ברזולוציה גבוהה הדמיה חיה של התנהגות התא ב Neuroepithelium פיתוח

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לדמות את התנהגות התאים בתוך צינור העצבים העוברי ברזולוציה גבוהה למשך פרקי זמן ממושכים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי ביצוע חתך רוחבי בצינור העצבים השלב העוברי עם קונסטרקט המניע ביטוי של חלבון פלואורסצנטי נבחר לסימון תאים בודדים. השלב הבא הוא הכנת פרוסות מהעוברי השלב המוקדם והצמדתן לצלחות עם תחתית זכוכית.

לאחר התאוששות באינקובטור, מדגמי פרוסות העובר מצולמים תחת מיקרוסקופ שדה רחב במרווחי זמן קבועים. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לחקור התנהגות תאים בתוך הנוירו-אפיתל המתפתח לאורך תקופות זמן ממושכות, ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות לדימות רקמות חיות הוא שהיא מאפשרת לנו לצפות בהתנהגות של תאים בודדים לאורך תקופות זמן ממושכות ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה.

שיטה זו מאפשרת להתייחס לשאלות מפתח בתחום הנוירוביולוגיה ההתפתחותית, כגון תפקיפה של אוריינטציית כישורי המיטוזה בבחירת סולפטים, או כיצד דינמיקה של אותים עשויה לווסת את התנהגות התאים לפני אלקטרופורציה של פלסמידים לתוך צינור העצבים. מחטים מזכוכית מוכנות באמצעות שובר קפילרי (micro capillary puller) תחת מיקרוסקופ דיסקציה. השתמשו בפינצטה עדינה כדי לשבור את קצה המחט.

קצה המחט צריך להיות חד מספיק כדי לחדור את צינור העצבים, אך לא צר מדי באופן שיעכב את הזרקת תמיסת ה-DNA. ה-X לניסוי זה דגרו ב-37 °C למשך כ-36 שעות כדי להגיע לשלב 10 לפי Hamilton.

כדי להתחיל בהליך זה, יש לבצע חלון בביצה ולהניח אלקטרודות במרחק של חמישה מילימטרים זו מזו משני צדי העובר, ולהזריק DNA אל תוך הנוירוטוב (צינור העצבים). ה-DNA צבוע בכמות קטנה של fast green לצורך ויזואליזציה. יש להחיל זרם של 12 עד 17 וולט ובאורך פולס של 50 מילישניות שלוש פעמים, עם מרווח של 950 מילישניות בין הפולסים.

ריכוזים נמוכים של DNA ומתחי אלקטרופורציה נמוכים משמשים להשגת ביטוי פסיפסאי (mosaic expression) כך שניתן יהיה לעקוב אחר תאים בודדים. לבסוף, כסו את החלון בקליפת הביצה בסרט דביק (cellar tape), וודאו שהוא אטום. אפשרו לעוברים להתאושש במשך שלוש עד ארבע שעות או למשך הלילה בטמפרטורה של 37 °C.

יש להכין את תערובת הקולגן ואת מצע השבילים (slice culture medium) כשעה לפני חיתוך העובריים. כדי להכין את תערובת הקולגן, יש להוסיף 100 µL של תמיסת חומצה אצטית בריכוז 0.1% ל-300 µL של קולגן מסוג 1 (type one collagen) ולערבב היטב במכשיר וורטקס (vortex), לאחר מכן להוסיף 100 µL של מצע L 15 בריכוז פי 5 (5×) ולערבב שוב היטב בוורטקס. בשלב זה, התמיסה אמורה להפוך לצהובה.

בשלב הבא, יש להוסיף 15 עד 20 µL של sodium bicarbonate בריכוז 7.5%, ולערבל היטב במערבל Vortex. התמיסה צריכה להפוך לוורודה בהיר. יש לשמור על קרח.

יש להכין תערובת קולגן זו באופן רענן בכל פעם. להכנת מצע לתרבית פרוסות, הוסיפו ל-10 milliliters של neuro basal medium, תוסף B 27, glut max ותמיסת Gentamycin; הניחו את המצע באינקובטור בטמפרטורה של 37 degree Celsius, המאוזן עם 5% carbon dioxide. השאירו את מכסה המיכל רפויה כדי לאפשר לו להגיע לשיווי משקל עם ה-carbon dioxide למשך שעה אחת לפחות.

כדי להתחיל בהליך זה, השתמשו במספריים קטנים כדי לגזור את העובר. הוציאו את העובר מהביצה באמצעות פינצטה ושטפו אותו במצע L 15. הניחו את העובר בצלחת לתרבית רקמות עם שכבת syl guard בתחתית.

הצמד את העובר באמצעות סיכות דרך קרומי העוברי החיצוניים המקיפים אותו, כך שהקרומים יהיו מתוחים. באמצעות סכין מיקרו, בצע חיתוך של העובר בקו ישר ככל האפשר דרך האזור הנחקר. עבור חיתוכי חוט השדרה, העובי צריך להיות בין סומייט אחד לשניים; הצמד את החיתוכים לרקמה הלטראלית של העובר כדי שלא יאבדו בזמן חיתוך עוברים אחרים.

נדרש טיפ Micro Perpet מותאם אישית להעברת פרוסות חוט השדרה לצלוחית עם תחתית זכוכית. כדי להכינו, חברו טיפ של 200 microliter לפיפט P2 או P10 וגזרו כ-1 millimeter מקצה הטיפ. צפו את פנים הטיפ בקולגן על ידי הכנת 1 microliter מתערובת הקולגן שהוכנה קודם לכן.

השאירו למשך דקה עד שתי דקות ולאחר מכן שטפו עם מצע L 15. פעולה זו תמנע מהרקמה להידבק לדופן הפנימית של הטיפ. כעת הפרידו פרוסה מהעובר באמצעות מיקרו-סכין והוציאו את הפרוסה מהצלחה באמצעות P 2 או P 10 המצוידים בטיפ של 200 µL.

נסו לשאוב כמות מזערית ככל האפשר של המצע. ערבלו במכשיר vortex את תערובת הקולגן וטפטפו ממנה כ-5 עד 8 µL על גבי צלח עם תחתית זכוכית מצופה polyol lysine עם כיסוי זכוכית (cover slip) כבסיס; הניחו מיד את פרוסת העובר לתוך הקולגן ומקמו אותה באמצעות פינצטה עדינה. יש למקם את ה-LICs כך שהצד המיועד לדימוג יהיה צמוד לכיסוי הזכוכית.

הרקמה צריכה להיצמד לציפוי ה-polyol lysine על גבי הזכוכית המכסה. חזור על פעולה זו עד לקבלת מספר פרוסות על גבי הזכוכית המכסה. בדרך כלל מניחים שש עד תשע פרוסות בצלחת אחת.

כאשר כל הפרוסות במקומן, הוסיפו שני עד שלושה מיקרוליטרים של מצע L 15 למקום שבו הונח הקולגן ראשון וכסו את הצלחית. המתינו 20 דקות עד שהקולגן יתקשה. לאחר שהקולגן התקשה, הוסיפו בזהירות שני מיליליטרים של מצע גידול לפרוסות, שעבר שיווי משקל למשך שעה אחת לפחות ב-5% carbon dioxide וב-37 degrees Celsius.

יש להקפיד לא לנתק את הקולגן מהזכוכית המכסה. יש להניח את הדגימות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ובריכוז של 5% carbon dioxide, ולאפשר לפרוסות להתאושש למשך שלוש שעות לפחות לפני הדימות. דימות של התנהגות תאים בתוך רקמה למשך פרקי זמן ממושכים ברזולוציה זמנית ומרחבית גבוהה הוא מאתגר. שילוב של תנאי תרבית אופטימליים ושימוש במיקרוסקופיית שדה בהיר חיוני להשגת תוצאות טובות.

לדימוי הפרוסות נעשה שימוש במיקרוסקופ שדה רחב מסוג delta vision core המצויד בתא סביבתי של weather station. התא מתוחזק באופן קבוע בטמפרטורה של 37 °C עם מכשיר פרפוזיה של פחמן דו-חמצני כדי לשמור על משטח המיקרוסקופ בריכוז של 5% carbon dioxide ו-95% Air. הדימוי מבוצע בדרך כלל באמצעות עדשת טבילה בשמן 40x עם NA 1.30, והתמונות נלכדות באמצעות מצלמת CCD מסוג core snap HQ two. נתחים של Z נלכדים בכל 1.5 µm לאורך חשיפה של 45 µm של רקמה. יש לשמור על זמן חשיפה נמוך ככל האפשר, לדוגמה, בין 5 ל-50 milliseconds.

עבור כל חתך כאמור, נלכדות תמונות בכל שבע דקות. ניתן לבקר עד תשעה חתכים באמצעות מערכות הראייה של Delta. פונקציית ביקור הנקודות המדויקת המוצגת כאן היא דוגמה לרצף time-lapse של תא מקור של חוט השדרה שהוחדר בקונסטרקט המבטא GFP alpha Tubulin; הדמיה החלה בחתך של חוט שדרה מעובר בן יומיים בשלב HH 12.

במהלך שלב מוקדם זה, תאי אב עצביים עוברים בעיקר חלוקות במוד של תא-אב לתא-אב, שבהן התאים מתחלקים כדי ליצור שני תאי אב נוספים הנמצאים במחזור חלוקה. איור זה מציג פריימים נבחרים מרצף ה-time-lapse שהוצג זה עתה. לאחר שעתיים ו-20 דקות, התא מתחלק עם מישור חלוקה הניצב לפני השטח האפיקאלי, ובכך יוצר שני תאי בת.

שני תאים אלה מתחלקים שוב לאחר 24 שעות ו-23 דקות ולאחר 25 שעות ו-54 דקות. רצף צילומי ההשמעה (time-lapse) הבא הוא של תא שעבר טרנספקציה עם G-F-P-G-P-I המסמן את ממבראת התא. תא זה עובר חלוקה ש במהלכה הזרוע הבסיסית (basal process) מתפצלת לשתיים, כפי שמודגש על ידי החצים הלבנים, ומורשת באופן שווה לתאי הבת.

פרימרים נבחרים מרצף צילומי הזמן (time-lapse) מראים כי חלוקת התא מתרחשת בשעה 0 ו-49 דקות. לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לכם מושג טוב כיצד להכין ולדגם פרוסות של חוט השדרה. זכרו, אם אתם חדשים בטכניקה זו, ייתכן שתתקשו בתחילה, כיוון שישנם מספר שלבים מאתגרים מבחינה טכנית שכולם חייבים להצליח כדי שהתהליך יעבוד.