הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

המטרה הכוללת של הליך זה היא לזהות חלבונים קושרי RNA בתאים חיים ולמפות את אזורי קשירת ה-RNA שלהם באמצעות קישור צולב בתיווך UV ואחריו ספקטרומטריית מסה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האפיגנטיקה, כגון אילו מווסתים אפיגנטיים קשורים ל-RNA ואילו אזורי חלבון נדרשים לאינטראקציות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא אינה כרוכה בטיהור קומפלקסי ה-RNA החלבוני, ולכן דורשת מעט חומר ומזהה חלבונים הקשורים לכל סוג של RNA.

כפי שהוצג, שיטה זו מתמקדת בחלבונים גרעיניים מכיוון שזה העניין המדעי שלנו, אך עם שינויים קלים בשלבי הפיצול, ניתן להשתמש בה כדי לחקור RNA וחלבוני קישור בתאים אחרים של stu-nu-lar. לאחר תרבית והרחבת ESCs של עכברים על פי פרוטוקול הטקסט, הרחב את התאים למספר הנדרש של 10 לוחות סנטימטר. לפני שהלוחות מגיעים למפגש, הוסף ארבעה SU ישירות למדיום לריכוז סופי של 500 מיקרו טוחנת.

השאר את כלי הבקרה של 4sU ללא טיפול. נענע בעדינות את הצלחות כדי להפיץ באופן הומוגני את ה- 4sU בכל המדיום, ואז החזיר את הצלחות לאותה חממת תרבית רקמות למשך שעתיים. היעילות של שילוב 4sU משתנה בין סוגי התאים, ולכן ייתכן שיהיה צורך לייעל את הריכוז וזמן הדגירה שלו כדי להבטיח קישור צולב יעיל ולמזער רעילות.

לאחר מכן, העבירו את הצלחות לדלי קרח והשליכו את המדיום. לאחר מכן, השתמש ב -5 מיליליטר PBS קר כקרח כדי לשטוף בעדינות את הצלחות. הוסף 2 מיליליטר PBS קר כקרח והנח את הצלחות ללא מכסים לתוך מקשר צולב המצויד בנורות פולטות UV-B.

להקרין את הלוחות בהגדרת אנרגיה של 1 ג'אול לסנטימטר מרובע. קישור צולב UV יעיל הוא קריטי. אנו ממליצים להשתמש באור UV-B, אך ניתן להשתמש גם ב-UV-A.

בכל מקרה, יש לייעל את כמות אנרגיית ה-UV המשמשת וניתן לנטר אותה על ידי PAR-CLIP או ChIRP. השתמש במרימי תאים כדי לאסוף את התאים ולהעביר אותם ל-PBS קר כקרח בצינורות חרוטיים. לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים ב -2000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את כדור התא בחמישה מיליליטר PBS קר כקרח עם 2 מילי-מולרי EDTA ו-0.2 מילי-מולרי PMSF. בעזרת המוציטומטר, ספרו את התאים. צפו לחמישה עד עשרה, ועשרה עד עשרים מיליון תאים מלוחות של 10 סנטימטר ו-15 סנטימטר, בהתאמה.

לאחר מכן, צנטריפוגה את התאים ב -2000 פעמים גרם ו -4 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. כדי לבודד גרעינים מהתאים, הכינו מאגר קר כקרח A כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לפני השימוש, הוסף 0.5 מילי-מולרי DTT ו-0.2 מילי-מולרי PMSF לכמות המאגר הרצויה A.הוסף 2 מיליליטר של המאגר הקר לתאים כדי לשטוף אותם, ואז סובב את התאים ב-2500 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.

השליכו את הסופרנטנט והוסיפו מאגר A בתוספת 0.2 אחוז של חומר ניקוי לא יוני שאינו מנטור, ואז סובבו את הדגימה ב-4 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר סיבוב התאים ב -2500 פעמים גרם למשך חמש דקות, הסר את הסופרנטנט. הגלולה מורכבת מגרעינים שלמים נטולי ציטופלזמה.

כדי ליז את הגרעינים, הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר ליזה לצינור. השתמש בבדיקה בגודל 1/8 אינץ' כדי לבצע סוניזציה של הדגימה כדי לגזור את הכרומטין בהגדרת משרעת של 50 אחוז למשך חמש עד עשר שניות. סובב את הדגימה ב-12000 פעמים גרם למשך חמש דקות ואסוף רק 175 מיקרוליטר של סופרנטנט כדי להימנע מהגלולה.

לאחר מכן, מדוד את ריכוז החלבון באמצעות מבחן ברדפורד או טכניקה דומה. לאחר מכן, השתמש במאגר ליזה כדי לדלל את החלבון בדגימות השונות ל-1 מיליגרם למיליליטר או לריכוז הדגימה הנמוך ביותר. הוסף תמיסת DTT של 5 מילי-מולרית לליזאט הגרעיני ודגר את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך שעה.

לאחר מכן, הוסיפו 14 מילי-מולארי יודואצטמיד מציר טרי ודגרו את הליזאט בטמפרטורת החדר בחושך למשך 30 דקות. מדללים את הליזאט בנפח פי חמישה מאמוניום ביקרבונט 50 מילי-מולרי, ואז מוסיפים טריפסין. דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

כדי להכין קצה שלב אחד בהתאמה אישית לכל דגימה, הנח דיסק של חומר C18 מיצוי פאזה מוצק בתחתית קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר. הוסף 50 מיקרוליטר של שרף Oligo R3 בפאזה הפוכה על גבי דיסק C18, ולאחר מכן הנח את קצה ה-stage בתוך מתאם צנטריפוגה והנח את המתאם בתוך צינור מיקרופוגה של 1.5 מיליליטר. הוסף 100 מיקרוליטר של 100 אחוז אצטוניטריל לקצוות כדי לשטוף אותם.

ואז צנטריפוגה את הקצוות ב 1000 פעמים גרם למשך דקה אחת כדי להסיר את הממס. מאזנים את הקצוות עם 50 מיקרוליטר של 0.1 אחוז חומצה טריפלואורואצטית או TFA. לאחר מכן, סובב אותם שוב.

הוסף 100 אחוז חומצה פורמית לדגימת החלבון המעוכלת כדי להפחית את ה-PH ל-2 עד 3. לאחר מכן, טען את הדגימה על קצה במה בהתאמה אישית וצנטריפוגה את הדגימה ב-1000 פעמים גרם למשך דקה אחת עד שכל הדגימה עוברת דרך הקצה. שטפו את הפפטידים הקשורים עם 50 מיקרוליטר של 0.1 אחוז TFA.

לאחר מכן, לאחר סיבוב הדגימה ב-1000 פעמים גרם למשך דקה אחת, יש לסלק את הפפטידים על ידי הוספת 50 מיקרוליטר של מאגר פליטה לקצה הבמה וצנטריפוגה ב-1000 פעמים גרם למשך דקה אחת כדי לאלץ את מאגר הפליטה החוצה מהקצה. השתמש בצנטריפוגת ואקום המוגדרת פי 150 גרם ו-1 עד 3 קילופסקל למשך שעה כדי לייבש את הדגימה. כדי להסיר RNA צולב מהדגימה, השעו מחדש את הגלולה ב-50 מיקרוליטר של מאגר נוקלאז פי 2.

מדוד את ריכוז הפפטיד ב-280 ננומטר בהנחה של 1 מיליגרם למיליליטר של פפטידים עבור ו-A280 של 1. השתמש במאגר נוקלאז פי 2 כדי להתאים את כל הדגימות למיליגרם אחד למיליליטר או לריכוז הנמוך ביותר, ולאחר מכן הכין תערובת מאסטר של 50 מיקרוליטר מים בתוספת 1 מיקרוליטר של נוקלאז בטוהר גבוה לכל דגימה. שלב 50 מיקרוליטר של דגימת פפטיד עם 50 מיקרוליטר מים בתוספת תערובת מאסטר נוקלאז.

לאחר מכן, דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לבסוף, בצע כרומטוגרפיה ננו-נוזלית, ספקטרומטריית מסה ועיבוד נתונים על פי פרוטוקול הטקסט. איור זה מציג תרשים הר געש של תוצאת מזהה RBR מ-ESCs של עכברים.

פפטידים שחפפו לתחום מוטיב זיהוי RNA הם בכחול ומראים רמות דלדול עקביות ביותר. פפטיד קושר RNA מ-HNRNPC מודגש באדום. מוצגת כאן מפת חום של ציוני זיהוי RBR המחושבים כהערכה של סבירות קשירת RNA של אזור חלבון.

הציון מוקרן על פני השטח של תת-היחידה הספלסאוזומלית U1-70k. הצבע האדום הבוהק בקרבת מגע ה-RNA, כפי שנקבע על ידי מבנה הגביש, מעיד על זיהוי נכון של אינטראקציית ה-RNA החלבוני. באיור זה, TET2 מוצג כ-RBP חדש ופעילות קשירת ה-RNA ממופה לאזור טרמינל C על ידי התוויית ציון מזהה ה-RBR לאורך הרצף הראשוני של החלבון.

לבסוף, ניתן לאמת את הדרישה ל-RBR חדש זה על ידי ביצוע PAR-CLIP באמצעות רצף הסוג הפראי והשוואת האות לזה של מוטאנט חסר ה-RBR החזוי. לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך שבע עד שמונה שעות במשך יומיים אם היא מבוצעת כראוי. לפני הקישור הצולב, ניתן לגרות תאים באמצעות טיפולים שונים על מנת לענות על שאלות נוספות כמו כיצד מתחילה התמיינות או כיצד מחזור התא מווסת אינטראקציות חלבון RNA.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור תוספות המכילות קומפלקסים של RNA חלבוני מקושר כדי לזהות אתרים של אינטראקציות RNA חלבון עם ספקטרומטריית מסה.