Name: הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: למדו לזהות חלבונים מקשרי RNA ולמפות אזורי הקשירה שלהם בתאים חיים באמצעות צילום UV וספקטרומטריית מסה. שיטה זו מאפשרת חקר אינטראקציות RNA-חלבון באפיגנטיקה ללא צורך בניקוי מורכב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

R.B. נתמכה על ידי התוכנית מלומדים סירל קרן סמית וו (C1404), הצעדה של מטבעות קרן (1-שנות כספים-15-344). שקית מאשר תמיכה של NIH מעניקה R01GM110174 ו- NIH R01AI118891, כמו גם משרד ההגנה הענק BC123187P1. סיפורם-טי נתמך על ידי מענק הכשרה-NIH T32GM008216.

1. תרבות והרחבה של mESCs הערה: תאי גזע עובריים בעכבר הם קלים לתרבות, ניתן להרחיב במהירות למספרים גדולים הנדרשים על ידי ניסויים הביוכימי בזכות שלהם פעם אופניים מהירה. MESCs בריא להכפיל את כל ה 12
<ol><li>MESCs הרחב למספר הרצוי על הצלחות gelatinized mESC בינוני (ראו להלן) חממה תרביות רקמה שמרו ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, ו- &#62; 95% לחות. 
	הערה: מספיק צלחות צריכים להיות מוכנים משכפל ביולוגית 3-5, עבור + 4SU מדגם ושליטה -4SU. לוח 10-ס מ אחד (דהיינו 5-10 מיליון תאים) הוא יותר ממספקת. עבור כל שכפול ביולוגי.</li>
	<li>האמצעי mESCs מורכב Dulbecco &#39; s ששינה הנשר &#39; s בינוני (DMEM) בתוספת 15% עוברית שור סרום (FBS), 2 מ מגלוטמין, 0.5 x פניצילין/סטרפטומיצין, חומצות אמינו שאינן הכרחיות x 1, 100 מיקרומטר בטא-mercaptoethanol, 1,000 U /mL לוקמיה מעכבות פקטור (LIF), מיקרומטר 3 CHIR99021, 1 מיקרומטר PD0325901.</li>
	<li>לפני passaging mESCs, להכין את המספר הרצוי של צלחות 10 ס מ.
	<ol><li>להוסיף 4 מ"ל של 0.1% ג'לטין במים מוודא כי השטח כולו של הצלחת מכוסה; תקופת דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT); הסרת פתרון ג'לטין.</li>
	</ol></li> <li>מעבר תאים כאשר הם מגיעים ~ 10 מיליון תאים לכל צלחת, בדרך כלל בעקבות חיסון h ~ 48- 
	הערה: ככל mESCs גדלות במושבות צפופות, צלחות אסור להיות להגיע confluency 100% כפי שנצפו שורות תאים הגדלים בתוך monolayers (למשל HEK293 או 3T3 תאים). צריך להיות passaged צלחת mESC כאשר ~ 50% confluent ו בהחלט לפני המדיום לצהוב.
	<ol><li>להתנתק תאים, לשטוף צלחות עם תרבויות mESC צפופה פעם בתוך 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) בתוספת 2 מ מ EDTA, ולאחר מכן להוסיף טריפסין 0.05% מומס DMEM ולהחזיר את לוחית חממה במשך 5 דקות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, ו- &#62; 95% לחות).</li>
		<li>הסר לוחית של החממה, resuspend תאים בעלי נפח שווה של DMEM על ידי pipetting למעלה ולמטה נמרצות מספר פעמים.</li>
		<li>לספור תאים באמצעות hemocytometer ולהבטיח כי תאים טופס השעיה תא בודד (כלומר אין אשכולות), ואז צנטריפוגה תא תערובת 500 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. להסיר את תגובת שיקוע, resuspend תא גלולה ב 1-2 מ ל DMEM.</li>
		<li>לחסן תאים על צפיפות של תאים/ס מ 10,000 2 mESC בינוני (קרי 800,000 תאים לכל צלחת ס מ-10) באמצעות הלוחות מצופים ג'לטין מוכן בשלב 1.3.1.</li>
	</ol></li></ol> 2. Crosslink של חלבון &#8211; RNA אינטראקציות בתאים חיים הערה: RNA-חלבון crosslinking מתווך על ידי ribonucleoside activatable-צילום אנלוגי 4-thiouridine (4SU). 4SU יש מקסימום ספיגת יותר מאשר אנדוגני נוקלאוטידים בלבד וניתן לשלב לתוך RNA; לכן UVB בינוני באורך הגל יכול לשמש באופן סלקטיבי crosslink RNA לחלבונים 25 , 26. טיפול UVB של תאים שטופלו 4SU מוביל אל crosslinks קוולנטיות בין המכילות 4SU RNA, חומצות אמינו, עם העדפה Tyr, שדווחה Trp, Met, Lys ואת Cys 27.
<ol><li>MESCs הרחב למספר הנדרש של ס מ-10 צלחות כפי שמתואר שלב 1- 
	הערה: מספיק צלחות צריכים להיות מוכנים משכפל ביולוגית 3-5, עבור + 4SU מדגם ושליטה -4SU. לוח 10-ס מ אחד (דהיינו 5-10 מיליון תאים) מספיקה עבור כל שכפול ביולוגי.</li>
	<li>לפני הלוחות מגיעים confluency, להוסיף 4SU ישירות לתוך בינוני כדי ריכוז סופי של 500 מיקרומטר. תשאירי - 4SU שליטה הכלים לא מטופל.</li>
	<li>לוחות לנער בעדינות כדי להפיץ את 4SU homogeneously ברחבי המדיום. בתכב החממה תרביות רקמה זהה עבור 2 h (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, ו- &#62; 95% לחות).</li>
	<li>להעביר צלחות דלי קרח ולמחוק בינונית.</li>
	<li>לשטוף את הצלחת בעדינות עם 5 מ של PBS קר כקרח. 
	הערה: לשטוף בעדינות או תאים עלול לנתק.</li>
	<li>להוסיף 2 מ"ל של צלחות PBS ומקום כקרח ללא המכסים crosslinker מצויד עם נורות פולט-UVB (312 ננומטר). להאיר צלחות-הגדרה של אנרגיה של J/cm 1 2- 
	הערה: זה קריטי כי מכסי פלסטיק יוסרו או שהם אולי מגן תאים מן אור UV ולמנוע crosslinking.</li>
	<li>לאסוף תאים באמצעות תא lifters ולהעביר ל- PBS קר כקרח צינורות חרוט. צנטריפוגה ב 2,000 x g למשך 5 דקות, 4 ° C.</li>
	<li>להסיר את תגובת שיקוע, resuspend תא גלולה ב- PBS קר כקרח מ עם 2 מ מ EDTA ו- 0.2 מ מ phenylmethylsulfonyl פלואוריד (PMSF).</li>
	ספירת תאים באמצעות hemocytometer של <li>. מצפה 5-10, 10-20 מיליון תאים צלחות ס מ-10, 15 ס מ בהתאמה.</li>
	צנטריפוגה <li>ב 2,000 x g למשך 5 דקות, 4 ° C. 
	הערה: תאים מגורען יכול מיד לשמש שלב 3 או הם להיות קפוא בחנקן נוזלי, המאוחסנים ב- 80 ° C ללא הגבלת זמן. זהו פוטנציאל נקודת עצירה.</li>
</ol> 3. בידוד של גרעינים הערה: גרעינים מבודדים כדי להסיר חלבונים cytoplasmic להגביר את הסיקור של חלבונים גרעיניים. שלב זה יכול להיות מוחלף עם צורות אחרות של fractionation הסלולר ללמוד RBPs בתאים הסלולר שונה.
<ol><li>הכן קר כקרח מאגר (10 מ מ טריס-HCl pH 7.9, 4 ° C, 1.5 mM MgCl 2, 10 מ מ אשלגן כלורי). להשתמש לפחות 2.5 מ לכל 10 מיליון תאים (לפי ספירת בשלב 2.9) לחילוץ. 
	הערה: מניות המאגר A (לדוגמא בקבוק 500 מ"ל) יכול להיות שהוכנה מראש ומאוחסנים ב 4 מעלות צלזיוס למשך 6 חודשים.
	<ol><li>לפני השימוש, להוסיף dithiothreitol 0.5 מ מ (DTT) ו- 0.2 מ מ PMSF ל הכמות הרצויה (2.5 מ לכל 10 מיליון תאים) המאגר הקר א</li>
	</ol></li> <li>לרחוץ תאים באמצעות 2 מ"ל מאגר A לכל 10 מיליון תאים. ספין-2,500 g x עבור 5 דקות ב 4 º C</li>
	<li>להשליך תגובת שיקוע, להוסיף מאגר A בתוספת 0.2% של חומר ניקוי nonionic, הלא denaturing, כגון תמצית-phenoxy-polyethoxy-אתנול (ראה הטבלה של חומרים), µL 500 לכל 10 מיליון תאים. סיבוב במשך 5 דקות ב 4 º C</li>
	<li>צנטריפוגה-2,500 g x עבור 5 דק.</li>
	<li>להסיר את תגובת שיקוע; בגדר כוללת גרעינים שלמים ללא ציטופלזמה. 
	הערה: גרעינים שניתן להשתמש באופן מיידי עבור שלב 4 או קפואה של חנקן נוזלי ו המאוחסן ב- 80 ° C ללא הגבלת זמן. זהו פוטנציאל נקודת עצירה.</li>
</ol> 4. פירוק של גרעינים הערה: lysed הם גרעינים תפור במאגר מסה ספקטרומטר תואמי לשחרר חלבונים, חלבונים-RNA מתחמי.
<ol><li>מאגר פירוק הוספה (אוריאה 9 מטר, 100 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 24 ° C), µL 200 לכל 10 מיליון תאים. Sonicate להטיית כרומטין באמצעות 1/8 &#34; בדיקה ב- 50% משרעת הגדרה עבור s 5-10</li>
	<li>ספין-12,000 x g עבור 5 דקות של 175 לאסוף µL של תגובת שיקוע להימנע בגדר. 
	הערה: 100 µL ישמש עבור השלבים הבאים RBR-ID, ניתן לאחסן את µL 75 הנותרים של lysate ב-80 מעלות צלזיוס לשימוש ו/או ניתוח תספיג.</li>
	<li>למדוד ריכוז חלבון באמצעות שיטת ברדפורד או טכניקה דומה 28. לדלל את ריכוז חלבון בדגימות שונות כדי 1 מ"ג/מ"ל או הריכוז הנמוך ביותר מדגם באמצעות כמויות מתאימות של פירוק מאגר. 
	הערה: מן הגרעינים של 10 מיליון mESCs מצפה µg 100-200 של חלבון.</li>
</ol> 5. עיכול טריפסין הערה: חלבונים מתעכלים ליצירת פפטידים suitable לניתוח ספקטרומטר מסה מלמטה למעלה (MS).
<ol><li>פתרון DTT להוסיף גרעיני lysate (5 מ מ הסופי); תקופת דגירה של h 1-RT.</li>
	<li>להוסיף iodoacetamide במלאי טריים (14 מ מ הסופי); תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT בחושך.</li>
	<li>Dilute lysate עם 5 פעמים נפח של 50 מ מ NH 4 HCO 3</li>
	<li>להוסיף טריפסין (חלבון µg: µg טריפסין = 200:1); דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
</ol> 6. Desalting של פפטידים <ol><li>להכין עצה אחת הבמה בהזמנה אישית עבור דגימה.
	<ol><li>6.1.1. מקום בדיסק של מעבדתי החילוץ סי18 חומר לתוך החלק התחתון של טיפ פיפטה 200 µL.</li>
		<li>µL להוסיף 50 של oligo R3 להפוך פאזה שרף על גבי הדיסק סי18. קצה הבמה בתוך צנטריפוגה מתאם ואת הקצה מקום עם מתאם בתוך צינור microfuge 1.5 mL-</li>
		<li>להוסיף 100 µL 100% acetonitrile טיפים כדי לשטוף. צנטריפוגה-1000 g x עבור 1 דקות להסיר הממס.</li>
		<li>Equilibrate עם 50 µL 0.1% trifluoroacetic חומצה (TFA). צנטריפוגה ב 1000 x g עבור מינימלית 1</li>
	</ol></li> <li>להוסיף חומצה פורמית 100% חלבון מתעכל הדגימה כדי להקטין את רמת ה-pH ל 2-3- 
	הערה: זה צריך לדרוש ~ 5 µL לכל 1 מ של דגימה פפטיד מדולל, אך pH צריך להיות וחומצה נמדד יותר formic, הוסיף במידת הצורך.</li>
	<li>מדגם עומס על גבי הבמה מחוייט עצה, צנטריפוגה ב g 1000 x עבור 1 דקות עד שכל מדגם עובר את הטיפ.</li>
	<li>שטיפת מאוגד פפטידים עם 50 µL 0.1% TFA. צנטריפוגה ב 1000 x g עבור מינימלית 1</li>
	<li>Elute פפטידים על-ידי הוספת 50 µL • תנאי מאגר (75% acetonitrile, 0.025% TFA) ועד קצה הבמה צנטריפוגה-1000 g x עבור 1 דקות לאלץ את המאגר • תנאי הטיפ.</li>
	<li>יבש המדגם באמצעות צנטריפוגה ואקום שוכן בגובה 150 x g ו- 1-3 kPa עבור ה 1 
	הערה: פפטידים יבשים ניתן לאחסן ב- 80 ° C ללא הגבלת זמן. זהו פוטנציאל נקודת עצירה.</li>
</ol> 7. הסרה של RNA תפור הערה: מתייחסים פפטידים עם נוקלאז להסיר את ה-RNA תפור.
<ol><li>Resuspend בגדר ב- 50 µL 2 x מאגר נוקלאז (100 מ מ NH 4 HCO 3, 4 מ מ MgCl 2).</li>
	ריכוז <li>מידה פפטיד באמצעות ספיגת ב 280 ננומטר בהנחה 1 מ"ג/מ"ל של פפטידים עבור A 280 1. 
	הערה: ריכוז הצפוי הוא 1 מ"ג/מ"ל.</li>
	<li>להתאים את כל הדגימות 1 מ"ג/מ"ל או הריכוז הנמוך ביותר באמצעות 2 x נוקלאז מאגר.</li>
	<li>להכין תערובת הבסיס של 50 µL H 2 O + 1 µL טוהר גבוהה נוקלאז (&#8805; 250 U) (עיין טבלה של חומרים) עבור דגימה.</li>
	<li>לקחת את µL 50 פפטיד מדגם ולהוסיף 50 µL של H 2 O + נוקלאז מאסטר מיקס.</li>
	<li>Incubate ב 37 ° C עבור ה 1 להמשיך לבצע ספקטרומטר מסה. 
	הערה: פפטידים מוכנים עכשיו ספקטרומטר מסה. ניתן לנתח מיד או המאוחסנים ב- 80 ° C ללא הגבלת זמן. זהו פוטנציאל נקודת עצירה.</li>
</ol> 8. כרומטוגרפיה נוזלית ננו, ספקטרומטריית ולאחר עיבוד הנתונים הגולמיים הערה: מכיוון 4SU-crosslinking משנה את המסה של פפטיד, יונים שלהם לא נמנית האינטנסיביות של פפטיד שאינו תפור במהלך LC-MS/MS, אשר לכן נראה להיות הופחתו crosslinking. התואר והעקביות של ירידה זו משקפת את מידת crosslinking RNA חלבון עבור כל פפטיד 24.
<ol><li>HPLC להכין אנשים רגילים כדלקמן: 0.1% חומצה פורמית במים HPLC-כיתה (מאגר A); 0.1% חומצה פורמית ב- HPLC-כיתה acetonitrile (מאגר ב).</li>
	<li>אם ננו-HPLC זמין, להתחבר ננו-עמודה עם המפרט הבא: קוטר 75 מיקרומטר; ארוז עם חלקיקים סי18-AQ; אורך 20-25 ס מ. 
	הערה: אם HPLC זמין פועל בקצב זרימה גבוהה יותר להשתמש בגודל המתאים בעמודה עבור קצב הזרימה המצוין. כרומטוגרפיה זרימה גבוהה יותר מקטינה רגישות.</li>
	<li>לתכנת את שיטת HPLC כדלקמן: nL תזרים קצב 250-300/min; צבע 2 למאגר 28% B ב- 120 דקות, מ- 28% 80 B עבור הבא 5 דקות, איזוקראטית 80% B עבור 10 דקות 
	הערה: אם HPLC אין טעינה מוקדמת מדגם equilibration של העמודה אוטומטית, הפעלת התוכנית עם 10 דקות ב- 0% B לפני שיטען הדוגמה.</li>
	<li>תוכנית בשיטת הרכישה MS כדי לבצע רכישה תלויי-נתונים (DDA) כמו רובה רגיל פרוטאומיקס ניסויים. מחזור חיים מכשיר צריך לסירוגין סריקות מלא MS עם טנדם MS סריקות (או MS/MS) של האותות האינטנסיבי ביותר. השתמש את ההגדרות האופטימליות עבור רץ פרוטאומיקס MS- 
	הערה: לקבלת תוצאות בטוח, שימוש מכשירים המסוגלים לבצע לפחות MS מלא לסרוק במצב ברזולוציה גבוהה (למשל orbitrap, זמן-של-טיסה). על כימות מדויק, ודא כי המרווחים בין סריקות MS מלא אינם עוד יותר 3 ס' יותר מחזורי עשוי למנוע הגדרה מדויקת של יון שחולצו chromatograms.</li>
	<li>עומס 1-2 µg מדגם אל העמודה HPLC ולהפעיל את שיטת HPLC-MS/MS כפי מתוכנת. עבור כל שכפול ביולוגי לבצע לפחות שתי ריצות עצמאית ולא להתייחס אליהם כמו טכני משכפל.</li>
	<li>לאחר MS, לייבא את קבצי raw חבילת תוכנה פרוטאומיקס עבור MS/MS ספקטרה וכימות פפטיד באמצעות כרומטוגרפיה שחולצו. אנו ממליצים על חבילות תוכנה ניתן לבצע יישור כרומטוגרפי של ריבוי MS מפעילה 29 , (ראה טבלה של חומרים) 30.</li>
	<li>אם האפשרות זמינה בחבילת התוכנות, לאפשר &#34; התאמה בין הרצפים &#34; לפני הפעלת עיבוד נתונים.</li>
	<li>לאחר סיום הניתוח, יצא את הרשימה פפטיד יחד עם הערכים כמת.</li>
</ol>

<ol><li>Bonasio, R., Shiekhattar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+transcription+by+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of transcription by long noncoding RNAs.</a> Annu Rev Genet. 48, 433-455 (2014).</li>
<li>Bonasio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+topics+in+epigenetics%3A+ants%2C+brains%2C+and+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs.</a> Ann N Y Acad Sci. 1260, 14-23 (2012).</li>
<li>Rinn, J. L., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+regulation+by+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Genome regulation by long noncoding RNAs.</a> Annu Rev Biochem. 81, 145-166 (2012).</li>
<li>Goff, L. A., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+RNA+biology+to+lncRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Linking RNA biology to lncRNAs.</a> Genome Res. 25 (10), 1456-1465 (2015).</li>
<li>Holoch, D., Moazed, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-mediated+epigenetic+regulation+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-mediated epigenetic regulation of gene expression.</a> Nat Rev Genet. 16 (2), 71-84 (2015).</li>
<li>Chu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+of+Xist+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery of Xist RNA binding proteins.</a> Cell. 161 (2), 404-416 (2015).</li>
<li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li>
<li>Minajigi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomes.+A+comprehensive+Xist+interactome+reveals+cohesin+repulsion+and+an+RNA-directed+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation.</a> Science. 349 (6245), (2015).</li>
<li>Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins%3A+modular+design+for+efficient+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins: modular design for efficient function.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).</li>
<li>Cabili, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+annotation+of+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+reveals+global+properties+and+specific+subclasses%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses.</a> Genes Dev. 25 (18), 1915-1927 (2011).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li>
<li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li>
<li>Kwon, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+repertoire+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells.</a> Nat Struct Mol Biol. 20 (9), 1122-1130 (2013).</li>
<li>Beckmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+proteomes+from+yeast+to+man+harbour+conserved+enigmRBPs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs.</a> Nat Commun. 6, 10127(2015).</li>
<li>Conrad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+interactome+capture+of+the+human+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Serial interactome capture of the human cell nucleus.</a> Nat Commun. 7, 11212(2016).</li>
<li>Wilusz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+triple+helix+stabilizes+the+3%27+ends+of+long+noncoding+RNAs+that+lack+poly%28A%29+tails%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A triple helix stabilizes the 3' ends of long noncoding RNAs that lack poly(A) tails.</a> Genes Dev. 26 (21), 2392-2407 (2012).</li>
<li>Kim, T. K., Shiekhattar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architectural+and+Functional+Commonalities+between+Enhancers+and+Promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters.</a> Cell. 162 (5), 948-959 (2015).</li>
<li>Brannan, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SONAR+Discovers+RNA-Binding+Proteins+from+Analysis+of+Large-Scale+Protein-Protein+Interactomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">SONAR Discovers RNA-Binding Proteins from Analysis of Large-Scale Protein-Protein Interactomes.</a> Mol Cell. 64 (2), 282-293 (2016).</li>
<li>Bonasio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+with+RNA+direct+the+Polycomb+group+protein+SCML2+to+chromatin+where+it+represses+target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Interactions with RNA direct the Polycomb group protein SCML2 to chromatin where it represses target genes.</a> Elife. 3, e02637(2014).</li>
<li>Kaneko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+JARID2+and+noncoding+RNAs+regulate+PRC2+recruitment+to+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Interactions between JARID2 and noncoding RNAs regulate PRC2 recruitment to chromatin.</a> Mol Cell. 53 (2), 290-300 (2014).</li>
<li>Kaneko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+the+PRC2+component+Ezh2+is+cell+cycle-regulated+and+up-regulates+its+binding+to+ncRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of the PRC2 component Ezh2 is cell cycle-regulated and up-regulates its binding to ncRNA.</a> Genes Dev. 24 (23), 2615-2620 (2010).</li>
<li>Saldana-Meyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF+regulates+the+human+p53+gene+through+direct+interaction+with+its+natural+antisense+transcript%2C+Wrap53%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">CTCF regulates the human p53 gene through direct interaction with its natural antisense transcript, Wrap53.</a> Genes Dev. 28 (7), 723-734 (2014).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Identification+of+RNA-Binding+Domains+in+Human+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Identification of RNA-Binding Domains in Human Cells.</a> Mol Cell. 63 (4), 696-710 (2016).</li>
<li>He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Mapping+of+RNA-Binding+Regions+in+the+Nuclear+Proteome+of+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Mapping of RNA-Binding Regions in the Nuclear Proteome of Embryonic Stem Cells.</a> Mol Cell. 64 (2), 416-430 (2016).</li>
<li>Favre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Thiouridine+photosensitized+RNA-protein+crosslinking+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">4-Thiouridine photosensitized RNA-protein crosslinking in mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 141 (2), 847-854 (1986).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li>
<li>Favre, A., Saintome, C., Fourrey, J. L., Clivio, P., Laugaa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thionucleobases+as+intrinsic+photoaffinity+probes+of+nucleic+acid+structure+and+nucleic+acid-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Photochem+Photobiol+B%22%5BJournal%5D)">Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions.</a> J Photochem Photobiol B. 42 (2), 109-124 (1998).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li>
<li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skyline%3A+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li>
<li>Kondo, Y., Oubridge, C., van Roon, A. M., Nagai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+human+U1+snRNP%2C+a+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle%2C+reveals+the+mechanism+of+5%27+splice+site+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of human U1 snRNP, a small nuclear ribonucleoprotein particle, reveals the mechanism of 5' splice site recognition.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

אנו מתארים פרוטוקול נסיוני מפורט לביצוע RBR-ID mESCs ו, עם והתאמות, בתוך כל תא שאינו ניתן לשלב 4SU RNA. סוגי תאים אחרים עשויים לדרוש אופטימיזציה של הגישה כדי להבטיח קליטה מספיק רעש יחס. בנוסף, בעוד הפרוטוקול המתוארים בזאת מתמקדת על הבחינה של גרעיני RBPs, הטכנולוגיה RBR-ID צריך להיות מותאם בקלות תאים הסלולר שונים, כגון ציטוזול או organelles מסוים, על ידי שימוש fractionation שונים אסטרטגיות. פרמטרים שיחייבו המיטוב כוללים ריכוז 4SU וזמן התאגדות, כמו גם את האנרגיה של UV crosslinking. פרמטרים אלה חשובים להבטיח מערך יעיל של RN...

מטרת השיטה RBR-ID היא כדי לזהות רנ א מחייב הרומן חלבונים (RBPs) מפת אזורים מחייב RNA שלהם (RBRs) עם פפטיד ברמת רזולוציה כדי להקל על העיצוב של RNA-איגוד מוטציות והחקירה של הביולוגי, הביוכימי פונקציות של אינטראקציות חלבון-RNA.
רנ א היא ייחודית בין מולקולות כמו זה יכול גם לשמש שליח נושא מידע גנטי וגם גם לקפל לתוך מבנים תלת-ממדיים מורכבים עם ביוכימיות פונקציות יותר דומה לאלה של חלבונים1,2. גוף גדל והולך של ראיות מרמז כי noncoding RNAs (ncRNAs) תפקיד חשוב שונים ג'ין מסלולים epigenetic ולניהולו4,3,5 , בדרך כלל, פונקציות רגולטוריות אלו הם מתווכת בהופעה עם חלבונים המקיימים אינטראקציה באופן ספציפי עם RNA נתון. הרלוונטיות, קבוצה של חלבונים שמעצבת זוהה לאחרונה עבור ncRNA זמן ובאינטנסיביות למדה (lncRNA) Xist, מתן ערך תובנה איך lncRNA זו שמתווכת שמושרש איון הנשי תאים6,7 ,8. ראוי לציין, מספר חלבונים אלה אינטראקציה-Xist אינם מכילים כל התחומים הקנוני RNA מחייב9, ולכן הפעילות מחייב RNA שלהם לא יכול להיות החזוי סיליקו בהתבסס על הרצף העיקרי שלהם לבד. בהתחשב בכך כי אלפי lncRNAs באים לידי ביטוי בכל תא נתון10, סביר להניח כי רבים מהם עשוי לפעול באמצעות אינטראקציות עם עדיין מתגלים RNA מחייב חלבונים (RBPs). אסטרטגיית ניסיוני לזהות את אלה RBPs הרומן ולכן להקל במידה רבה על המשימה של לנתח את תפקוד ביולוגי ncRNAs.
ניסיונות קודמים כדי לזהות RBPs מדעית צריכים לסמוך על תיקים עשויים + מבחר RNA מצמידים ספקטרומטר מסה (MS)11,12,13,14,15. למרות ניסויים אלה להוסיף חלבונים רבים רשימת בשם RBPs, על ידי עיצוב שהם יוכלו להבחין רק חלבונים מאוגדים תעתיקים polyadenylated. עם זאת, רוב RNAs קטן lncRNAs רבים אינם polyadenylated. 16 , 17 , חלבונים שמעצבת שלהם סביר הוחמצו בניסויים אלה. מחקר שנערך לאחרונה חלה בלמידה על חלבון interactome מסדי נתונים כדי לזהות חלבונים מטוהרים במשותף עם מספר RBPs ידוע והראה כי השותפים RBP חוזרים ונשנים האלה היו בסבירות גבוהה יותר להחזיק RNA מחייב פעילות18. עם זאת, גישה זו מסתמכת על כרייה מסדי נתונים קיימים של האינטראקציה גדולה, רק לזהות חלבונים אשר יכול להיות שותף מטוהרים בתנאים שאינם denaturing עם RBPs הידוע, ובכך למעט מניתוח לא מסיסים ממברנה-מוטבע, נדיר חלבונים.
הזיהוי של חלבון כמו bona פיד ה RBP לעתים קרובות אינה נותנת באופן אוטומטי מידע על תפקיד ביולוגי ו/או ביוכימי של אינטראקציה חלבון-RNA. כדי להתייחס לנקודה זו, רצוי בדרך כלל לזיהוי חלבון תחום ושל חומצות אמינו משקעי מעורב האינטראקציה כך מוטציות ספציפיות יכול להיות שנועד לבחון את הפונקציה של איגוד ה-RNA בהקשר של כל הרומן RBP19, 20. הקודם המאמצים על ידי הקבוצה שלנו ואחרים השתמשו שברי חלבון רקומביננטי, מוטציות המחיקה כדי לזהות רנ א איגוד אזורים (RBRs)19,20,21,22; עם זאת, גישות כאלה הם עתירי עבודה תואם לניתוחים תפוקה גבוהה. לאחרונה, מחקר תיאר אסטרטגיית ניסיוני למפות RNA מחייב פעילויות אופנה תפוקה גבוהה באמצעות ספקטרומטר מסה23; עם זאת, גישה זו התבססה על מבחר תיקים עשויים זוגי + RNA, וכך נשא עליו אותן מגבלות כמו זיהוי RBP הגישות שתוארו לעיל.
פיתחנו שיטה, הנקרא RNA איגוד אזור זיהוי (RBR-), המנצלת חלבון-RNA photocrosslinking, ספקטרומטר מסה כמותיים כדי לזהות חלבונים ואזורים חלבון אינטראקציה עם ה-RNA בתאים חיים בלי הנחה על מצב פוליאדנילציה RNA, כולל RBPs מאוגדים תיקים עשויים-RNAs24. יתר על כן, שיטה זו מסתמך אך ורק על crosslinking, יש אין דרישות על מסיסות חלבון או נגישות, ולכן הוא מתאים למיפוי RNA מחייב פעילות בתוך ממברנות (למשל מעטפת הגרעין) או תאים מסיסות ( למשל המטריקס גרעינית). אנו מתארים את השלבים ניסיוני כדי לבצע RBR-מזהה הגרעינים של תאי גזע עובריים בעכבר (mESCs) אבל עם שינויים מזעריים פרוטוקול זה צריך להיות מתאים למגוון רחב של סוגי תאים, ובלבד שהם ניתן לשלב ביעילות 4SU מתרבות בינוני.

<table><tbody><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי, מוסמך, ממוצא אמריקאי</td><td>Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת L-גלוטמין 200 מ"מ</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100&)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO לוקמיה מעכב גורם (LIF)</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td></td></tr> PD0325901 תמיסת ג'לטין <tr><td></td><td>Sigma</td><td>PZ0162</td><td></td></tr><tr><td>, 2% במים</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>4-thiouridine</td><td>Sigma</td><td>T4509</td><td>מלאי 50 מ"מ במים</td></tr><tr><td>Spectrolinker XL-1500</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-992-90</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td><td>Sigma</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CO-630</td><td>Sigma</td><td>542334</td><td>צורה מסחרית של חומר ניקוי אוקטיל-פנוקסי-פוליאתוקסי-אתנול</td></tr><tr><td>יודואצטמיד</td><td>Sigma</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין, דרגת ריצוף</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Empore דיסק מיצוי פאזה מוצקה</td><td>3M</td><td>66883</td><td></td></tr><tr><td>OLIGO R3 הפוך - שלב שרף</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>1133903</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Sigma</td><td>E8263</td><td>נוקלאז בטוהר גבוה</td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator דגם 100</td><td>Fisher Scientific</td><td>הופסק</td><td>עודכן עם FB505110</td></tr><tr><td>HPLC כיתה אצטוניטריל</td><td>פישר כימי</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>HPLC כיתה מים</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6 4</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11650</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום ביקרבונט</td><td>Sigma</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>Sigma</td><td>49199</td><td></td></tr><tr><td>חומצה פורמית</td><td>Sigma</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 18-AQ</td><td>Dr. Maisch GmbH HPLC</td><td>r13.aq.0003</td><td>חומר אריזה לעמודת HPLC</td></tr><tr><td>נימי לעמודות ננו (75 ומיקרו; m)</td><td></td> <td>תוכנת Molex</td> 1068150017 <td></td></tr><tr><td>MaxQuant</td><td>מכון מקס פלאנק לביוכימיה</td><td></td><td>יכול לבצע יישור כרומטוגרפי של ריצות MS מרובות</td></tr></tbody></table>

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של rna-איגוד אזורים

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Noncoding RNAs תפקיד חשוב בתהליכים גרעיניים מספר, לרבות ויסות גנים, הכרומטין ו- DNA לתקן. ברוב המקרים, הפעולה של noncoding RNAs מתווך על ידי פונקציות אשר בתורו מוסדרים על ידי אינטראקציות אלה noncoding RNAs עם חלבונים. בקנה אחד עם זה, מספר גדל והולך של החלבונים המעורבים פונקציות גרעיני דווח לאגד RNA, במקרים אחדים האזורים RNA-איגוד של חלבונים אלו שמופו, לעיתים קרובות באמצעות שיטות מפרך, המבוססים על המועמד.
כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול מפורט לביצוע זיהוי מוטים תפוקה גבוהה, פרוטאום ברוחב של RNA-מחייב חלבונים ואזורים מחייב RNA שלהם. המתודולוגיה מתבססת על שילוב של uridine photoreactive אנלוגי ב- הסלולר RNA, ואחריו crosslinking בתיווך UV חלבון-RNA, וניתוחים ספקטרומטר מסה לחשוף RNA-תפור פפטידים בתוך פרוטאום. אמנם אנו מתארים את ההליך עבור תאי גזע עובריים בעכבר, הפרוטוקול צריך ניתן להתאים בקלות במגוון של תאים בתרבית.

איור 1 מציג את זרימת העבודה RBR-ID. בשל יעילות נמוכה יחסית crosslinking טכניקה זו, חשוב מאוד לשקול דלדול רמת והן עקביות של האפקט הנצפה (P -ערך) על פני משכפל ביולוגי. איור 2 מציג את חלקת הר געש כתוצאה RBR-ID. פפטידים חפפו RNA זיהוי מוטיב (RRM) תחום מציגים רמה גבוהה עקבית דלדול. RRM תחומים יכול לשמש כפקד חיובי לניתוח RBR-ID.
RBR-ID ניתן למפות RBRs בתאים חיים. ציו...

אנו מתארים פרוטוקול כדי לזהות רנ א מחייב חלבונים ולמפות אזורים מחייב RNA שלהם ב תאים חיים באמצעות photocrosslinking בתיווך UV וספקטרומטר מסה.

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לזהות חלבוני קישור ל-RNA בתאים חיים ולמפות את אזורי הקישור שלהם ל-RNA באמצעות קישור צולב פוטוכימי (photo cross-linking) המתווך על ידי UV, ולאחריו ספקטרומטריית מסות. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום האפיגנטיקה, כגון אילו ווסתים אפיגנטיים קשורים ל-RNA ואילו אזורים בחלבון נחוצים לאינטראקציות אלו. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא אינה כוללת טיהור של קומפלקסי חלבון-RNA, ולפיכך היא דורשת כמות מועטה של חומר ומזהה חלבונים הקשורים לכל סוג של RNA.כפי שהוצגה, שיטה זו מתמקדת בחלבונים גרעיניים מכיוון שזהו העניין המדעי שלנו, אך עם שינויים קלים בשלבי הפרקציונציה, ניתן להשתמש בה כדי לחקור RNA וחלבונים קושרים במדורים תאיים אחרים. לאחר תרבית והרחבה של תאי ESC של עכבר בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הרחב את התאים למספר הנדרש של צלחות בנפח 10 סנטימטר. לפני שהצלחות יגיעו למצב של התמזגות (confluency), הוסף ארבעה SU ישירות למצע בריכוז סופי של 500 micro molar.השאר את צלחות הביקורת של 4sU ללא טיפול. נער בעדינות את הצלחות כדי להפיץ את ה-4sU באופן הומוגני בכל המצע, ולאחר מכן החזר את הצלחות לאותו אינקובטור לתרבית רקמות למשך שעתיים. יעילות השילוב של 4sU משתנה בין סוגי תאים שונים, ולכן ייתכן שיהיה צורך לאפטם את ריכוזו ואת זמן האינקובציה כדי להבטיח קשירה צולבית יעילה ולמזער רעילות.לאחר מכן, העבירו את הפלטות לדלי קרח והשליכו את המצע. לאחר מכן, השתמשו ב-5 milliliters של PBS קר מאוד כדי לשטוף בעדינות את הפלטות. הוסיפו 2 milliliters של PBS קר מאוד והניחו את הפלטות ללא מכסים בתוך cross-linker המצויד בנורות הפולטות UV-B.הקרינו את הפלטות בהגדרת אנרגיה של 1 Joule לסמ"ר. קישור צלב (cross-linking) יעיל באמצעות UV הוא קריטי. אנו ממליצים להשתמש באור UV-B, אך ניתן להשתמש גם ב-UV-A.בכל מקרה, יש לבצע אופטימיזציה לכמות אנרגיית ה-UV שבה נעשה שימוש, וניתן לנטרה באמצעות PAR-CLIP או ChIRP. השתמשו בקוולקטורים (cell lifters) כדי לאסוף את התאים ולהעבירם ל-PBS קר בקרח בתוך מבחנות קוניות. לאחר מכן, סובבו את התאים בצנטריפוגה ב-2000 ×g ובטמפרטורה של 4 °C למשך חמש דקות.הסרו את העל-נוזל (supernatant) והשעיקו מחדש את משקע התאים בחמישה מיליליטר של PBS קר בקרח עם 2 millimolar EDTA ו-0.2 millimolar PMSF. ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר. צפויות חמישה עד עשרה, ועשרה עד עשרים מיליון תאים מצלחות של 10 סנטימטר ו-15 סנטימטר, בהתאמה.לאחר מכן, סובב את התאים בצנטריפוגה ב-2000 ×g ובטמפרטורה של 4 °C למשך חמש דקות. כדי לבודד גרעינים מהתאים, הכן באפר A קר בקרח כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לפני השימוש, הוסף 0.5 mM DTT ו-0.2 mM PMSF לכמות הרצויה של באפר A. הוסף 2 mL של הבאפר הקר לתאים כדי לשטוף אותם, ולאחר מכן סובב את התאים בצנטריפוגה ב-2500 ×g ובטמפרטורה של 4 °C למשך חמש דקות.יש להשליך את העל-נוזל, ולהוסיף באפר A שתוסף לו 0.2% של דטרגנט לא-יוני ולא-דנטורטיבי, ולאחר מכן לסובב את הדגימה בטמפרטורה של 4 °C למשך חמש דקות. לאחר סבוב של התאים ב-2500 ×g למשך חמש דקות, יש להסיר את העל-נוזל. המשקע מורכב מגרעינים שלמים נטולי ציטופלזמה.כדי לבלוס את הגרעינים, הוסף 200 µL של לביס באפר (lysis buffer) למבחנה. השתמש בפרובה בקוטר 1/8 אינץ' כדי לבצע סוניקציה לדגימה לצורך גזירת הכרומטין בהגדרת אמפליטודה של 50% למשך חמישה עד עשרה שניות. סובב את הדגימה ב-12000 ×g למשך חמש דקות ואסוף רק 175 µL של על-משקע (supernatant) כדי להימנע מהמשקע.בשלב הבא, מדדו את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת Bradford או טכניקה דומה. לאחר מכן, השתמשו בבופר ליזיס (lysis buffer) כדי לדלל את החלבון בדגימות השונות לריכוז של 1 מיליגרם למיליליטר או לריכוז הדגימה הנמוך ביותר. הוסיפו תמיסת DTT בריכוז 5 מילימולר לליזאט הגרעיני והדגירו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.לאחר מכן, הוסיפו 14 millimolar iodoacetamide ממלאי מלאים טריים והדגירו את הלייזט בטמפרטורת החדר בחושך למשך 30 דקות. דללו את הלייזט עם פי חמישה מנפחו של 50 millimolar ammonium bicarbonate, ולאחר מכן הוסיפו trypsin. הדגירו את הדגימה בטמפרטורה של 37 degrees celsius למשך לילה.להכנת קצה טיפ מותאם אישית אחד עבור כל דגימה, מקמו דיסקית של חומר C18 לסמיכה מוצקה בתחתית של טיפ פיפט בנפח 200 microliter. הוסיפו 50 microliters של Oligo R3 reverse-phased resin מעל דיסקית ה-C18, ולאחר מכן מקמו את קצה הטיפ בתוך מתאם צנטריפוגה והניחו את המתאם בתוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 milliliter. הוסיפו 100 microliters של 100 percent acetonitrile לטיפים כדי לשטוף אותם.לאחר מכן, סובבו את הקצות (tips) בצנטריפוגה ב-1000 $\times$g למשך דקה אחת כדי להסיר את הממס. השריו את הקצות ב-50 µL של 0.1% חומצה טריפלואורואצטית או TFA לצורך שיווי משקל. לאחר מכן, סובבו אותם שוב.הוסיפו חומצה פורמית בריכוז 100% לדגימת החלבון שעברה עיכול כדי להוריד את ה-pH ל-2 עד 3. לאחר מכן, העמיסו את הדגימה על stage tip בהתאמה אישית וסובבו את הדגימה בצנטריפוגה במהירות של 1000 ×g למשך דקה אחת, עד שכל הדגימה תעבור דרך הטיפ. שטפו את הפפטידים הקשורים באמצעות 50 µL של 0.1% TFA.לאחר מכן, לאחר סבב של הדגימה ב-1000 times g למשך דקה אחת, אלט את הפפטידים על ידי הוספת 50 µL של תמיסת אלוציה (elution buffer) לקצה השלב (stage tip) וסבב במערכת צנטריפוגה ב-1000 times g למשך דקה אחת כדי להוציא את תמיסת האלוציה מהקצה. השתמש בצנטריפוגת ואקום המוגדרת ל-150 times g ו-1 עד 3 kPa למשך שעה אחת כדי לייבש את הדגימה. כדי להסיר RNA מקושר (cross-linked RNA) מהדגימה, השהה מחדש את המשקע ב-50 µL של 2x nuclease buffer.מדדו את ריכוז הפפטיד באורך גל של 280 ננומטר, בהנחה ש-1 מיליגרם למילליליטר של פפטידים נותן A280 של 1. השתמשו בבופר נוקלאז 2x כדי להתאים את כל הדגימות לריכוז של מיליגרם אחד למילליליטר או לריכוז הנמוך ביותר, ולאחר מכן הכינו תערובת מאסטר של 50 מיקרולטר מים בתוספת 1 מיקרולטר נוקלאז בטוהר גבוה לכל דגימה. ערבבו 50 מיקרולטר מדגימת הפפטיד עם 50 מיקרולטר מתערובת המאסטר של מים ונוקלאז.לאחר מכן, דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 37 degrees celsius למשך שעה אחת. לבסוף, בצעו כרומטוגרפיית ננו-נוזלים, ספקטרומטריית מסות ועיבוד נתונים בהתאם לפרוטוקול הכתוב. איור זה מציג תרשים Volcano של תוצאת RBR id מתאי גזע עובריים (ESCs) של עכבר.פפטידים שחפפו עם דומיין של מוטיב זיהוי RNA מופיעים בכחול ומראים רמות דלדול עקביות מאוד. פפטיד קושר RNA מ-HNRNPC מודגש באדום. מוצג כאן מפת חום של ציוני RBR id, המחושבים כהערכה של הסבירות של אזור חלבוני לקשירה של RNA.הניקוד מוצג על פני השטח של תת-היחידה הספליסומלית U1-70k. הצבע האדום הבוהק בסביבת המגע עם ה-RNA, כפי שנקבע על פי המבנה הגבישי, מעיד על זיהוי נכון של האינטראקציה בין החלבון ל-RNA. בדמות זו, TET2 מוצג כ-RBP חדש, ופעילות קישור ה-RNA ממופות לאזור הקצה ה-C על ידי שרטוט ניקוד ה-RBR id לאורך הרצף הראשוני של החלבון.לבסוף, ניתן לאמת את הדרישה ל-RBR חדש זה על ידי ביצוע PAR-CLIP באמצעות רצף הטיפוס הפראי והשוואת האות לזה של מוטציה החסרה את ה-RBR החזוי. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בתוך שבע עד שמונה שעות לאורך יומיים, במידה והיא מבוצעת כראוי. לפני השזירה (cross-linking), ניתן להמריץ את התאים באמצעות טיפולים שונים כדי לענות על שאלות נוספות, כגון כיצד מתחילה דיפרנציאציה או כיצד מחזור התא מווסת אינטראקציות בין RNA לחלבון.לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של האופן שבו מייצרים תכריכים המכילים קומפלקסים של חלבון ו-RNA מקושרים (cross-linked), במטרה לזהות אתרי אינטראקציה בין חלבונים ל-RNA באמצעות ספקטרומטריית מסות.

sample-preparation-for-mass-spectrometry-based-identification-rna

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

בשל האופי החולף של mRNA מראש, זה יכול להיות קשה לבודד...

שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם

תעתיקי רנ"א כפופים תקנה posttranscriptional נרחב כי הוא מתווך על ידי מספר רב של טרנס משחק RNA מחייב חלבונים (RBPs). כאן אנו מציגים שיטה להכליל לזהות במדויק בקנה מידה רחב transcriptome האתרים RNA מחייב של RBPs.

PAR-Clip - שיטה לזהות Transcriptome רחב אתרי קישור של חלבונים RNA הכבילה

בסרטון זה, אנו מתארים את האבולוציה השיטתית של ליגנדות בשיטת העשרה מעריכית (SELEX) כדי לזהות רצפים ספציפיים קושרי RNA עבור חלבון מטרה מעניין. החלבון מודגר עם מאגר גדול של רצפי RNA אקראיים, ורצפי הרנ"א קושרי החלבון מבודדים, מוגברים ב-PCR ומרוצפים כדי לזהות את אתרי קשירת החלבונים שלהם.

בדיקת קשירת מבחנה מבוססת SELEX לזיהוי אינטראקציות RNA-חלבון

ניתוח ביטוי גנים של תת-קבוצה של תאים ברקמה ספציפית מהווה אתגר גדול. מאמר זה מתאר כיצד לבודד RNA הכולל באיכות גבוהה מאוכלוסיית תאים ספציפית על ידי שילוב של שיטת immunolabeling מהירה עם microdissection ללכוד לייזר.

בידוד RNA מן אוכלוסיות תאים ספציפיות באמצעות Microdissection לייזר ללכוד בשילוב עם ראפיד immunolabeling

אינטראקציות חלבון RNA נמצאות בלב תהליכים תאיים רבים. כאן, אנו מתארים שיטת in vivo לבידוד RNA ספציפי וזיהוי חלבונים חדשים הקשורים אליו. זה יכול לשפוך אור חדש על האופן שבו RNA מווסתים בתא.

RNA מחייב רומן בידוד חלבונים לפי שיטת RAPID

הספציפיות לרצף היא קריטית. לתקנות הגנים חלבונים רגולטוריות המכירים רצפים ספציפיים חשובים עבור רגולציה גנטית. הגדרת אתרי קשירה פונקציונליים עבור חלבונים כאלה היא בעיה ביולוגית מאתגרת. גישה איטראטיבית לזיהוי של אתר מחייב עבור חלבון של איגוד RNA מתוארת כאן וישימה לכל החלבונים מבוססי RNA.

סיור במרחב הרצף כדי לזהות אתרי כריכה עבור חלבונים כריכת רנ א תקינה

אנו מציגים פרוטוקול RNA קטן מפורט של הספרייה רנ א עם פחות הטיה מאשר שיטות סטנדרטיות רגישות מוגברת עבור 2 '-O-מתיל RNAs. פרוטוקול זה יכול להיות בעקבות שימוש ריאגנטים תוצרת בית כדי לחסוך עלות או באמצעות ערכות לנוחות.

שיפור רנ א קטן-seq: פחות הטיה וזיהוי טוב יותר של 2 '-O-מתיל RNAs

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לשיטת ריצוף מבוססת LC-MS שיכולה לשמש כשיטה ישירה לרצף RNA קצר (&lt;35 nt לריצה) ללא ביניים cDNA, וכשיטה כללית לרצף שינויים שונים בנוקלאוטידים במחקר יחיד בדיוק של בסיס יחיד.

2D-HELS MS Seq: שיטה כללית מבוססת LC-MS לריצוף ישיר ודה נובו של תערובות RNA עם שינויים שונים בנוקלאוטידים

טכנולוגיית MAPS פותחה כדי לבחון את היעד של RNA רגולטורי ספציפי ב vivo. sRNA של עניין מתויג עם APTAMER MS2 המאפשר טיהור משותף של שותפי RNA שלה וזיהוי שלהם על ידי רצף RNA. פרוטוקול שונה זה מתאים במיוחד לחיידקים גראם חיוביים.

טיהור MS2-זיקה בשילוב עם רצף RNA בחיידקים גראם חיוביים

הפרוטוקול מספק הוראות לשינוי RNA עם דימתיל סולפט לניסויים בפרופיל מוטציות. הוא כולל בדיקה במבחנה ו - in vivo עם שתי שיטות הכנה חלופיות לספרייה.

בדיקת מבנה RNA עם פרופיל מוטציה של דימתיל סולפט עם ריצוף במבחנה ובתאים

למדו לזהות חלבונים מקשרי RNA ולמפות אזורי הקשירה שלהם בתאים חיים באמצעות צילום UV וספקטרומטריית מסה. שיטה זו מאפשרת חקר אינטראקציות RNA-חלבון באפיגנטיקה ללא צורך בניקוי מורכב.

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

גלה סרטונים נוספים