זיהוי רצף ספציפי, סלקטיבי של גדילי כפול RNAs מעל חד גדילי RNAs על ידי שינוי כימי חומצות גרעין פפטיד
21 בספטמבר 2017
אנחנו מדווחים הפרוטוקולים לסינתזה ולשנות טיהור של פפטיד חומצת גרעין (הרשות) oligomers שילוב משקעים. שיטות אפיון ההכרה של RNA דופלקסים מאת Pna ששונה הביוכימי, biophysical מתוארים.
המטרה הכללית של מאמר שיטות זה היא להציג את הפרוטוקולים המפורטים שבהם משתמש המעבדה שלנו לחקר הזיהוי המולקולרי של RNA דו-גדילי על ידי חומצות גרעיניות פפטידיות (peptide nucleic acids) שעברו שינוי כימי. שיטה זו עשויה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה הכימית של ה-RNA, כגון זיהוי ומיקוד של מבני RNA. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שעקרונות התכנון ניתנים ליישום עבור מיקוד של מבני duplex של RNA כלשהם.
את הפרוצדורה תדגים Desiree Toh, עובדת מחקר מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, הוסיפו ארבעה µL של תמיסת glycerol בריכוז 35% לדגימות RNA PNA שהוכנו מראש וערבבו בעדינות. בעזרת מיקרופיפט וטיפים לטעינת ג'ל, העבירו בזהירות 20 µL מכל דגימה לג'ל polyacrylamide שהוכן מראש, תוך הקפדה על מניעת היווצרות בועות אוויר.
הריצו את הג'ל במתח קבוע של 250 וולט למשך חמש שעות. לאחר חמש שעות, כבו את ספק הכוח והסירו את לוחית הזכוכית ממעמד הג'ל. לאחר מכן, הסירו את סרט האיטום של הג'ל פרקו את לוחית הזכוכית.
הוציאו בעדינות את הג'ל מלוח הזכוכית והניחו אותו במכל המלא ב-350 milliliters של מים דה-יוניים. הוסיפו בזהירות 35 microliters של אתידיום ברומיד למכל והניחו אותו על מערער פלטפורמה במהירות נמוכה למשך 30 דקות. לאחר השלכת תמיסית האתידיום ברומיד, שטפו את הג'ל ב-1.5 עד שני ליטרים של מים מזוקקים.
לאחר מכן, סרוקו את הג'ל באמצעות מכשיר הדמיה עם לייזר ירוק של 532 nanometers ומסנן פליטה המוגדר על 610 nanometers. כמיו את עוצמת הפסים בג'ל באמצעות תוכנה חופשית. העבירו כמות מתאימה של RNA דו-גדילי המסומן ב-2-aminopurine למבחנה נקייה של 1.5 milliliter.
לאחר מכן, רכזו את תמיסות ה-RNA באמצעות מרכז Vacuum. לאחר מכן, העבירו נפחים מתאימים של ה-PNA המיועד לריכוזים שונים מהמלאי הראשי שהוכן קודם לכן למבחנות נפרדות בנפח 1.5 מיליליטר. רכזו את תמיסות ה-PNA באמצעות מרכז ה-Vacuum.
הוסיפו 975 µL של בופר אינקובציה למבחנה המכילה את ה-RNA המיובש וערבבו היטב כדי להבטיח שכל ה-RNA נמס. לאחר סנטריפוגה קצרה של תמיסת ה-RNA, בצעו תהליך אנילינג (annealing) על ידי הצבת המבחנה בבלוק חימום שחומם מראש למשך 10 דקות. בסיום, כבו את בלוק החימום והניחו לדגימה להתקרר לטמפרטורת החדר.
הוסיפו 75 µL של RNA לכל אחת מהמבחנות המכילות את ה-PNA המיובש וערבבו היטב. לאחר השהייה של הדגימות בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת לפחות, דגרו אותן בטמפרטורה של 4 °C למשך הלילה. כעת, העבירו כמויות מתאימות של RNA גדילי אחד המסומן ב-2-aminopurine למבחנות נפרדות בנפח של 1.5 mL.
העבירו את הנפחים המתאימים של PNA המטרה עבור ריכוזים שונים מהמלאי הראשי לשפופרות המתאימות המכילות את ה-RNA החד-גדילי. לאחר ייבוש הדגימות, הוסיפו 75 µL של בופר אינקובציה לכל אחת מהשפופרות וערבבו היטב. חשפו כל דגימה לאנילינג (annealing) על ידי הנחת כל שפופרת בבלוק חימום שחומם מראש למשך 10 דקות.
לאחר שהדגימות התקררו לטמפרטורת החדר, הדגריתו אותן בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס במהלך הלילה. לאחר מכן, העבירי 70 µL מכל דגימה לקובט (cuvette) ריבועי של סנטימטר אחד. הכניסי את הקובט לספקטרופוטומטר פלואורסצנציה ומדדי את הפליטה בטווח אורכי גל של 330 עד 550 nm.
עם השלמת המדידה, הוצא את הבאפר מהקובית. שטוף את הקובית במים מזוקקים ויבש אותה באמצעות גז חנקן. לאחר חזרה על המדידה עבור כל הדגימות, שרטט את עוצמת הפלואורסצנציה כפונקציה של אורך הגל.
העבירו כמויות מתאימות של RNA גדילי אחד למבחנות נפרדות בנפח 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, העבירו נפחים מתאימים של PNA ממוקד מהמלאי הראשי למבחנות המתאימות המכילות את ה-RNA גדילי אחד. לאחר ייבוש הדגימות, הוסיפו 130 microliters של תמיסת אינקובציה לכל אחת מהמבחנות וערבבו היטב.
העבירו כל דגימה לתהליך אנילינג (annealing) על ידי הנחת כל מבחנה בתוך בלוק חימום שחומם מראש למשך 10 דקות. לאחר קירור הדגימות לטמפרטורת החדר, הדגירו אותן בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה. כעת, העבירו 130 µL מכל דגימה לקוובט בעל שמונה מיקרו-תאים (eight microcell cuvette), כאשר תא אחד מכיל באפר דגירה.
באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis, מדוד את הבליעה של כל דגימה באורך גל של 260 ננומטר. בצע את המדידה בטמפרטורה עולה מ-15 עד 95 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן בטמפרטורה יורדת מ-95 עד 15 מעלות צלזיוס, בקצב עלייה/ירידה של 0.5 מעלות צלזיוס לדקה. אוליגומרים של PNA הופקו לאחר שני סבבי טיהור ב-HPLC פאזה הפוכה.
ניתן לאשש את זהותם של ה-PNAs באמצעות אנליזת MALDI/TOF. הנתונים מ-PAGE שאינו דנטורנטי (nondenaturing) מעידים כי ה-PNA המודף עם Q ו-L יכול לזהות רק את אזור ה-RNA דו-גדילי בעל זוג C-G. זיהוי ספציפי ומשופר זה מתבצע באמצעות היווצרות של שלשה (triple) של שני בסיסים בין ה-PNA ל-RNA של T-A-U-L-G-C ושל Q-C-G.
מחקר טיטראציה של פלואורסצנציית 2-aminopurine הראה כי PNA ששונה באמצעות Q ו-L נקשר ל-RNA דו-גדילי מטר, אך לא ל-RNA חד-גדילי. PNAs המכילים שאריות Q אינם מראים מעברי התכה תרמית, מה שמרמז על היעדר קישור ל-RNA חד-גדילי בשל התנגשות סטרית בזוג Q-G הדמוי Watson-Crick. בהשוואה ל-PNA לא שונה P1, ה-PNAs P4 ו-P5 המכילים שאריות L מראים טמפרטורת התכה נמוכה יותר עבור דופלקסי ה-RNA-PNA המתאימים בשל ההתנגשות הסטרית בזוג L-G הדמוי Watson-Crick.
נתוני ההמסה התרמית שזוהו באמצעות בליעת UV עקביים עם נתוני תיתור הפלואורסצנציה של 2-aminopurine, אשר מראים גם הם ש-PNA המכיל שאריות Q ו-L אינו נקשר בעוצמה ל-RNA גדיוליเดียว. שילוב של בסיס Q הוא דסטביליזציה חזקה יותר מאשר בסיס L, מכיוון שלבסיס Q יש התנגשות סטרית משמעותית יותר ביצירת זוג Q-G דמוי ווטסון-קריק. ברגע ששולטים בשיטה, ניתן לבצע את הניסויים השונים בתוך שבוע אם הם מבוצעים כראוי.
בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון בדיקה ומיקוד של מבני RNA בתאים, במטרה לענות על שאלות נוספות, כמו האם ניתן לזהות מבני RNA ולהסדיר את תפקודי ה-RNA באמצעות PNAs קושרים ל-RNA דו-גדילי. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחומי הביולוגיה של RNA ומחקרים של מחלות לחקור פיתוח טיפולי המכוון למבני RNA.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקולים לסינתזה ולטיהור של אוליגומרים של חומצת גרעין פפטידית (PNA) בעלי שאריות משובשבות. הוא מפרט שיטות ביוכימיות וביופיזיקליות לאפיון הזיהוי של דופלקסים של RNA על ידי PNAs משובשבים אלה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה כימית של RNA
- חומצות נוקלאאיות פפטידיות
- זיהוי מולקולרי
רקע
- ניתן לבצע שינויים כימיים באוליגומרים של PNA כדי לשפר את תכונות הקישור שלהם.
- הבנת זיהוי מבנה ה-RNA היא קריטית ליישומים שונים בביולוגיה מולקולרית.
- PNAs שעברו שינוי יכולים להתמקד במבני דופלקס ספציפיים של RNA.
- שיטות אפיון כוללות ספקטרוסקופיה של פלואורסצנציה ו-UV-Vis.
מטרת המחקר
- אספקת פרוטוקולים מפורטים לחקר זיהוי RNA על ידי PNAs משופרים.
- בחינת יעילות הקישור של PNAs ל-RNA דו-גדילי לעומת RNA חד-גדילי.
- ביסוס מתודולוגיה שניתן להחילה על מבני RNA שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- סינתזה וטיהור של אוליגומרים של PNA.
- אלקטרופורזה לניתוח אינטראקציות בין RNA ל-PNA.
- ספקטרופוטומטריית פלואורסצנציה למדידת זיקות קישור (binding affinities).
- ספקטרופוטומטריית UV-Vis לניתוח המסה תרמית (thermal melting).
תוצאות עיקריות
- PNAs שעברו מודיפיקציה הראו זיהוי משופר של דופלקסים ספציפיים של RNA.
- PNAs עם מודיפיקציות Q ו-L נקשרים באופן סלקטיבי ל-RNA דו-גללי.
- נתוני המסה תרמית העידו על הבדלים ביציבות הקישור.
- נמצא כי שאריות Q גורמות לדה-סטביליזציה של הקישור עקב התנגשויות סטריות.
מסקנות
- הפרוטוקולים שנקבעו יכולים לסייע למחקרים נוספים בתחום הת targeting של RNA.
- הבנת מודיפיקציות של PNA יכולה להוביל לשיפור בשיטות גילוי של RNA.
- ממצאים אלו תורמים לתחום הרחב של ביולוגיה כימית של RNA.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
חומצות גרעיניות פפטידיות (PNAs) שעברו שינוי כימי מאפשרות זיהוי ספציפי לרצף של RNA דו-גדילי (dsRNA) על פני RNA חד-גדילי (ssRNA), ובכך מספקות גשושית סלקטיבית למטרות מבניות של RNA. סלקטיביות זו תומכת בתיקוף של מטרות בביולוגיה כימית של RNA על ידי הבחנה בין דופלקסים פונקציונליים לבין מיני ssRNA חולפים. שיטה זו תורמת להורדת סיכונים מכניסטיים בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי אישור ספציפיות הקישור לפני השקעה בשלבים הבאים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי אישור קישוריות של PNA לרצפי dsRNA ספציפיים עם זוגות C-G.
- ערך תפעולי: משתמש ב-PAGE לא דנטורטיבית ובפלואורסצנציית 2-aminopurine כדי לכמת זיקות קישור וסלקטיביות.
- ערך ניבוי: מבדיל בין קישור סלקטיבי ל-dsRNA לבין אינטראקציות לא ספציפיות עם ssRNA, ובכך מפחית תוצאות חיוביות שגויות בזיהוי מטרות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר נתונים כמותיים של פלואורסצנציה והמסה תרמית עבור פרופילי תגובה למינון וסלקטיביות.
- שחזוריות: אלקטרופורזה של ג'ל וספקטרופוטומטריה סטנדרטיות מאפשרות תיקוף של אינטראקציות PNA-RNA בין מעבדות שונות.
- מדרגיות: תומך בבדיקה של מספר רב של RNA hairpins או דופלקסים עם מוטציות של בסיס בודד לצורך מיפוי ספציפיות קישור.
מחקר תרגומי ו-Preclinical
- המשכיות תרגומית: זיהוי מאושר של dsRNA תומך במעבר לסריקה תאית של מבני RNA.
- התאמה לסממנים ביולוגיים: קישור סלקטיבי ל-RNA בעל מבנה מאפשר זיהוי של קונפורמציות RNA הקשורות למחלה.
- הפחתת סיכונים: היעדר קישור ל-ssRNA מפחית את הסיכון לפגיעה במטרות לא רצויות (off-target) בתכנון ליגנדים טיפוליים.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה נכללת ברצף הגילוי השוכן בין תיקוף המטרה לזיהוי מוביל, כאשר זיהוי סלקטיבי של dsRNA מכוון את תיעדוף שיטות הטיפול המכוונות ל-RNA.
- ביולוגיה של גילוי: בודק מעורבות מטרה על ידי מדידת קישור PNA למבני dsRNA מוגדרים לעומת בקרות ssRNA.
- סריקה: מאפשר פיתוח בדיקה לסריקת סלקטיביות באמצעות תיטור Fluorescence ובדיקות Thermal Shift.
- אנליטיקה: מספק פלטים כמותיים הכוללים זיקת קישור (Kd), יציבות תרמית (Tm) ויחסי סלקטיביות.
- מחקר תרגומי: מאשר סלקטיביות מבנית הדרושה למחקרי מעורבות מטרה תאיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר להערכת מודיפיקציות PNA על פני מטרות RNA מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: הפחתת סיכונים מכניסטית באמצעות זיהוי סלקטיבי של dsRNA על פני ssRNA.
- ערך תפעולי: תהליכי עבודה סטנדרטיים עבור סינתזה, טיהור ואפיון ביופיזיקלי.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות go/no-go בהתבסס על סלקטיביות קישור ופרופילי יציבות תרמית.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיאום סדרי עדיפויות מותאם סיכון של מובילי PNA עם ספציפיות מוכחת ל-dsRNA.
שיקולי יישום
- מומחיות בסינתזה של חומצות נוקלאאיות פפטידיות באמצעות שיטות פאזה מוצקה בכימיית Boc.
- גישה למערכות HPLC בעמודה עם פאזה הפוכה, MALDI-TOF ו-PAGE שאינו דנטורטיבי.
- ספקטרופוטומטריית פלואורסצנציה ו-UV-Vis לניתוח קישור וניתוח תרמי.
- סטנדרטיזציה של באפרי אינקובציה, פרוטוקולי התאבלה (annealing) ונהלי צביעת ג'לים.
- שיקולי התאמה עבור אורכי RNA משתנים, מבנה ותאימות למודיפיקציות.
