ברזולוציה גבוהה הדמיה חיה של התנהגות התא ב Neuroepithelium פיתוח

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמות התנהגות תאים בתוך הצינור העצבי העוברי ברזולוציה גבוהה לפרקי זמן ארוכים. זה מושג על ידי מעבר ראשון של הצינור העצבי המוקדם עם ביטוי מניע מבנה של חלבון פלואורסצנטי לבחירה לסימון תאים בודדים. השלב הבא הוא להכין פרוסות מהעובר המוקדם ולהרכיב אותן על צלחות עם תחתית זכוכית.

לאחר ההתאוששות באינקובטור, פרוסות העובר מצולמות במיקרוסקופ שדה רחב במרווחי זמן קבועים. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לחקור את התנהגות התאים בתוך האפיתל העצבי המתפתח לאורך תקופות זמן ארוכות עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות להדמיית רקמות חיות הוא בכך שהיא מאפשרת לנו לצפות בהתנהגות תאים בודדים לאורך תקופות זמן ארוכות ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה.

שיטה זו מאפשרת לך לענות על שאלות מפתח בתחום של נוירוביולוגיה התפתחותית, כגון תפקיד אוריינטציה של ציר מיטוטי בבחירת סולפט, או כיצד דינמיקת איתות עשויה לווסת את התנהגות התא לפני אלקטרופורציה של פלסמידים לתוך הצינור העצבי. מחטי זכוכית מוכנות באמצעות חולץ מיקרו נימי תחת מיקרוסקופ מנתח. השתמש במלקחיים עדינים כדי לנתק את קצה המחט.

קצה המחט צריך להיות חד מספיק כדי לנקב את הצינור העצבי תוך שהוא לא כל כך צר עד שהוא מעכב את הזרקת תמיסת ה-DNA. ה-X לניסוי זה הודגר ב-37 מעלות צלזיוס במשך כ-36 שעות להמבורגר המילטון. שלב 10.

כדי להתחיל בהליך זה, חלון וביצית והניחו אלקטרודות במרחק של חמישה מילימטרים זה מזה משני צידי העובר, הזריקו DNA לתוך הצינור העצבי. הדנ"א צבוע בכמות קטנה של ירוק מהיר לצורך הדמיה. הפעל זרם של 12 עד 17 וולט ואורך פולס של 50 מילישניות שלוש פעמים עם 950 מילישניות בין פולסים.

ריכוזים נמוכים של DNA ומתחי אלקטרופורציה נמוכים משמשים להשגת ביטוי פסיפס כך שניתן לעקוב אחר תאים בודדים. לבסוף, מכסים את החלון בקליפת הביצה בסרט מרתף, וודאו שהוא אטום. אפשר לעוברים להתאושש במשך שלוש עד ארבע שעות או לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

יש להכין את תערובת הקולגן ומדיום תרבית הפרוסות כשעה לפני חיתוך העוברים. להכנת תערובת הקולגן ב -100 מיקרוליטר של תמיסת חומצה אצטית 0.1% ל -300 מיקרוליטר של קולגן ומערבולת מסוג אחד ביסודיות, הוסף היטב 100 מיקרוליטר של חמש פעמים L 15, בינוני ומערבולת. שוב, הפתרון צריך להצהיב.

לאחר מכן, הוסף 15 עד 20 מיקרוליטר של 7.5% נתרן ביקרבונט, ומערבולת ביסודיות. הפתרון צריך להיות מעט ורוד. המשיכו על הקרח.

יש להכין את תערובת הקולגן הזו טרייה בכל פעם. כדי להכין את מדיום תרבית הפרוסות להלן ל -10 מיליליטר של מדיום נוירו-בסיסי, תוסף B 27 גלוט מקס ותמיסת גנטמיצין, הנח את המדיום באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, חוצץ עם 5% פחמן דו חמצני. השאירו את החלק העליון של המיכל רופף כדי לאפשר לו להתייצב עם הפחמן הדו חמצני למשך שעה לפחות.

כדי להתחיל בהליך זה, השתמש בזוג מספריים קטנים כדי לחתוך את העובר. מוציאים את העובר מהביצה בעזרת פינצטה שוטפים L 15 בינוני. מניחים את העובר בתבנית תרבית רקמות עם שכבת מגן סיל בתחתית.

הצמד את העובר החוצה דרך הממברנות העובריות הנוספות שמסביב כך שהממברנות נמתחות מתוחות. בעזרת סכין מיקרו פורסים את העובר ישר ככל האפשר דרך אזור העניין. עבור חוט השדרה, פרוסות חוט השדרה צריכות להיות בין סומיט אחד לשניים, פרוסות עלים עבות המחוברות לרקמה הצדדית של העובר, כך שהן לא יאבדו בזמן שעוברים אחרים נחתכים.

יש צורך בקצה מיקרו פרפט מותאם אישית להעברת פרוסות חוט השדרה לצלחת תחתית הזכוכית. כדי להכין זאת, חבר קצה של 200 מיקרוליטר לפרמן P 2 או P 10 וחתך כמילימטר מקצה הקצה. קודד את החלק הפנימי של הקצה בקולגן על ידי הכנת מיקרוליטר אחד מתערובת הקולגן שהוכנה קודם לכן.

השאירו למשך דקה עד שתיים ואז שטפו עם L 15 בינוני. זה ימנע מהרקמה להיצמד לחלק הפנימי של הקצה. כעת נתק פרוסה מהעובר בעזרת סכין מיקרו והסר את הפרוסה מהצלחת באמצעות ה- P two או P 10 המצויד בקצה של 200 מיקרוליטר.

נסה לקחת כמה שפחות מדיום. מערבלים את תערובת הקולגן וזורקים חמישה עד שמונה מיקרוליטרים ממנו על צלחת תחתית זכוכית מצופה פוליאול ליזין עם החלקת כיסוי כבסיס, מכניסים מיד את פרוסת העובר לתוך הקולגן ומניחים אותה עם זוג מלקחיים עדינים. יש למקם את ה-LIC כך שהצד שיש לצלם יהיה צמוד להחלקת הכיסוי.

הרקמה צריכה להיצמד לציפוי הפוליאול ליזין על החלקת הכיסוי. חזור על פעולה זו עד שיהיו לך כמה פרוסות על החלקת הכיסוי. בדרך כלל מניחים שש עד תשע פרוסות על צלחת אחת.

כשכל הפרוסות במקומן, מוסיפים שניים עד שלושה מיקרוליטרים של L 15, בינוני עד המוקדם ביותר קולגן ומכסים את המנה. הניחו לקולגן להתייצב למשך 20 דקות. לאחר שהקולגן מתייצב בזהירות, הוסף שני מיליליטר של מדיום תרבית פרוסות שאוזן במשך שעה לפחות ב-5% פחמן דו חמצני ו-37 מעלות צלזיוס.

יש להקפיד לא להוציא את הקולגן ממקום החלקת הכיסוי בחממת פחמן דו חמצני של 37 מעלות צלזיוס 5% ולאפשר לפרוסות להתאושש לפחות שלוש שעות לפני ההדמיה. הדמיית התנהגות תאים בתוך רקמה לפרקי זמן ארוכים ברזולוציה גבוהה בזמן ובמרחב היא מאתגרת. שילוב של תנאי תרבית אופטימליים ושימוש במיקרוסקופ שדה לבן חיוני להשגת תוצאות טובות.

מיקרוסקופ שדה רחב של ליבת ראיית דלתא המצויד בתא סביבתי של תחנת מזג אוויר משמש להדמיית הפרוסות. החדר מתוחזק כל הזמן ב-37 מעלות צלזיוס עם מנגנון זלוף פחמן דו חמצני כדי לשמור על שלב המיקרוסקופ ב-5% פחמן דו חמצני ו-95% הדמיית אוויר מתבצעת בדרך כלל באמצעות עדשת טבילה בשמן 40 פעמים 1.30 NA והתמונות מצולמות עם הצמדת ליבה HQ שניים הנקראים מצלמת CCD Z קטעים נלכדים כל 1.5 מיקרון עד 45 מיקרון של חשיפה לרקמות. יש לשמור על זמן נמוך ככל האפשר, למשל, חמש עד 50 אלפיות השנייה.

עבור כל קטע אמור נלכדות תמונות כל שבע דקות. ניתן לבקר בעד תשע פרוסות באמצעות מערכות הראייה של דלתא. פונקציית ביקור נקודה מדויקת המוצגת כאן היא דוגמה לרצף זמן-lapse של תא אב של חוט השדרה שהועבר עם מבנה המבטא GFP אלפא הדמיית טובולין החלה על פרוסת חוט שדרה מעובר HH שלב 12 בן יומיים.

במהלך שלב מוקדם זה, תאי אב עצביים עוברים בעיקר חלוקות מצב אב אב שבמהלכן התאים מתחלקים ליצירת שני תאי אב מחזוריים נוספים. איור זה מציג פריימים נבחרים מרצף קיטועי הזמן שהוצג זה עתה. לאחר שעתיים ו-20 דקות, התא מתחלק עם מישור מחשוף הניצב למשטח האפיקלי ויוצר שני תאי בת.

שני התאים הללו מתחלקים שוב לאחר 24 שעות ו-23 דקות ו-25 שעות ו-54 דקות. רצף זמן-lapse הבא הוא של תא שעבר טרנספטציה עם G-F-P-G-P-I המסמן את קרום התא. תא זה עובר חלוקה שבמהלכה התהליך הבסיסי מתפצל לשניים המסומנים על ידי החצים הלבנים ועובר בירושה שווה על ידי תאי הבת.

פריימים נבחרים מרצף זמן-lapse זה מראים שחלוקת התא מתרחשת באפס שעות ו-49 דקות. לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לך מושג טוב כיצד להכין ולצלם פרוסות חוט שדרה. זכור, אם אתה חדש בטכניקה זו, אתה עלול להיאבק בהתחלה מכיוון שיש מספר שלבים מאתגרים מבחינה טכנית שכולם צריכים להתאחד כדי שזה יעבוד.