פרוטוקולים מקיפה לדוגמה, מח עצם תהליך למדידת מחלה שיורית מדיד, לוקמיה בתאי גזע לוקמיה מיאלואידית חריפה

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לבצע בדיקה מדויקת של דגימות מח עצם מחולי לוקמיה מיאלואידית חריפה למחלה שיורית מדידה כולל כימות תאי גזע של לוקמיה. שיטה זו יכולה לספק הערכה מדויקת של מחלה שיורית הניתנת למדידה בדגימות מח עצם של חולי לוקמיה מיאלואידית חריפה. היתרון העיקרי של גישה זו הוא שמעקב צמוד אחר הפרוטוקול מניב תוצאות איכותיות וניתנות לשחזור גבוה.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על קבלת החלטות קליניות מכיוון שהיא יכולה לשמש כקריאה של תגובת המטופלים לטיפול. ידגימו את ההליכים ג'רואן יאנסן, המטולוג, גריט סיים, טכנאי המעבדה ההמטולוגית האבחנתית וג'ניפר שיק וסנדר סנל, טכנאים מצוות MRD. כאשר המטופל במצב דקוביטוס לרוחב, סמן את עמוד השדרה הכסלי האחורי העליון בעט וחטא את העור של אזור הביופסיה המיועד עם 0.5 עד 1% כלורהקסידין באתנול בתנועה מעגלית כלפי חוץ.

לאחר מתן הרדמה מקומית, הרם מחט בגודל 15 בגודל 2.8 אינץ' עם הקצה הפרוקסימלי בכף היד והאצבע המורה כנגד צד פיר המתכת של המחט ליד הקצה לשליטה. בעזרת לחץ עדין אך יציב, הכניסו את המחט בתנועה מהירה לסירוגין דרך העור המורדם לכיוון עמוד השדרה הכסל. כאשר המחט באה במגע עם עמוד השדרה הכסלי האחורי, הסר את הסטילט והצמד למחט מזרק ריק של 10 מיליליטר.

משוך בעדינות את הבוכנה כדי ליצור לחץ שלילי בתוך המזרק עד שנקצרו עד 10 מיליליטר של חריצי מח עצם. אין ליטול יותר מ-10 מיל מח עצם לכל שאיבה כדי למנוע דילול המודיציה. הסר את המזרק והנח את הסטילט בחזרה על המחט.

לאחר מכן, הוצא כשני מיליליטר מהמח לתוך זכוכית שעון וודא שנשאבת מספיק דגימה כדי להזריק לתוך צינור מצופה הפרין של שמונה מיליליטר והפוך מיד את הצינור. כדי למנוע קרישה, חשוב להשקיע את הצינור המכיל נוגדי קרישה מיד עם הוספת מח העצם. להערכה מורפולוגית אופטימלית, השתמש במרית פלסטיק כדי להעביר חריצים מהשאיפה בזכוכית השעון למגלשת זכוכית, והחלק בזהירות מגלשת זכוכית נוספת על גבי המח.

לאחר הייבוש יש לצבוע את החריצים ב-May-Grunwald Giemsa לניתוח במיקרוסקופ אור. הנח את צינור מח העצם במחזיק פלסטיק והנח את המחזיק במיכל פלסטיק עם חבילת ג'ל סביבה וטופס בקשה מלא. לפני ניתוח מח העצם על ידי ציטומטריית זרימה, הפעל את ציטומטר הזרימה ופתח את תוכנת ניתוח ציטומטריית הזרימה כדי ליצור ניסוי חדש עם עלילת נקודות פיזור קדימה לעומת פיזור צד.

להערכת הגודל והגרעיניות של התאים, טען תאי דם היקפיים ללא תווית מתורם בריא ובחר בפונקציית Acquire Cells. שער את הלימפוציטים והתאם את מתחי הפיזור קדימה והצד כדי להגיע לערכי היעד הממוצעים המתאימים לאוכלוסיית התאים המגודר. לאחר מכן, רכוש נתונים עבור לפחות 10,000 אירועים.

כדי להגדיר את מתחי צינור מכפיל הצילום של ערוץ התפרחת היעד, השתמש תחילה בחלקיקי כיול חרוזי קשת בשמונה שיאים בהתאם להוראות היצרן כדי לרכוש 10,000 אירועים בקצב זרימה נמוך. שער את חרוזי הסינגל בתרשים נקודות הפיזור קדימה לעומת הצד ואחריו שער הפסגה השביעית בתרשים הנקודות FITC-PE. שער את אוכלוסיות החרוזים המתקבלות עבור כל פלואורופור.

המשך ברכישת מתלה חרוזי הקשת בעל שמונה הפסגות והתאם וכוונן את מתחי ה-PMT בכל ערוצי הקרינה כדי להגיע לערכי MFI יעד בהתאם להוראות היצרן. השתמש ברשומה כדי לאסוף נתונים של כ-2,000 אירועים ולבדוק את ה-MFI עבור חרוזי השיא השביעי. לאחר מכן, הוסף נפח מספיק של כל נוגדן מצומד פלואורוכרום ניסיוני כדי לצבוע את החרוזים בצינורות הפריחה המתאימים מינוס בקרה אחת ולערבל את הצינורות ביסודיות.

צור ניסוי ריק חדש עם אותם פרמטרי פיצוי תוך הקפדה על כך שסף הפיזור קדימה מוגדר ל-5, 000 וערכי הפיצוי של כל הפלורוכרומים הם אפס. כדי ליצור את בקרות הפיצוי, בחר בפונקציית יצירת בקרת פיצוי וטען את צינור הבקרה הלא מוכתם. כוונן את שער P1 סביב אוכלוסיית חרוזי הסינגלט וודא ששער P1 מכיל רק חרוזי סינגל.

לחץ לחיצה ימנית על שער P1 ובחר החל על כל בקרות הפיצוי. לאחר מכן, רשום נתונים עבור כל צינורות הפלורסנט המסומנים היחידים המאשרים ששער P2 מקיף את האוכלוסייה החיובית בכל היסטוגרמה של תפרחת. כדי לצבוע את התאים לניתוח זרימה ציטומטרי, העבר את מח העצם למעבדה, בדוק את טופס הבקשה כדי לאמת את מספר המחקר ותאריך הלידה של המטופל ולקבוע מה צריך לצבוע.

עבור MRD, אנו משתמשים בלוח צביעה המורכב מארבעה צינורות. כאן אנו מדגימים את הצביעה של לוח ה- LSC המורכב מצינור אחד. לאחר ספירת התאים, העבירו את הנפח המתאים של מח העצם לצינור חדש של 15 מיליליטר.

הוסף מאגר ליזה פי 10 מנפח תאי הניסוי כדי ליז את כדוריות הדם האדומות. הפוך את הצינור כדי לערבב ולדגור על התאים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. בתום תקופת הליזיס, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה.

השעו מחדש את התאים ב-15 מיליליטר של מאגר כביסה בטמפרטורת החדר וקצרו שוב את כדור התא על ידי צנטריפוגה. בינתיים, פיפטה את הכמות המתאימה של תמיסת קוקטייל נוגדנים בצינורות FACS של חמישה מיליליטר. מוצג כאן הפאנל של צינור תאי הגזע.

השעו מחדש את הגלולה במאגר הכביסה והוסיפו את תרחיף התא לצינור ה-FACS המכיל את תמיסת קוקטייל הנוגדנים החד-שבטיים למשך 15 דקות בחושך. לאחר מכן, שטפו את התאים במאגר כביסה וגלו את התאים על ידי צנטריפוגה. לאחר צנטריפוגה, השעו מחדש את הגלולה ב-400 מיקרוליטר של מאגר כביסה טרי.

כדי לנתח את תאי הגזע הלוקמיים, הוסף ארבעה מיקרוליטרים של חרוזים ריקים לתרחיף התא המוכתם בקוקטייל הנוגדנים של תאי הגזע. לאחר מכן, קרא את הדגימות תוך שימוש בפרמטרים שנקבעו קודם לכן ורכש לפחות ארבע פעמים 10 עד האירועים השישיים מדגימות המטופלים הניסיוניים. כדי לזהות את האימונופנוטיפ הקשור ללוקמיה שנצפה בכ-90% מחולי לוקמיה מיאלואידית חריפה, חיוני ששערי הפיצוץ יוגדרו כראוי כפי שמוצג באיור.

כאן מוצגות דוגמאות לנתונים ממטופלים בודדים המכילים סוגים שונים של סטייה בתאים פרימיטיביים חיוביים ל-CD34. בגרפים אלה ניתן לראות מטופל שנשאר בהפוגה מלאה וחולה שחזר לאחר תוצאות חיוביות של שאריות מחלה מדידות לאחר המחזור השני של טיפול האינדוקציה, מה שמדגיש את הצורך בהגדרת שער מדויקת לפני ניתוח הדגימה. הזיהוי והכימות של LSC דורשים ניתוח נוסף של אברנסיות במיוחד על תאי בלסט CD38 שליליים חיוביים ל-CD34 כפי שמוצג בגרפים אלה.

בעת ביצוע פרוטוקול זה, חשוב מאוד שיהיה צוות מיוחד וגיבוי לדגימת מח העצם, ההובלה, העבודה הניסויית ושלבי הניתוח של הליך זה. הליך זה יכול לשמש גם לביצוע ניתוח ציטוגנטי ומולקולרי כדי לענות על שאלות נוספות לגבי המתאם בין אוכלוסיות תאים ספציפיות וסטיות מולקולריות מעניינות, או כדי לחדד את קבוצת הסיכון של המטופל לחיזוי תוצאה קלינית. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום ההמטולוגיה לחקור מחלה שיורית בחולי AML לאחר הטיפול.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד אנו מזהים ומכמתים במדויק מחלה שיורית באמצעות זרימה ציטומטרית כולל איסוף והובלה של דגימות מח עצם של חולי AML.