זיהוי של מוטיבים פונקציונליים והשותפים המחייבים מבוסס פפטיד

טכניקות כדי לנתח את המנגנונים בבסיס הפרשת הנף HIV-1 בexosomes מתוארות. פפטידים קצרים ספציפיים הנגזרים מהנף וtransfection החלבון נוצלו על מנת לקבוע את המבנה, תפקוד, ושותפים מחייבים של אזור שינוי ההפרשה של NEF. יש נהלים אלה רלוונטיות בכלל במחקרים מכניסטית רבים.

סרטון זה מציג קבוצה של ארבעה ניסויים המשמשים לזיהוי מוטיבים פונקציונליים של חלבון HIV אחד NPH ולפיתוח מעכבים מבוססי פפטידים. פפטידים קצרים ספציפיים שמקורם במוטיבים המצויים בחלבונים באורך מלא, שומרים על תפקודם הביולוגי ומעכבים באופן תחרותי את תפקודו של החלבון באורך מלא לזיהוי מוטיבים אפופטוטיים. ב-HIV תאי חתול מטומטמים אחד של NEF נחשפים לפפטידים של סריקת NEF ומבוצעת בדיקת אפופטוטיקה של מנהרה לזיהוי פפטידים הגורמים לאפופטוזיס.

קבוצה שנייה של פפטידים המכילה וריאציות על מוטיב הפרשת NEF. אזור שינוי ההפרשה או SMR מועבר לתאים יחד עם אובדן תפקוד NPH GFP עקב עיכוב תחרותי המסומן על ידי ירידה בהפרשת nph. GFP מוערך על ידי פלואורומטריה כדי לזהות גורמים תאיים המקיימים אינטראקציה עם אזור שינוי ההפרשה או SMR של nef.

משקעים מבוצעים באמצעות NPH מסוג פרא SMR כפיתיון. לבסוף, כדי לבדוק אם אינטראקציות אלה משפיעות על ההפרשה, נוגדנים כנגד שותפי קישור מזוהים מועברים לתאים. כדי להעריך אם הם מתנגדים להפרשת מוטיב NF, התוצאות שהתקבלו מזהות שני מוטיבים אפופטוטיים פונקציונליים ב-NEF ופפטיד מעכב הנוגד מוטיב הפרשת NEF פונקציונלי כמו גם את שותפי הקישור התאיים שלו הנדרשים להפרשה.

המטרה הכוללת של קבוצה זו של ארבעה ניסויים היא להאיץ את הזיהוי של מוטיבים פונקציונליים בחלבוני מטרה ולאחר מכן להשתמש בנתונים אלה כדי לפתח מעכבי בסיס פפטידים של מוטיבים פונקציונליים אלה. סט פרוטוקולים זה היה שימושי עבור הקבוצה שלנו בסיוע לנו לענות על שאלות מפתח הקשורות לפתוגנזה של HIV, כגון הבנת התפקיד של הפרשה מונעת neph בפתוגנזה ובפענוח המנגנונים העומדים בבסיס יכולתו של neff לתמרן את מסלול הסחר האקסו-סומלי. היום תדגים את ההליכים ד"ר מינג בו הואנג, שהוא מדריך מחקר במעבדה שלי.

התחל הליך זה עם קבוצה של פפטידים הסורקים את אזור העניין לניסוי זה. 20 פפטידים של MER עם חפיפה של 10 חומצות אמינו המשתרעות על פני כל חלבון ה-HIV NPH אחד התקבלו מתוכנית ריאגנטים לאיידס. כדי לזהות מוטיבים אפופטוטיים של NPH, בצע בדיקת אפופטוזיס באמצעות פפטידי סריקת NEF בנפרד כדלקמן, הוסף מיליליטר אחד של מדיום תרבית המכיל 10 ננוגרם למיליליטר של פפטיד לכל צלחת של 35 מילימטר של כובע מטומטם, תרביות תאים ודגירה של תרביות למשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה, בצע בדיקת טרנספראז בתיווך דאוקסי נוקלאוטיד טרנספראז בתיווך DUTP, ניק ביוטין ותיוג או בדיקת מנהרה כדי להעריך אפופטוזיס. לשם כך יש לשטוף תחילה תאים עם PBS ואז לשאוב את ה-PBS ולהוסיף 4% אלדהיד פרפורם ב-PBS לדגור למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לתקן את התאים לאחר קיבוע התאים, לשטוף אותם עם PBS ולהוסיף טריטון X 100, לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לחלחל אותם. לאחר קיבוע וחדיר של תאים, הוסף מגיב מנהרה ודגר את התאים למשך שעה ב -37 מעלות צלזיוס לאחר חדיר.

שוטפים את התאים פעמיים עם PBS. לאחר מכן קבע את אחוז התאים המוכתמים על ידי אפי פלואורסצנטי במערכת מיקרוסקופיה מבוקרת מחשב. לאחר העברת תאי jca עם NPH, פלסמיד GFP ווריאציות שונות של פפטיד SMR באמצעות ערכת ריאגנטים לאספקת חלבון מרכבה כמתואר במסמך הנלווה, קצור את המדיום כדי לקבוע את יעילות הטרנספקציה על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

צלם תמונות פלואורסצנטיות ושדות בהירים וקבע את אחוז התאים. לאחר מכן הועבר כדי להעריך את עיכוב הפרשת NPH GFP, העביר 100 מיקרוליטר של המדיום המותנה נטול התאים לבארות בודדות של צלחת מיקרוטיטר שחורה של 96 בארות. השתמש בפלואוריומטר עם אורך גל עירור 485 ננומטר ואורך גל פליטה 515 ננומטר כדי למדוד את הקרינה GFP בתווך ביחידות פלואורסצנטיות יחסיות.

לאחר השלמת הקריאה, העבר את הנתונים למחשב. הגדר את רמת הקרינה של GFP במדיום הבקרה ב-100%ואז השווה זאת לרמת הקרינה של GFP במדיום מתאים שהועברו יחד עם פפטידים שונים של SMR כדי לקבוע שינויים בהפרשת GFP NPH. הקניין הרוחני המשותף לבידוד שותפים מחייבים מוטיב הוא צעד קשה.

ודא שהחרוזים נסערים כראוי במהלך הדגירה וכי כמה שיותר נוזלים מוסרים מהחרוזים במהלך כל שלב כביסה. גדל תאי כובע מטומטמים במדיום RPMI 1640 המכיל 10% FBS ב-37 מעלות צלזיוס בתרבית רקמה T 75 תאי גלולה על ידי צנטריפוגה ב-1000 פעמים G למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. השעו מחדש את גלולת התא במיליליטר אחד של PBS והעבירו אותה לצינור מיקרו צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.

סובב ב 1000 פעמים G למשך דקה אחת. לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של ליזה נגד דגל. חוצץ על ידי פיפטינג עדין באופן דיפרנציאלי מיקרו צנטריפוגה.

המתלים ב -2000 כפול G למשך חמש דקות וב -13, 000 פעמים G למשך 10 דקות. כדי לגלול את פסולת התא וה-DNA בהתאמה, אסוף את הסופרנטנט המכונה להלן הליזאט. לאחר קביעת ריכוז החלבון, הוסף מיליגרם אחד של חלבון ליזאט ומיקרוגרם אחד של סוג הבר SMR או פפטיד מוטנטי SMR ל-20 מיקרוליטר של ג'ל אנטי-פלאג M שני זיקה.

ג'ל זיקה זה מכונה להלן השרף מביא את התערובת לנפח סופי של מיליליטר אחד במאגר IP משותף. הכינו גם בקרה שלילית בה הליזאט משולב עם שרף בהיעדר פפטיד כלשהו. דוגרים על התערובות בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה עם סיבוב מקצה לקצה.

למחרת גלולה את השרף על ידי מיקרו צנטריפוגה ב-5,000 עד 8,000 פעמים G למשך 30 שניות. לאחר הסיבוב, המתן דקה עד שתיים לפני הטיפול בדגימות כדי לאפשר לשרף להתיישב בצינור. הסר את הסופרנטנט בעזרת קצה פיפטה צר או מזרק המילטון, הקפד לא להעביר שרף כלשהו.

שטפו את השרף ארבע פעמים על ידי החייאה, השעו אותו ב-500 מיקרוליטר של מאגר כביסה, ואחריו מיקרו צנטריפוגה. כדי לנטרל את החלבונים התאיים הקשורים. הוסף 15 מיקרוגרם של עודף שלושה x דגל פפטיד לצינור ב-50 מיקרוליטר של מאגר כביסה ודגירה על שייקר נדנדה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר לאחר צנטריפוגת הדגירה ב-5,000 עד 8,000 פעמים G למשך 30 שניות.

לאחר שאפשרו לצינורות לשקוע במשך שתי דקות, אספו ושמרו את הסופרנטנט המכיל את החלבונים החמקמקים. לאחר ריכוז ה-EITs על ידי משקעי אצטון, הרתיחו את הדגימות במאגר דגימת לאלי. לאחר מכן הפרד את החלבונים על ידי דף SDS על 40 עד 20% triss, קריטריון HCL ג'ל טרומי מכתים את הג'ל עם kumasi brilliant blue R two 50.

כדי להעריך את עיכוב הנוגדנים בתאי JCA עם NGFP ונוגדנים אנטיפה טובולין או נוגדן נגד תמותה באמצעות ערכת ריאגנטים לאספקת חלבון מרכבה כמתואר במסמך הנלווה, אסוף את המדיום המותנה נטול התאים מהתאים שנקטפו. העבירו 100 מיקרוליטר לבארות בודדות של צלחת מיקרוטיטר שחורה של 96 בארות. לאחר מכן מדוד את הקרינה של GFP במדיום באמצעות פלואורמטר עם אורך גל עירור 485 ננומטר ואורך גל פליטה 515 ננומטר ביחידות פלואורסצנטיות יחסיות.

לאחר קריאת הצלחת, העבירו את הנתונים למחשב והגדירו את רמת הקרינה של GFP בבקרת טובולין נגד שומן ב-100%השווה זאת לרמת הקרינה של GFP במדיום ממיטת תאים שהועברה עם נוגדן נגד תמותה כדי לקבוע שינויים בהפרשת NEF GFP למיפוי מוטיבים אפופטוטיים של HIV ניתוח סריקת פפטידים של חלבוני NPH אחד בוצע כמתואר בסרטון זה. ציר ה-Y מראה את אחוז התאים המסומנים במנהרה וציר ה-x מציין את מצב הטיפול כפי שמוצג כאן, זוהו שני אזורים נפרדים של HIV אחד NEF הגורמים לאפופטוזיס. אלה מסומנים על ידי תיוג מנהרה מוגבר של תאים שנחשפו לפפטידים של נף.

שיאי האפופטוזיס מסומנים על ידי מוטיב 1 ומוטיב 2 כדי להעריך עיכוב תחרותי של הפרשת ה-neph על ידי מדיום תרבית פפטידים מסוג פרא SMR מתאי CAT T מטומטמים cot שעברו טרנסקטציה עם שיבוט NPH GFP ופפטידים שונים של SMR נבדקו להפרשת NPH אקסו-אומלי כפי שמוצג על ידי פלואורסצנטי GFP במדיום פפטידים המכילים מוטיבים אחד או יותר של רצף NPH SMR מסוג פרא אחד או יותר עיכבו את הפרשת NEF אקסו-אומלי בעוד שהחלפת אלנין של כל חומצת אמינו באזור זה הפחיתה מאוד את יעילות הפפטידים. זה מצביע על כך שפפטיד מסוג פרא SM R מעכב exo omal nph, גרסה מקושקשת של 11 חומצות אמינו של מוטיב האפופטוטי של neff. SM אחד, שתואר קודם לכן והושג מסיגמא ג'נסיס, שימש כבקרה שלילית ולא הייתה לו השפעה על הפרשת NEP אקסו-אומלית.

תמונה זו של ג'ל העמוד SDS המוכתם בקומאסי מציגה את המשקעים החיסוניים של ארבעה חלבונים על ידי פפטיד מסוג פרא SMR בגדלים של 60, 65, 75 ו-250 קילודלטון. הפפטיד המוטנטי SMR הבקרה השלילי לא לכד את החלבונים הללו, וחלבונים אלה לא קיימו אינטראקציה לא ספציפית עם שרף הזיקה. בהיעדר פפטיד מסוג פרא SMR, תוצאות אלה מצביעות על כך שהחלבונים המשקעים של קון היו באינטראקציה ספציפית עם מוטיבים SMR של פפטיד מסוג SMR פראי.

בדיקת קורא הצלחות מראה כי העברת עריסה של הנוגדן האנטי תמותה עם פלסמיד ביטוי ה-neph ביטלה לחלוטין את הפרשת ה-NPH האקסו-אומלית. לנוגדנים הלא קשורים לא הייתה השפעה על הפרשת אקסו אומל. תוצאות אלו מצביעות על כך שנדרשת אינטראקציה שלמה של כישרון NM להפרשת כליות אקסו-אומליות.

לסיכום, לאחר צפייה בסרטון זה, הייתם צריכים לפתח הבנה טובה כיצד להשתמש בטכניקות המתוארות כדי לזהות מוטיבים פונקציונליים בחלבוני מטרה ולהשתמש בנתונים אלה כדי לפתח מעכבי בסיס פפטידים של מוטיבים פונקציונליים אלה. בעת ניסיון הליך ה-IP המשותף, יהיה זה קריטי לזכור להקדיש תשומת לב קפדנית בביצוע שטיפות הדגירה, לוודא שהחרוזים נסערים כראוי במהלך הדגירה וכי כמה שיותר נוזלים מוסרים מהחרוזים במהלך כל שלב כביסה. כמו כן, במהלך שטיפות שרף התא והליזאט תמיד מאפשרות לשרף להתיישב בעקבות הצנטריפוגה.

השתמש בקצות הפיפטה הצרות ובצע ארבע כביסות כדי להפחית את הרקע כראוי לרמות מקובלות.