זיהוי רצף ספציפי, סלקטיבי של גדילי כפול RNAs מעל חד גדילי RNAs על ידי שינוי כימי חומצות גרעין פפטיד
21 בספטמבר 2017
אנחנו מדווחים הפרוטוקולים לסינתזה ולשנות טיהור של פפטיד חומצת גרעין (הרשות) oligomers שילוב משקעים. שיטות אפיון ההכרה של RNA דופלקסים מאת Pna ששונה הביוכימי, biophysical מתוארים.
המטרה הכוללת של מאמר שיטות זה היא להציג את הפרוטוקולים המפורטים המשמשים את המעבדה שלנו לחקר הזיהוי המולקולרי של RNA דו-גדילי על ידי חומצות גרעין פפטידיות שעברו שינוי כימי. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה הכימית של RNA כגון זיהוי ומיקוד של מבני RNA. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שעקרונות העיצוב יכולים להיות ישימים למיקוד של כל מבני דופלקס RNA.
תדגים את ההליך דזירה טו, עמיתת מחקר מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בהליך זה, הוסף ארבעה מיקרוליטרים של תמיסת גליצרול 35% לדגימות RNA PNA שהוכנו בעבר וערבב בעדינות. בעזרת מיקרופיפטה וטיפים לטעינת ג'ל, יש לשפוך בזהירות 20 מיקרוליטר מכל דגימה לג'ל פוליאקרילאמיד שהוכן בעבר ולהקפיד לא להכניס בועות אוויר.
הפעל את הג'ל במתח קבוע של 250 וולט למשך חמש שעות. לאחר חמש שעות, כבה את אספקת החשמל והסר את לוחית הזכוכית ממעמד הג'ל. לאחר מכן הסר את סרט האיטום הג'ל ופרק את לוחית הזכוכית.
הסר בעדינות את הג'ל מצלחת הזכוכית והניח אותו בכלי מלא ב -350 מיליליטר מים דה-יונים. מוסיפים בזהירות 35 מיקרוליטר של אתידיום ברומיד למיכל ומניחים אותו על שייקר הפלטפורמה במהירות נמוכה למשך 30 דקות. לאחר השלכת תמיסת האתידיום ברומיד, יש לשטוף את הג'ל ב-1.5 עד שני ליטר מים מזוקקים.
לאחר מכן סרוק את הג'ל באמצעות הדמיה עם לייזר ירוק של 532 ננומטר ומסנן הפליטה מוגדר ל-610 ננומטר. כמת את עוצמות רצועת הג'ל באמצעות תוכנה חופשית. העבירו את הכמות המתאימה של 2-אמינופורין עם תווית RNA דו-גדילי לתוך צינור נקי של 1.5 מיליליטר.
לאחר מכן רכזו את תמיסות ה-RNA באמצעות רכז ואקום. לאחר מכן, העבירו את הנפחים המתאימים של ה-PNA הממוקד לריכוזים שונים מהמלאי הראשי שהוכן בעבר כדי להפריד צינורות של 1.5 מיליליטר. רכז את תמיסות ה-PNA באמצעות רכז הוואקום.
הוסף 975 מיקרוליטר של מאגר דגירה לצינור המכיל את ה-RNA המיובש וערבב היטב כדי להבטיח שכל ה-RNA מומס. לאחר צנטריפוגה קצרה של תמיסת ה- RNA, הכניסו אותה לחישול על ידי הנחת הצינור לגוש חום שחומם מראש למשך 10 דקות. בסיום, כבה את גוש החום ואפשר לדגימה להתקרר לטמפרטורת החדר.
מוסיפים 75 מיקרוליטר RNA לכל אחד מהצינורות המכילים את ה-PNA המיובש ומערבבים היטב. לאחר שאפשרו לדגימות לשבת בטמפרטורת החדר למשך שעה לפחות, דגרו אותן בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. כעת, העבירו את הכמויות המתאימות של 2-אמינופורין המסומן ב-RNA חד-גדילי לצינורות נפרדים של 1.5 מיליליטר.
להעביר את הכמויות המתאימות של PNA ממוקד לריכוזים שונים מהמלאי הראשי לצינורות המתאימים המכילים את ה-RNA החד-גדילי. לאחר ייבוש הדגימות, הוסיפו 75 מיקרוליטר של מאגר דגירה לכל אחד מהצינורות וערבבו היטב. הכניסו כל דגימה לחישול על ידי הנחת כל צינור בגוש חום שחומם מראש למשך 10 דקות.
לאחר שאפשרו לדגימות להתקרר לטמפרטורת החדר, דגרו אותן בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר מכן, העבירו 70 מיקרוליטר מכל דגימה לקובטה מרובעת של סנטימטר אחד. הנח את הקובט בספקטרופוטומטר פלואורסצנטי ומדוד את הפליטה בטווח אורכי גל של 330 עד 550 ננומטר.
לאחר השלמת המדידה, הסר את המאגר מהקובטה. שוטפים את הקובט במים מזוקקים ומייבשים בגז חנקן. לאחר חזרה על המדידה עבור כל הדגימות, שרטט את עוצמת הקרינה מול אורך הגל.
העבירו את הכמויות המתאימות של RNA חד-גדילי כדי להפריד צינורות של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן העבירו את הנפחים המתאימים של PNA ממוקד מהמלאי הראשי לצינורות המתאימים המכילים את ה-RNA החד-גדילי. לאחר ייבוש הדגימות, הוסיפו 130 מיקרוליטר של מאגר דגירה לכל אחד מהצינורות וערבבו היטב.
הכניסו כל דגימה לחישול על ידי הנחת כל צינור בגוש חום שחומם מראש למשך 10 דקות. לאחר שאפשרו לדגימות להתקרר לטמפרטורת החדר, דגרו אותן בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. כעת, העבירו 130 מיקרוליטר מכל דגימה לקובטה של שמונה מיקרו-תאים עם תא אחד המכיל מאגר דגירה.
בעזרת ספקטרופוטומטר UV-Vis, מדוד את הספיגה של כל דגימה ב-260 ננומטר. יש למדוד בטמפרטורה עולה מ-15 ל-95 מעלות צלזיוס ואחריה להוריד את הטמפרטורה מ-95 ל-15 מעלות צלזיוס בקצב רמפה של 0.5 מעלות צלזיוס לדקה. אוליגומרים של PNA הושגו לאחר שני טיהורי HPLC בשלב הפוך.
ניתן לאשר את זהות ה-PNAs על ידי ניתוח MALDI/TOF. נתוני ה-PAGE הלא-דנטורינג מצביעים על כך שה-PNA שהשתנה Q ו-L יכול לזהות רק את אזור ה-RNA הדו-גדילי עם זוג C-G. זיהוי ספציפי ומשופר זה הוא באמצעות ה-T-A-U-L-G-C ו-Q-C-G PNA RNA שני תצורות משולשות.
מחקר טיטרציה פלואורסצנטי של 2-אמינופורין הראה כי PNA ששונה ב-Q ו-L נקשר ל-RNA דו-גדילי ממוקד אך לא ל-RNA חד-גדילי. PNAs המכילים שאריות Q אינם מראים מעברי התכה תרמיים המרמזים על היעדר קשירה ל-RNA חד-גדילי עקב ההתנגשות הסטרית בצמד ווטסון ווטסון-קריק כמו Q-G. בהשוואה ל-PNA P1 ללא שינוי, PNAs P4 ו-P5 המכילים שאריות L מראים טמפרטורת התכה נמוכה יותר עבור דופלקסים RNA PNA המתאימים עקב ההתנגשות הסטרית בצמד ווטסון-קריק כמו LG.
נתוני ההיתוך התרמי שזוהו על ידי ספיגת UV עולים בקנה אחד עם נתוני טיטרציית הקרינה של 2-אמינופורין, המראים גם כי PNA המכיל שאריות Q ו-L אינו נקשר חזק ל-RNA חד-גדילי. שילוב בסיס Q מערער יותר מבסיס L מכיוון שלבסיס Q יש התנגשות סטרית משמעותית יותר ביצירת זוג ווטסון-קריק כמו Q-G. לאחר השליטה, ניתן לבצע את הניסויים השונים תוך שבוע אם הם מבוצעים כראוי.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון בדיקה ומיקוד של מבני RNA בתאים על מנת לענות על שאלות נוספות כמו האם אנו יכולים לזהות מבני RNA ולווסת את תפקודי ה-RNA באמצעות PNAs קושרי RNA דו-גדיליים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה והמחלה של RNA לחקור את מבנה ה-RNA פיתוח טיפולי ממוקד.
סקירה
מאמר זה מציג פרוטוקולים לסינתזה ולטיהור של אוליגומרים של חומצה פפטידית-נוקליאית (PNA) עם שיירים שונים. הוא מפרט שיטות ביוכימיות וביופיזיקליות לאופיין את הזיהוי של דופלקסים של RNA על ידי PNAs שונים אלו.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- ביולוגיה כימית של RNA
- חומצות פפטידיות-נוקליאיות
- זיהוי מולקולרי
רקע
- ניתן לשנות כימית אוליגומרים של PNA כדי לשפר את תכונות ההקשרות שלהם.
- הבנת זיהוי מבנה ה-RNA חיונית ליישומים שונים בביולוגיה מולקולרית.
- PNAs שונים יכולים לכוון למבני דופלקס RNA ספציפיים.
- שיטות האופיינן כוללות ספקטרוסקופיית פלואורסצנציה וספקטרוסקופיית UV-Vis.
מטרת המחקר
- לספק פרוטוקולים מפורטים לחקר הזיהוי של RNA על ידי PNAs שונים.
- לחקור את יעילות ההקשרות של PNAs ל-RNA כפול-גדילי לעומת RNA חד-גדילי.
- לבסס מתודולוגיה החלה על מבני RNA שונים.
שיטות ששימשו
- סינתזה וטיהור של אוליגומרים של PNA.
- אלקטרופורזה לניתוח אינטראקציות RNA-PNA.
- ספקטרופוטומטריה של פלואורסצנציה למדידת זיקות הקשרות.
- ספקטרופוטומטריה UV-Vis לניתוח התכה תרמית.
תוצאות עיקריות
- PNAs שונים הראו זיהוי משופר של דופלקסי RNA ספציפיים.
- PNAs שונים Q ו-L נקשרים באופן סלקטיבי ל-RNA כפול-גדילי.
- נתוני ההתכה התרמית הראו הבדלים ביציבות ההקשרות.
- מצאים כי שיירי Q מייצרים חוסר יציבות בהקשרות עקב התנגשויות סטריליות.
מסקנות
- הפרוטוקולים שהוקמו יכולים להקל על מחקר נוסף בתחום התמקדות ב-RNA.
- הבנת שינויים ב-PNA יכולה להוביל לשיפור בשיטות זיהוי RNA.
- ממצאים אלו תורמים לתחום הרחב יותר של ביולוגיה כימית של RNA.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Chemically modified peptide nucleic acids (PNAs) enable sequence-specific recognition of double-stranded RNA (dsRNA) over single-stranded RNA (ssRNA), providing a selective probe for RNA structural targets. This selectivity supports target validation in RNA chemical biology by distinguishing functional duplexes from transient ssRNA species. The method contributes to mechanistic de-risking in early discovery by confirming binding specificity before downstream investment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by confirming PNA binding to specific dsRNA sequences with C-G pairs.
- Operational Value: Uses non-denaturing PAGE and 2-aminopurine fluorescence to quantify binding affinities and selectivity.
- Predictive Value: Distinguishes dsRNA-selective binding from non-specific ssRNA interactions, reducing false positives in target identification.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative fluorescence and thermal melting data for dose-response and selectivity profiling.
- Reproducibility: Standardized gel electrophoresis and spectrophotometry enable cross-laboratory validation of PNA-RNA interactions.
- Scalability: Supports testing of multiple RNA hairpins or duplexes with single-base mutations to map binding specificity.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Validated dsRNA recognition supports progression to cellular probing of RNA structures.
- Biomarker Alignment: Selective binding to structured RNA enables detection of disease-associated RNA conformations.
- Risk Mitigation: Lack of ssRNA binding reduces off-target risk in therapeutic ligand design.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, where selective dsRNA recognition informs prioritization of RNA-targeted modalities.
- Discovery Biology: Tests target engagement by measuring PNA binding to defined dsRNA constructs versus ssRNA controls.
- Screening: Enables assay development for selectivity screening using fluorescence titration and thermal shift assays.
- Analytics: Provides quantitative outputs including binding affinity (Kd), thermal stability (Tm), and selectivity ratios.
- Translational Research: Confirms structural selectivity necessary for cellular target engagement studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating PNA modifications across diverse RNA targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking through selective dsRNA recognition over ssRNA.
- Operational Value: Standardized workflows for synthesis, purification, and biophysical characterization.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions based on binding selectivity and thermal stability profiles.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of PNA leads with demonstrated dsRNA specificity.
Implementation Considerations
- Expertise in peptide nucleic acid synthesis via Boc-chemistry solid-phase methods.
- Access to reverse-phase HPLC, MALDI-TOF, and non-denaturing PAGE systems.
- Fluorescence and UV-Vis spectrophotometry for binding and thermal analysis.
- Standardization of incubation buffers, annealing protocols, and gel staining procedures.
- Adaptation considerations for varying RNA length, structure, and modification compatibility.
