Functionalization פני השטח של חלקיקי וירוס הפטיטיס E בשיטות כימיות ההטיה
11 במאי 2018
שתכננו את החלבון capsid של וירוס הפטיטיס E כמו ננו-חלקיק theranostic (HEVNP). HEVNP עצמי מרכיבה לתוך כלוב icosahedral יציב במשלוח הרירית. כאן, אנו מתארים את השינוי של HEVNPs לגידול מיקוד על ידי מוטציה השטח החשופים שאריות אל cysteines, אשר נזווג סינתטי ליגנדים שקושרים במיוחד תאים סרטניים.
המטרה הכוללת של פונקציונליזציה כימית של פני השטח של ננו-חלקיקי HEV היא לספק גישה חוזרת ועקבית לצימוד של מולקולות אימונוגניות, טיפוליות ואבחנתיות מכוונות לפני השטח של ננו-חלקיקי HEV למטרות אבחון וטיפול. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הננו-רפואה, כגון כיצד ניתן לנטר מיקוד משופר של סרטן והפצה של ננו-טיפולים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא ניתנת לשחזור, יעילה והרבה יותר קלה להשגה בהשוואה ליצירת הנדסה גנטית.
ידגימו את הנהלים מישל נגוין ואיוואן רואיז, עוזרי מחקר מהמעבדה שלנו. התחל פרוטוקול זה בייצור וטיהור ננו חלקיקים של נגיף הפטיטיס E כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לדלל את דגימות הננו-חלקיקים HEV בין 0.5 לשני מיליגרם למיליליטר עם MES של 10 מילי-מולרי, pH 6.2 להדמיית TEM.
יינן את הרשתות המצופות פחמן עם פריקה זוהרת של 40 מיליאמפר למשך 30 שניות כדי לייצר משטח פחמן הידרופילי. משטח הפחמן ההידרופילי של הרשתות יכול להחזיק מעמד רק 30 דקות לאחר טיפול בפריקת זוהר. לאחר היינון, החזיקו את הרשת והפינצטה והוסיפו שני מיקרוליטרים של דגימת ננו-חלקיקי HEV לרשת.
לאחר 15 עד 30 שניות, כתם את הרשת בנייר פילטר. לאחר מכן יש לשטוף מיד את הרשת במים מזוקקים כפולים ולמחוק שוב בנייר פילטר. הוסף מיד שני מיקרוליטר של שני אחוז אורניל אצטט לרשת.
לאחר 15 שניות, כתם את הרשת בנייר פילטר. יבש את רשתות הדגימה על ידי הכנסתן לארון יבש של מסיר לחות אלקטרוני למשך הלילה. בהתאם לדגימה, מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני או cryo-EM עשויים להיות נחוצים להדמיה ואפיון של מבנה.
העבר את הרשת ל-TEM ותמונה בהגדלה של 10 עד 80 K. ננו-חלקיקי HEV מופיעים ב-TEM כחלבונים איקוסהדרליים ריקים בקוטר של כ-27 ננומטר עקב היעדר RNA נגיפי. כדי לבצע צימוד חד-שלבי של ננו-חלקיקי HEV וביוטין המקושר למלימיד, יש למרוח תחילה את ננו-חלקיקי HEV על יחידות מיני דיאליזה.
דיאליזה של הננו-חלקיקים כנגד pH 0.01 PBS מולרי 7.4 בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת על פי פרוטוקול היצרן. לאחר הדיאליזה מעבירים את ננו-חלקיקי ה-HEV לצינורות של 1.5 מיליליטר ומודדים את ריכוז החלבון ב-280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. מערבבים את הננו-חלקיקים במיליגרם אחד למיליליטר עם כמות שווה של 100 מיקרו-מולרי מלימיד ביוטין ו-0.01 PBS מולרי pH 7.4 כדי ליצור יחס של 1 עד 5 מולריות.
לאחר תגובה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס, הסר ביוטין מלימיד לא קשור בהליך עמוד התפלה ספין על פי פרוטוקול היצרן. נתח את הדגימות באמצעות דף SDS להפחתת תקן באמצעות הנהלים הסטנדרטיים, הכינו כתם מערבי כימילומינסנט באמצעות סטרפטווידין המקושר ל-HRP ולכידת האות הכימילומינסנט על ידי סרט רנטגן.
כדי לבצע צימוד דו-שלבי של הליגנד הספציפי לתא סרטן השד, LXY30, על פני השטח של ציסטאין חשוף על ננו-חלקיקי HEV, יש למרוח תחילה את הננו-חלקיקים על יחידות מיני דיאליזה ולבצע דיאליזה כנגד 0.01 PBS pH 7.4 מולרי בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר מכן העבירו את ננו-חלקיקי ה-HEV לצינורות של 1.5 מיליליטר ומדדו את ריכוז החלבון ב-280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. לאחר מכן, שלבו 650 מיקרו-מולרי מלימיד אזיד ו-650 מיקרו-מולרי אלקין LXY30 עם 200 מיקרו-מולרי נחושת גופרתית וחומצה אסקורבית מילי-מולרית אחת.
זה יוצר LXY 30 המקושר למלימיד ב-650 מיקרו-מולר. דוגרים על התערובת בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, ערבבו את ננו-חלקיקי ה-HEV למיליגרם אחד למיליליטר עם נפח של כ-10% של LXY 30 המקושר למלימיד כדי ליצור יחס של 1 עד 3 מולריות.
הגיבו במהלך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. בשל הריכוז הגבוה יחסית של מלימיד LXY 30, הריכוזים הסופיים של המגיבים כגון נחושת גופרתית מופחתים כ-10 פעמים לאחר הערבוב. כדי למנוע את נזקם לננו-חלקיקי נגיף הפטיטיס E, אפשרות נוספת היא שיטת התרומה ללא נחושת.
הסר את הקליק הלא מאוגד של maleimide LXY 30 עם עמודת התפלה ספין בהתאם לפרוטוקול היצרן. שמור על ננו-חלקיקי HEV המקושרים ל-LXY 30 בארבע מעלות צלזיוס. כדי לבצע צימוד חד-שלבי של ננו-חלקיקי LXY 30 HEV ותג פלואורסצנטי Cy5.5, יש לערבב תחילה את הננו-חלקיקים המקושרים ל-LXY 30 למיליגרם אחד למיליליטר עם נפח שווה של תג פלואורסצנטי Cy5.5 כדי ליצור יחס של 1 עד 5 טוחנות.
לאחר תגובת התערובת למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס, הסר את ה-Cy5.5 NHS הלא קשור בהליך עמוד התפלה ספין בהתאם לפרוטוקול היצרן. שמור על ננו-חלקיקי HEV המקושרים ל-LXY 30 Cy5.5 בארבע מעלות צלזיוס. נוסו שתי שיטות לפונקציונליזציה של LXY 30 של ננו-חלקיקי HEV למיקוד תאי גידול.
כאשר ננו-חלקיקי HEV 573C נקשרו תחילה למלימיד אזיד, ואחריו תגובה כימית קליק לאלקין LXY 30, נראה כי ננו-חלקיקי HEV 573C מתפרקים תחת תצפית TEM. עם זאת, תגובת כימיה ראשונית בקליק בין אלקין LXY 30 ואזיד מלימיד ליצירת LXY 30 המקושר למאלימיד ואחריה צימוד כדי לסייע לננו-חלקיקי HEV מותאמים לא השפיעה על מבנהו וננו-חלקיקי HEV 573C נותרו שלמים. ננו-חלקיקי HEV הקשורים ל-LXY 30 ו-Cy5.5 יושמו על תאי סרטן שד מתורבתים ונצפו במיקרוסקופיה קונפוקלית.
תמונות הקרינה הקרובה לאינפרא אדום על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית מצביעות על כך שננו-חלקיקי HEV המקושרים ל-LXY 30 Cy5.5 היו בעלי זיקה גבוהה יותר להפנמה מוגברת בתאי סרטן השד MDA MB 231 בהשוואה לננו-חלקיקי HEV המקושרים ל-Cy5.5. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על בחינת מיקוד רב-מודאלי ומולקולות טיפוליות המאפשרות מיקוד ואבחון מדויק של הגידול מבלי לגרום נזק לתאים נורמליים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי סרטן ומיקוד גידול באמצעות אפנון משטח כימי, ניתן ליישם אותה לאבחון מוקדם של סרטן, הקרנה וטיפול מונחה הדמיה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מחקר זה מציג את ההנדסה של חלבון הקפסיד של נגיף הפטיטיס E לננו-חלקיק טיפול-אבחון (HEVNP) לטיפול ממוקד בגידולים. ה-HEVNP שונו כדי לשפר את המיקוד בגידולים באמצעות חיבור של ליגנדים סינתטיים.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- רפואה ננו
- טיפול-אבחון
- אונקולוגיה
רקע
- HEVNP יוצרים מבנים יציבים בעצמם.
- שינוי ננו-חלקיקים יכול לשפר את יכולות המיקוד.
- הבנת חלוקת הטיפולים חיונית בטיפול בסרטן.
- גישה זו יעילה יותר בהשוואה לשיטות הנדסה גנטית מסורתיות.
מטרת המחקר
- לפתח שיטה עקבית לפונקציונליזציה של HEVNP.
- לשפר את המיקוד של תאי סרטן באמצעות ליגנדים סינתטיים.
- להקל על האבחון והטיפול בגידולים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ייצור וטיהור של ננו-חלקיקים HEV.
- דילול של דגימות HEVNP לצורך הדמיה.
- חיבור של ליגנדים לשיירי ציסטאין החשופים על פני השטח.
- שימוש במיקרוסקופ אלקטרונים לטרנסמיסיה (TEM) לניתוח.
תוצאות עיקריות
- ניתן לשנות את HEVNP ביעילות לצורך מיקוד בגידולים.
- שיטת החיבור היא שיחזורית ויעילה.
- הוכחה למיקוד משופר של תאי סרטן.
- הודגשו יישומים פוטנציאליים באבחון וטיפול.
מסקנות
- HEVNP מייצגים פלטפורמה מבטיחה לטיפול בסרטן.
- שינוי השטח מאפשר אספקה ממוקדת של חומרים טיפוליים.
- שיטה זו עלולה לקדם את תחום הרפואה הננו.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Chemical surface functionalization of virus-like particles enables modular and reproducible conjugation of targeting ligands and imaging agents without genetic modification, supporting rapid prototyping of theranostic nanocarriers. This approach enhances predictive confidence in target validation by allowing systematic screening of diverse biomolecules on a stable nanoparticle scaffold. The method addresses a key discovery-stage challenge: achieving consistent, scalable display of functional entities for downstream oncology applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through precise display of tumor-targeting ligands like LXY30 on HEV nanoparticles.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for evaluating ligand-receptor interactions using cysteine-directed conjugation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by allowing rapid comparison of ligand affinity and internalization efficiency in cancer cell models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable nanoconjugates with defined ligand density for standardized binding and uptake assays.
- Operational Value: Enables batch-to-batch consistency in nanoparticle functionalization, critical for assay reproducibility.
- Scalability: Supports preparation of validated biological systems for high-throughput screening of targeting moieties.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Produces tumor-targeted HEVNPs (LXY30-HEVNP-Cy5.5) validated in breast cancer cell models, supporting progression to preclinical studies.
- Mechanistic De-risking: Demonstrates that pre-forming maleimide-linked LXY30 via click chemistry preserves nanoparticle integrity, reducing structural failure risk.
- Disease-Relevant System: Uses MDA-MB-231 cells to assess internalization and binding affinity, aligning with therapeutic relevance in triple-negative breast cancer.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, enabling preparation of functionalized nanocarriers for preclinical evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by allowing modular conjugation of immunogenic, therapeutic, and diagnostic molecules to HEV nanoparticles.
- Screening: Delivers assay-ready nanoparticles with reproducible surface modification for quantitative evaluation of targeting efficiency.
- Analytics: Generates measurable outputs via TEM, Western blot, and confocal microscopy to compare conjugation success and cellular uptake.
- Translational Research: Links discovery to preclinical continuity through demonstration of tumor-specific binding and internalization in cultured cancer cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable conjugation platform applicable to other macromolecular complexes with known structures.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence through precise, cysteine-specific ligand display without altering nanoparticle assembly.
- Operational Value: Offers high reproducibility and efficiency compared to genetic engineering, reducing batch variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling rapid screening of ligands and imaging tags on a stable nanocarrier.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted advancement by generating theranostic candidates with validated tumor targeting and imaging capabilities.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein chemistry, conjugation techniques, and nanoparticle purification.
- Depends on access to dialysis units, spectrophotometry, SDS-PAGE, Western blotting, and confocal microscopy.
- Necessitates standardization across teams for consistent protein concentration measurement and reaction conditions.
- Involves adaptation considerations when applying the method to other nanoparticle systems with different surface-exposed residues.
- Includes practical limitations such as nanoparticle disassembly if conjugation order is not optimized, as seen with premature maleimide azide binding.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:50
HEVNP Characterization
2:46
Chemical Conjugation of HEVNPs with Biotin, Cancer Targeting Ligand, and Fluorophores
7:05
Results: Production of LXY30-HEVNPs and Binding/Internalization of Fluorescently Labeled LXY30-HEVNPs in MDA-MB-231 Breast Cancer Cells
8:35
Conclusion
