ברזולוציה גבוהה הדמיה חיה של התנהגות התא ב Neuroepithelium פיתוח

המטרה הכללית של הליך זה היא לדימות התנהגות תאים בתוך צינור העצבים העוברי ברזולוציה גבוהה לאורך פרקי זמן ממושכים. דבר זה מושג תחילה על ידי ביצוע חתך רוחבי לצינור העצבים המוקדם עם מבנה המניע ביטוי של חלבון פלואורסצנטי נבחר לסימון תאים בודדים. השלב הבא הוא הכנת פרוסות מהעובר המוקדם והצמדתן למשטחים עם תחתית זכוכית.

לאחר התאוששות באינקובטור, נדגמי פרוסות העוברים מצולמים במיקרוסקופ שדה רחב במרווחי זמן קבועים. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לחקור התנהגות תאים בתוך הנוירו-אפיתליום המתפתח לאורך תקופות זמן ממושכות, ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות לדימוי רקמות חיות הוא שהיא מאפשרת לנו לצפות בהתנהגות תאים בודדים לאורך תקופות זמן ממושכות ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה.

שיטה זו מאפשרת להתייחס לשאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה ההתפתחותית, כגון תפקיפה של התמצאות הציר המיטוטי בבחירת הגורל של התא, או כיצד דינמיקה של איתות עשויה לווסת התנהגות תאים. לפני אלקטרופורציה של פלסמידים לתוך הפרונטון העצבי (neural tube), מכינים מחטים מזכוכית באמצעות מכשיר למשיכת קפילרות מיקרוסקופיות תחת מיקרוסקופ דיסקציה. השתמשו בפינצטה עדינה כדי לשבור את קצה המחט.

קצה המחט צריך להיות חד מספיק כדי לחדור את צינור העצבים, אך לא צר מדי באופן שיפריע להזרקת תמיסת ה-DNA. ה-X עבור ניסוי זה הובאו לדגירה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך כ-36 שעות עד להגעה לשלב 10 של hamburger Hamilton.

כדי להתחיל בהליך זה, יש לבצע חלון לביצה ולהניח אלקטרודות במרחק של 5 mm משני צדי העובר, ולאחר מכן להזריק DNA לתוך צינור העצבים. ה-DNA צבוע בכמות קטנה של fast green לצורך ויזואליזציה. יש להפעיל זרם של 12 עד 17 V עם אורך פולס של 50 ms שלוש פעמים, במרווחים של 950 ms בין הפולסים.

ריכוזים נמוכים של DNA ומתחי אלקטרופורציה נמוכים משמשים להשגת ביטוי פסיפסי (mosaic expression), כך שניתן יהיה לעקוב אחר תאים בודדים. לבסוף, כסו את החלון בקליפת הביצה בסרט דביק (cellar tape), וודאו שהוא אטום. אפשרו לעוברים להתאושש במשך שלוש עד ארבע שעות או במהלך הלילה בטמפרטורה של 37 °C.

יש להכין את תמיסת הקולגן ואת מצע התרבית לפרוסות כשעה לפני חיתוך העוברים. כדי להכין את תמיסת הקולגן, ערבבו 100 µL של תמיסת חומצה אצטית בריכוז 0.1% עם 300 µL של קולגן מסוג one (type one collagen) וערבבו היטב במכשיר vortex; לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של מצע L 15 בריכוז פי 5 וערבבו שוב היטב ב-vortex. התמיסה צריכה להפוך לצבע צהוב.

בשלב הבא, הוסיפו 15 עד 20 µL של sodium bicarbonate בריכוז 7.5%, וערבבו היטב באמצעות וורטקס (vortex). התמיסה צריכה להפוך לוורודת בהיר. שמרו על קרח.

יש להכין תערובת קולגן זו באופן טרי בכל פעם. להכנת מצע לתרבית פרוסות, הוסיפו ל-10 milliliters של neuro basal medium, תוספת B 27, glut max ותמיסת Gentamycin. הניחו את המצע באינקובטור בטמפרטורה של 37 degree Celsius, עם בופר של 5%carbon dioxide. השאירו את מכסה המכל רפוי כדי לאפשר לו להגיע לשיווי משקל עם ה-carbon dioxide למשך שעה אחת לפחות.

כדי להתחיל בהליך זה, השתמשו במספריים קטנים כדי לגזור אתו את העובר. הוציאו את העובר מהביצה באמצעות פינצטה תוך שטיפה במצע L 15. הניחו את העובר בצלחת לתרבית רקמות עם שכבת syl guard בתחתית.

הצמיד את העובר באמצעות סיכות דרך הקרומים העובריים המקיפים אותו, כך שהקרומים יהיו מתוחים. בעזרת סכין מיקרו, בצע חיתוך של העובר בקו ישר ככל האפשר דרך האזור המבוקש. עבור חיתוכי חוט השדרה, עובי הפרוסות צריך להיות בין סומיט אחד לשניים; הצמד את הפרוסות לרקמה הצדית של העובר כדי שלא יאבדו בזמן חיתוך עוברים אחרים.

נדרש טיפ Micro Perpet מותאם אישית להעברת פרוסות חוט השדרה לצלחת בעלת תחתית זכוכית. להכנתו, הצמידו טיפ של 200 µL למטרה (pipette) מסוג P2 או P10 וגזרו כ-1 mm מקצה הטיפ. כסו את פנים הטיפ בקולגן על ידי הכנת 1 µL מתערובת הקולגן שהוכנה קודם לכן.

המתינו דקה עד שתי דקות ולאחר מכן שטפו עם מצע L 15. פעולה זו תמנע מהרקמה להידבק לדופן הפנימית של הטיפ. כעת, הפרידו פרוסה מהעובר באמצעות מיקרו-סכין והוציאו את הפרוסה מהצלחת בעזרת P 2 או P 10 המצוידים בטיפ של 200 µL.

נסו לשאוב כמות מינימלית של מצע. ערבבו את תערובת הקולגן במכשיר Vortex וטפטפו חמישה עד שמונה microliters ממנה על תחתית זכוכית של צלחית מצופה ב-polyol lysine עם כיסוי זכוכית (cover slip) כבסיס; הניחו מיד את פרוסת העובר לתוך הקולגן ומקמו אותה באמצעות פינצטה עדינה. יש למקם את ה-LICs כך שהצד המיועד לדימות יהיה צמוד לכיסוי הזכוכית.

הרקמה צריכה להיצמד לציפוי ה-polyol lysine שעל זכוכית הכיסוי. חזור על פעולה זו עד שיהיו מספר פרוסות על זכוכית הכיסוי. בדרך כלל מניחים שש עד תשע פרוסות בצלחת אחת.

כאשר כל הפרוסות במקומן, הוסף שני עד שלושה microliters של מצע L 15 למקום בו הונח הקולגן ראשון וכסה את הצלחת. אפשר לקולגן להתקשח במשך 20 דקות. לאחר שהקולגן התקשח, הוסף בזהירות שני milliliters של מצע גידול לפרוסות שעבר שיווי משקל למשך שעה אחת לפחות ב-5% carbon dioxide וב-37 degrees Celsius.

יש להקפיד שלא להסיר את הקולגן מהזכוכיתית, להניח באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide, ולאפשר לפרוסות להתאושש למשך שלוש שעות לפחות לפני הדמיה. הדמיה של התנהגות תאים בתוך רקמה לאורך פרקי זמן ממושכים ברזולוציה זמנית ומרחבית גבוהה היא מאתגרת. שילוב של תנאי תרבית אופטימליים ושימוש במיקרוסקופיה בשדה בהיר חיוני להשגת תוצאות טובות.

לצילום הפרוסות נעשה שימוש במיקרוסקופ שדה רחב מדגם delta vision core המצויד בתא סביבתי של weather station. התא נשמר באופן קבוע בטמפרטורה של 37 °C באמצעות מכשיר פרפוזיה של פחמן דו-חמצני, כדי לשמור על במה המיקרוסקופ בריכוז של 5% carbon dioxide ו-95% Air. הצילום מבוצע בדרך כלל באמצעות עדשת טבילה בשמן 40x עם NA של 1.30, והתמונות נלכדות באמצעות מצלמת CCD מסוג core snap HQ two. נתחי Z נלכדים בכל 1.5 µm לאורך חשיפה של 45 µm של רקמה. יש לשמור על זמן חשיפה נמוך ככל האפשר, למשל, בין 5 ל-50 ms.

עבור כל אחד מהמקטעים האמורים, תמונות נלכדות מדי שבע דקות. ניתן לבקר עד תשעה פרוסות באמצעות מערכות ה-Delta vision. פונקציית ביקור הנקודות המדויקת המוצגת כאן היא דוגמה לרצף time-lapse של תא מקור של חוט השדרה שעבר טרנספקציה עם קונסטרוקט המבטא GFP alpha Tubulin; הדימוג החל על פרוסת חוט שדרה מעובר בן יומיים בשלב HH 12.

במהלך שלב מוקדם זה, תאי אב עצביים עוברים בעיקר חלוקות במצב של תא אב-תא אב, שבהן התאים מתחלקים כדי ליצור שני תאי אב מחזוריים נוספים. איור זה מציג פרמים נבחרים מרצף הצילומי המהיר (time-lapse) שהוצג זה עתה. לאחר שעתיים ו-20 דקות, התא מתחלק במישור חלוקה הניצב לפני השטח האפיתלי, ובכך יוצר שני תאי בת.

שני התאים הללו מתחלקים פעם נוספת לאחר 24 שעות ו-23 דקות ולאחר 25 שעות ו-54 דקות. רצף ה-time-lapse הבא הוא של תא שעבר טרנספקציה עם G-F-P-G-P-I המסמן את ממברנת התא. תא זה עובר חלוקה שבמהלכה התהליך הבזאלי (basal process) נחלק לשניים, כפי שמסומן בחצים הלבנים, ומתורש בצורה שווה לתאי הבת.

פרמים נבחרים מרצף ה-time-lapse הזה מראים כי חלוקת התא מתרחשת בשעה 0 ו-49 דקות. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן ההכנה והדימוג של פרוסות חוט השדרה. זכרו, אם אתם חדשים בטכניקה זו, ייתכן שתתקשו בתחילה, שכן ישנם מספר שלבים מאתגרים מבחינה טכנית שכולם צריכים להסתנכרן כדי שהתהליך יצליח.