferase בזמן המתאים. הבדיקה דורשת גם חיידקים מתורבתים כגון SCIA המוכנים להזרקה כמתואר בסעיף הקודם.

התאם את הזבובים לתנאי התאורה הניסיוניים. בדוגמה זו, זבובי קאפה b לוציפראז בני יום עד ארבעה ימים מאוחסנים בבקבוקונים המכילים 5% סוכרוז, 2% מדיום מזון אגר, ומונחים באור קבוע למשך יומיים. כעת הכינו מיקרופלייט 96 באר לזבובים.

ממלאים כל באר בשתי שכבות מזון. בינוני תחילה, הוסף 300 מיקרוליטר של 5% סוכרוז, תמיסת אגר 2% לכל אחד. מכסים היטב את הצלחת במטלית רשת דקה ומניחים לצלחת להתייבש היטב עד שעה.

לאחר מכן, הוסף שכבה עליונה של 50 מיקרוליטר לכל באר המכילה 5% סוכרוז, 1% אגר ושני לוציפר מילי-מולרי. מכיוון שלוציפר רגיש לאור, אפשרו לצלחת להתייבש בחושך ולהמשיך הלאה. צמצם את חשיפת האור של הצלחת.

לאחר שהאגר התקרר, מכסים את הצלחת בניילון דבק שקוף. לאחר מכן בעזרת מחט דקה, מחוררים את הסרט פעמיים על כל באר. חורים אלה מאפשרים חילופי אוויר והרדמה גזית.

לאחר מכן, כדי להקל על העמסת זבובים, השתמש בלהב חד ובקצה ישר כדי להכניס חתך בין כל עמוד. להרדים את הזבובים בפחמן דו חמצני ולהעמיס אותם בזה אחר זה לכל באר עמודה אחר עמודה. אם זבוב נתקע בסרט, תנו לו הזדמנות לשחרר את עצמו לפני שהוא מתערב.

החזר את צלחת המיקרו באר לחממה באור קבוע למשך שמונה עד 24 שעות. כדי להרדים את הזבובים הקשורים היטב, השתמש בקצה מיקרו פיפטה המחובר לקו פחמן דו חמצני בלחץ נמוך. ודא שהגז נמצא בלחץ נמוך באופן בלתי מזיק והנח את קצה המיקרו פיפטה ישירות מעל חורי האוורור כדי להרדים זבוב בקבוצות של שמונה בנפרד.

העבירו כל זבוב לכרית CO2 והדביקו אותם בחיידקים כמו קודם. לאחר מכן החזירו כל זבוב לבאר המקורית שלו ואטמו מחדש את המיקרופלייט. מדוד את הזוהר בכל זבוב באמצעות לומינומטר השוכן בחדר מבוקר טמפרטורה תחת לוח זמנים מוגדר של תאורה.

טען את הצלחות לתוך קלטת הערימה, הקפד לערום את הצלחות המכילות את הזבובים בין צלחות ריקות שקופות. תכנת את הלומינומטר לפי מפרט היצרן ואסוף קריאות כל שעה למשך 24 שעות לפחות. בדוגמה זו, הגלאים מתוכנתים לקרוא כל באר למשך 10 שניות.

לאחר השלמתו, ייצא את קבצי הנתונים לגיליון אלקטרוני ובצע ניתוח סטנדרטי המציג את התוצאות. ניתן לנתח את הנתונים לדוגמה. ההנחות לשנייה היו בממוצע משלוש קריאות לבאר.

סוג הפרא של קנטון S זבוב ומתענג. זבובים מוטנטיים E 20 חסרי גן NF kappa B הועמסו לשני צגי פעילות באור קבוע ונדבקו ב-sia. בדוגמה זו, זיהום עודד שינה.

היה ברור שמוטציות E 20 חוו פחות שינה מאשר זבובי הביקורת של קנטון לאחר הדבקה. בהתאם לממצאים קודמים, מוטציות ה-E 20 נכנעו במהירות לזיהום בהשוואה לזבובי בר.

רוב הזבובים שרדו את זריקת הבקרה האספטית, מה שמצביע על כך שהזבובים נכנעו לזיהום ולא לפציעה עקב ההזרקה. מכיוון שהמוטאנטים מתו כל כך מהר, רק זבובי קנטון שימשו להדגמת עומס חיידקי לאחר הדבקה. סיה המשיכה להתרבות בזבוב 24 שעות לאחר ההדבקה.

פעילות הדיווח של לוציפר הראתה שונות גדולה בין זבובים בודדים ובין הצלחות של נקודות נתונים. למרות שהאות נגזר מכל הרקמות בתוך הזבוב, לא צפוי שכל רקמה תפלוט את אותה כמות אות והנראות של הרקמה לגלאי תשתנה ככל שהזבוב נע. בדוגמה הזו, זבובים נדבקו והושוו לקבוצת ביקורת שטופלה.

זבובים שמתו לא נכללו בניתוח על פני קבוצת זבובים. פעילות הדיווח של קאפה ב לוציפראז עולה בהתמדה לאחר ההדבקה. פעילותו של כתב קאפה ב לוציפראז עלתה גם היא בהתמדה לאחר פציעה אספטית.

שיא הפעילות היה בסביבות 12 שעות הן לאחר הפציעה והן לאחר ההדבקה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לכמת את תפקוד מערכת החיסון ושינה ב-SSO לאחר הדבקה. אנו יכולים למדוד שינה, הישרדות, זמן, פינוי חיידקים ופעילות בזמן אמת של מדווח תמלול ללא עותק.