זיהוי של מוטיבים פונקציונליים והשותפים המחייבים מבוסס פפטיד

סרטון זה מציג מערכת של ארבעה ניסויים המשמשים לזיהוי מוטיבים תפקודיים בחלבון NPH של HIV-1 ולפיתוח מעכבים מבוססי פפטידים. פפטידים קצרים ספציפיים שנגזרו ממוטיבים שנמצאו בחלבונים באורכם המלא, שומרים הן על תפקודם הביולוגי והן מעכבים באופן תחרותי את התפקוד של החלבון באורכו המלא כדי לזהות מוטיבים אפופטוטיים. ב-HIV-1 NEF, תאי Jurkat נחשפים לפפטידי סריקה של NEF, ומבוצע מבחן אפופטוזיס של TUNEL כדי לזהות פפטידים המעוררים אפופטוזיס.

סט שני של פפטידים המכילים וריאציות של מוטיב הפרשה של NEF. אזור שינוי ההפרשה או ה-SMR מוחדרים לתאים יחד עם NPH GFP; אובדן תפקוד עקב עיכוב תחרותי מעיד על כך באמצעות ירידה בהפרשת nph. GFP נמדד באמצעות פלואורומטריה כדי לזהות גורמים תאיים המקיימים אינטראקציה עם אזור שינוי ההפרשה או ה-SMR של nef.

משקעים של Co-IP מבוצעים תוך שימוש ב-NPH מסוג wild type של SMR כפיתיון. לבסוף, כדי לבחון האם אינטראקציות אלו משפיעות על ההפרשה, נוגדנים נגד השותפים לקשירה שזוהו מוחדרים לתאים (transfected). כדי להעריך האם הם מעכבים הפרשה של מוטיב NF, התוצאות שהתקבלו מזהות שני מוטיבים אפופטוטיים פונקציונליים ב-NEF ופפטיד מעכב המעכב מוטיב הפרשה פונקציונלי של NEF וכן את השותפים לקשירה התאיים שלו הדרושים להפרשה.

המטרה הכוללת של סדרת ארבעת הניסויים היא להאיץ את הזיהוי של מוטיבים תפקודיים בחלבוני מטרה, ולאחר מכן להשתמש בנתונים אלו לפיתוח מעכבים מבוססי פפטידים של מוטיבים תפקודיים אלו. סדרת פרוטוקולים זו הייתה שימושית עבור הקבוצה שלנו בסיוע במתן מענה לשאלות מפתח הקשורות לפתוגנזה של HIV, כגון הבנת התפקיד של הפרשה המונעת על ידי neff בפתוגנזה ופענוח המנגנונים העומדים בבסיס יכולתו של neff להניפולציה של נתיב התעתוק האקסוזומלי. היום ידגים את ההליכים ד"ר Ming Bo Huang, מרצה למחקר במעבדה שלי.

התחילו הליך זה עם סט של פפטידים הסורקים את האזור הרלוונטי לניסוי זה. פפטידים של 20 מר (mer) עם חפיפה של 10 חומצות אמינו המכסים את כל חלבון ה-NPH של HIV-1 התקבלו מתוכנית הריאגנטים של ה-AIDS. כדי לזהות מוטיבים אפופטוטיים של NPH, בצעו בדיקת אפופטוזיס באמצעות פפטידי הסריקה של NEF באופן אינדיבידואלי באופן הבא: הוסיפו מיליליטר אחד של מצע תרבית המכיל 10 nanograms per milliliter של פפטיד לכל צלחת של 35 millimeter של תרביות תאי jerk hat, והדגירו את התרביות למשך 24 שעות ב-37 °C.

לאחר הדגירה, בצעו תג an assay של TUNEL או סימון dUTP, biotin nick באמצעות deoxy nucleotide transferase לצורך הערכת אפופטוזיס. כדי לעשות זאת, שטפו תחילה את התאים ב-PBS, לאחר מכן שאבו את ה-PBS והוסיפו 4% Paraform aldehyde ב-PBS; דגרו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לקבע את התאים. לאחר קיבוע התאים, שטפו אותם ב-PBS והוסיפו Triton X 100, ודגרו למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי להחדיר את החומרים לתאים (permeabilization). לאחר קיבוע וחדירה של התאים, הוסיפו את ריאגנט ה-TUNEL ודגרו את התאים למשך שעה אחת ב-37 degrees Celsius לאחר תהליך החדירה.

שטוף את התאים פעמיים ב-PBS. לאחר מכן, קבע את אחוז התאים הצבועים באמצעות פלואורסצנציית epi במערכת מיקרוסקופיה מנוהלת במחשב. לאחר טרנספקציית תאי jca עם NPH, פלסמיד GFP ווריאציות שונות של פפטיד SMR תוך שימוש בערכה למסירת חלבונים chariot כפי שמתואר במסמך המצורף, אסוף את המדיום כדי לקבוע את יעילות הטרנספקציה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

דגמו תמונות פלואורסצנטיות ותמונות בשדה בהיר (brightfield) וקבעו את אחוז התאים. לאחר מכן, כדי להעריך את עיכוב הפרשת ה-GFP של NPH בתאים שעברו טרנספקציה, העבירו 100 µL מהמדיום המותנה נטול התאים לבארות בודדות בלוח מיקרוטיטר שחור בעל 96 בארות. השתמשו בפלואורימטר עם אורך גל עירור של 485 nm ואורך גל פליטה של 515 nm למדידת פלואורסצנציית ה-GFP במדיום ביחידות פלואורסצנציה יחסיות.

לאחר סיום הקריאה, העבירו את הנתונים למחשב. הגדירו את רמת פלואורסצנציית ה-GFP במצע הביקורת כ-100%. לאחר מכן, השוו זאת לרמת פלואורסצנציית ה-GFP במצע מתאים לתאים שעברו טרנספקציה משותפת עם פפטידי SMR שונים, כדי לקבוע שינויים בהפרשת NPH GFP. שלב ה-co IP לבידוד שותפים לקשירת מוטיבים הוא שלב מאתגר.

יש לוודא שהחרוזים מעורבלים כראוי במהלך הדגראציות וכי כמות הנוזל המרבית מוסרת מהחרוזים בכל שלב שטיפה. גדלו תאי Jurkat במצע RPMI 1640 המכיל 10% FBS בטמפרטורה של 37 °C בבקבוק תרבית רקמה T 75. השקיעו את התאים על ידי סבב צנטריפוגה ב-1000 ×g למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 °C. השביו את משקע התאים ב-1 mL של PBS והעבירו אותו למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 mL.

סובב במהירות של 1000 ×g למשך דקה אחת. לאחר מכן, השהה מחדש את המשקע ב-1 ml של בופר לליזה Anti-Flag באמצעות פיפוט עדין במיקרו-צנטריפוגה דיפרנציאלית.

סבב את התרחיפים ב-2000 ×g למשך חמש דקות וב-13,000 ×g למשך 10 דקות. כדי לשקיע את פסולת התאים ואת ה-DNA בהתאמה, אסוף את הנוזל העליון שייקרא להלן הליזאט. לאחר קביעת ריכוז החלבון, הוסף מיליגרם אחד של חלבון מהליזאט ומיקרוגרם אחד של פפטיד SMR מסוג בר (wild type) או פפטיד SMR מוטנטי ל-20 µL של ג'ל זיקה Anti-Flag M2.

ג'ל זיקה זה יכונה להלן השרף; הגבירו את נפח התערובת לנפח סופי של 1 mL בבופר co IP. כמו כן, הכינו ביקורת שלילית שבה הליזט משולב עם השרף ללא אף אחד מהפפטידים. דגרו את התערובות בטמפרטורה של 4 °C למשך לילה עם סיבוב end over end.

ביום למחרת, שקיעו את שרף הבידוד באמצעות מיקרו-צנטריפוגה במהירות של 5,000 עד 8,000 ×g למשך 30 שניות. לאחר הסבב, המתינו דקה עד שתיים לפני טיפול בדגימות כדי לאפשר לשרף להשקיע במבחנה. הסירו את הנוזל העליון באמצעות טיפ פיפטה בעל קצה צר או מזרקת Hamilton, תוך הקפדה שלא להעביר חלקים מהשרף.

שטפו את השרף ארבע פעמים על ידי השהיה (resus), תליתו ב-500 µL של בופר שטיפה, ולאחר מכן ביצוע מיקרו-צנטריפוגציה. כדי לאלוט את החלבונים התאיים הקשורים, הוסיפו למבחנה 15 µg של עודף פפטיד 3x flag ב-50 µL של בופר שטיפה והדגירו על שייקר נדנדה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר ההדגרה, צנטריפוגו במהירות של 5,000 עד 8,000 ×g למשך 30 שניות.

לאחר המתנה של שתי דקות להתייצבות המבחנות, אספו ושמרו את העלייה (supernatant) המכילה את החלבונים ששוללפו (eluded proteins). לאחר ריכוז ה-EITs באמצעות שקיעה באצטון, הרתיחו את הדגימות בבuffer לדגימה של Laemmli. לאחר מכן, הפרדו את החלבונים באמצעות SDS-PAGE על ג'ל precast criterion של Tris-HCl בריכוז של 40% עד 20%. צבעו את הג'ל ב-Coomassie Brilliant Blue R-250.

כדי להעריך עיכוב של נוגדנים, בצע טרנספקציה משולבת לתאי JCA עם NGFP ועם Antifa tubulin או נוגדן anti mortality, תוך שימוש בערכת רכיבי משלוח חלבונים chariot כמתואר במסמך הנלווה, ואסוף את המצע המותנה נטול התאים מהתאים שנאספו. העבר 100 µL לבארים בודדות של תבנית מיקרוטיטר שחורה בעלת 96 בארות. לאחר מכן, מדוד את פלואורסצנציית ה-GFP במצע באמצעות פלואורימטר באורך גל עירור של 485 nm ואורך גל פליטה של 515 nm ביחידות פלואורסצנציה יחסיות.

לאחר קריאת הפלטה, העבירו את הנתונים למחשב וקבעו את רמת פלואורסצנציית ה-GFP בבקרת ה-anti-fat tubulin ל-100%. השוו זאת לרמת פלואורסצנציית ה-GFP במדיום מתאים לתאים שאינם טרנספקטים עם נוגדן anti-mortality כדי לקבוע שינויים בהפרשת NEF GFP. כדי למפות מוטיבים אפופטוטיים של חלבוני HIV 1 NPH, בוצע ניתוח סריקת פפטידים כפי שמתואר בסרטון זה. ציר ה-Y מראה את אחוז התאים המסומנים ב-TUNEL וציר ה-x מציין את תנאי הטיפול. כפי שמוצג כאן, זוהו שני אזורים נפרדים של HIV 1 NEF המשרים אפופטוזה. אלו מסומנים על ידי עלייה בסימון TUNEL של תאים שנחשפו לפפטידי neph.

שיאי האפופטוזיס מסומנים על ידי מוטיב אחד ומוטיב שני כדי להעריך עיכוב תחרותי של הפרשת NPH על ידי פפטידים מסוג wild type של SMR. מצע תרבית של תאי Jurkat T שעברו טרנספקציה עם שיבוט של NPH GFP ופפטידי SMR שונים נבדקו להפרשת NPH אקסו-סומטית, כפי שניתן לראות על ידי פלואורסצנציית GFP במצע. פפטידים המכילים מוטיב אחד או יותר של רצף NPH SMR מסוג wild type עיכבו את ההפרשה האקסו-סומטית של NEF, בעוד שהחלפת כל חומצת אמינו באזור זה באלנין הפחיתה מאוד את יעילות הפפטידים. הדבר מרמז כי פפטיד SMR מסוג wild type מעכב את NPH האקסו-סומטי, גרסה מבולגנת של 11 חומצות אמינו של המוטיב האפופטוטי של neff. SM1, שתואר בעבר והושג מ-Sigma Genesis, שימש כביקורת שלילית ולא השפיע על הפרשת NEP אקסו-סומטית.

תמונה זו של ג'ל SDS-PAGE שנצבע ב-Coomassie מראה קו-אימונופרסיפיטציה (co immunoprecipitation) של ארבעה חלבונים על ידי הפפטיד SMR מסוג הבר (wild-type) בגדלים של 60, 65, 75 ו-250 kilodalton. הפפטיד SMR המוטנטי, ששימש כביקורת שלילית, לא לכד חלבונים אלו, וחלבונים אלו לא תגובו באופן לא ספציפי עם שרף האפיניות (affinity resin). בהיעדר הפפטיד SMR מסוג הבר, תוצאות אלו מרמזות כי החלבונים שעברו קו-פרסיפיטציה תגובו באופן ספציפי עם מוטיב ה-SMR של הפפטיד SMR מסוג הבר.

בדיקת קורא הלוחיות מראה כי טרנספקציה משותפת של הנוגדן נגד mortal עם הפלסמיד לביטוי neph ביטלה לחלוטין את הפרשת ה-NPH החוץ-תאית. לנוגדן לא קשור לא הייתה השפעה על הפרשת ne החוץ-תאית. תוצאות אלו מרמזות כי אינטראקציה תקינה בין NM ל-talent נדרשת להפרשה חוץ-תאית של neph.

לסיכום, לאחר צפייה בסרטון זה, פיתחתם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להשתמש בטכניקות המתוארות כדי לזהות מוטיבים פונקציונליים בחלבוני מטרה, וכיצד להשתמש בנתונים אלו כדי לפתח מעכבים מבוססי פפטידים עבור מוטיבים פונקציונליים אלו. בעת ביצוע הליך ה-co IP, יהיה זה קריטי לזכור להקדיש תשומת לב קפדנית לביצוע שטיפות האינקובציה, תוך הבטחה שהחרוזיים מעורבבים כראוי במהלך האינקובציות ושכמות הנוזל המקסימלית האפשרית מוסרת מהחרוזיים בכל שלב שטיפה. כמו כן, במהלך שטיפות השרף של התאים והליזאט, יש תמיד לאפשר לשרף לשקוע לאחר הצנטריפוגציה.

השתמשו בטיפי פפיטה בעלי קצה צר ובצעו ארבעה שטיפות כדי להפחית את הרקע לרמות מקובלות.