שיטת Refolding יעילה וטיהור של ליגנד Chemoreceptor מחייב תחום

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחדש תחום קשירה של ליגנד קולטן כימי מגופי הכללה ולטהר אותו לשימוש במחקרים מבניים ופונקציונליים. כדי לקבוע אילו אותות שולח קולטן כימי חיידקי וכיצד, ניתן להשתמש בתחומי קשירת הליגנד המבודדים כדי לסנן מול ספריות מולקולות קטנות או לקבוע את המבנה עם ובלי ליגנד. לחץ של תחום קשירת ליגנד חוץ-תאי ב-E.coli מביא לעתים קרובות לתצהיר בגופי הכללה.

כאן, אנו מראים כיצד ניתן לשחזר כמות מיליגרם של חלבון פונקציונלי מגופי ההכללה. כדי להתחיל, יש לחסן 150 מ"ל של מרק LB סטרילי המכיל 50 מיקרוגרם למ"ל אמפיצילין עם תאי BL21-CodonPlus RIPL שעברו טרנספורמציה עם וקטור pET151 D-TOPO לביטוי של hexahistidine TIp3-LBD. דגרו על התרבית ב-200 סל"ד ו-37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

הכינו שש צלוחיות ארלנמאייר 2 ליטר המכילות 800 מ"ל מרק LB סטרילי ו -50 מיקרוגרם למ"ל אמפיצילין. יש לחסן כל בקבוק ב-20 מ"ל של תרבית הלילה. דגרו את הצלוחיות ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול מתמשך ב-200 סל"ד עד שה-OD600 מגיע ל-0.6.

בשלב זה, השראת ביטוי חלבון על ידי הוספת 1 מילי-מולרי IPTG לכל בקבוק. המשיכו לדגור את הצלוחיות ב-37 מעלות צלזיוס בשייקר ב-200 סל"ד למשך ארבע שעות נוספות. קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 5000 xg וארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

לאחר מכן, השליכו את הסופרנטנט. העבירו את כל כדורי התא לכוס של 250 מ"ל והוסיפו 100 מ"ל של Buffer A.אם קפואים, אפשרו לתאים להפשיר לחלוטין ולאחר מכן השעו מחדש את הגלולה. שמור את הדגימה על קרח אלא אם כן צוין אחרת.

לאחר מכן, העבירו את התאים המורחפים דרך הומוגנייזר בלחץ גבוה שלוש פעמים כדי ליזק את התאים ולהבטיח גזירה מלאה של ה-DNA הגנומי. לאחר מכן, צנטריפוגה את הליזאט ב -10, 000 xg וארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. אסוף דגימה של מ"ל אחד של הסופרנטנט ואחסן אותה במינוס 20 מעלות צלזיוס לניתוח SDS-PAGE לאחר מכן.

לאחר מכן, השליכו את שארית הסופרנטנט והניחו את הכדור על קרח. לאחר מכן, השעו ביסודיות את כדור גופי ההכללה ב-20 מ"ל של מאגר קר כקרח.זה מקל על המסה של הממברנה וחלבוני הממברנה. מערבל את הדגימה למשך דקה עד שתיים כדי לסייע בהשעיה.

לאחר צנטריפוגה של הדגימה, השעו שוב את הגלולה ביסודיות ב-20 מ"ל של מאגר B קר כקרח על ידי סיבוב הצינור למשך דקה עד שתיים. ודא שהגלולה נשברת לחתיכות קטנות. לאחר מכן, פיפטה את הדגימה למעלה ולמטה כדי להשעות אותה מחדש.

צנטריפוגה את הדגימה כמו קודם והשליכו את הסופרנטנט. אם הסופרנטנט עכור או צבעוני, צנטריפוגה שוב את הדגימה והשתמש במאגר קר קר נוסף B כדי להשעות אותה מחדש. חזור על הצנטריפוגה וההשעיה מחדש עד שהסופרנטנט צלול וחסר צבע לפני הגלולה שוב.

הוסף 20 מ"ל של Buffer C קר כקרח לגלולה והשהה אותו מחדש על ידי מערבולת הצינור למשך דקה עד שתיים. לאחר מכן, לאחר סיבוב הדגימה, הוסף 25 מ"ל של מאגר דנטורציה קר כקרח D.השהה ביסודיות את גלולת גופי ההכללה על ידי מערבולת הצינור למשך דקה עד שתיים או עד שהכדור נשבר לחתיכות קטנות. מערבבים את המתלים על ידי סיבוב צירי ב -30 סל"ד ו -4 מעלות צלזיוס למשך 30 עד 120 דקות.

הבהירו את תמיסת החלבון המפורקת על ידי צנטריפוגה ב 30, 000 xg וארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, הניחו את הסופרנטנט על קרח והשליכו את הגלולה. תוך כדי ערבוב של 250 מ"ל של Buffer E ב-500 סל"ד, הוסיפו 60 מיליגרם של תערובת חלבונים מפורקת, המכילה hexahistadine TIp3-LBD.

דגרו את תערובת הקיפול מחדש בארבע מעלות צלזיוס תוך ערבוב מתמשך ב-500 סל"ד למשך 24 עד 48 שעות. ריכוז החלבון הסופי הוא 0.2 מ"ג למ"ל. לאחר הכנת שבעה ליטר של מאגר A מקורר מראש וצינורות דיאליזה על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש בסגירת צינורות הדיאליזה כדי להדק קצה אחד של קרום הדיאליזה ולהעביר את תערובת הדיאליזה לתוך הצינור.

לאחר מכן, מהדק את הקצה הפתוח וודא שאין נזילות. הנח את צינור הדיאליזה בדלי דיאליזה עם המאגר A.לאחר מכן, הוסף מוט ערבוב מגנטי, וודא שהוא לא ייגע בצינור הדיאליזה בזמן ערבוב. דיאליזה של הדגימה בארבע מעלות צלזיוס תוך ערבוב מתמשך ב-500 סל"ד והחלף את המאגר לפחות ארבע פעמים במשך תקופה של 12 שעות.

לאחר החלפת המאגר האחרונה, השאירו את הדגימה לדיאליזה למשך הלילה. למחרת בבוקר, הוציאו את צינור הדיאליזה מהדלי והעבירו את תכולתו לכוס של 500 מ"ל. שמור את תמיסת החלבון על קרח אלא אם כן צוין אחרת.

סנן את תמיסת החלבון דרך ממברנה בגודל נקבוביות של 0.43 מיקרון לבקבוק זכוכית של 500 מ"ל כדי להסיר כל חלבון משקע. לאחר שטיפה, טעינה ואיזון של עמודת כלאט בהתאם לפרוטוקול הטקסט, התאם את דגימת החלבון המקופלת מחדש שהתקבלה להרכב של Buffer F על ידי הוספת 25 מ"ל של 5 M נתרן כלורי, 2.5 מ"ל של 1 M tris-HCl, pH 8.0 ו-2.5 מ"ל של 2 M תמיסות מלאי אימידזול. טען את הדגימה על העמודה בקצב של 5 מ"ל לדקה או פחות והשליך את הזרימה המכילה את החלבונים הלא קשורים.

לאחר מכן, שטפו את העמודה עם 50 עד 100 מ"ל של מאגר F כדי להסיר חלבונים שאינם קשורים במיוחד ולהשליך את הזרימה. הסר את ה-hexahistadine TIp3-LBD עם 25 מ"ל של Buffer G.לאחר מכן, אסוף את שברי הזרימה המכילים את החלבון. לאחר הכנת Buffer H וצינורות דיאליזה על פי פרוטוקול הטקסט, הוסף פרוטאז TEV מתויג hexahistadine לחלבון המתויג hexahistadine בצינור.

הוסף יחס מולרי סופי של TEV אחד לשמונה של חלבון. הנח את צינור הדיאליזה המהודק לתוך ארבעת ה-L המקוררים מראש של Buffer H ודגר אותו בארבע מעלות צלזיוס תוך ערבוב מתמשך במשך שעתיים. לאחר מכן, החלף את המאגר והמשך בדיאליזה למשך הלילה כדי לאפשר לתגובת המחשוף בתיווך TEV להסתיים.

לאחר החלפה ל-Buffer I, סינון תמיסת החלבון והתאמת הדגימה שוב, טען את הדגימה על עמודת HP מוכנה של חמישה מ"ל HiTrap. בקצב זרימה של חמישה מ"ל לדקה, אסוף את הזרימה המכילה את ה-TIp3-LBD הלא מתויג. על חלבון שסוע, תג ה-hexahistadine השסוע וה-hexahistadine TEV נשמרים על ידי העמודה.

השתמש בחמישה מ"ל של Buffer F כדי לשטוף את העמודה כדי לאפשר לחלבון הלא מתויג לזרום ולאסוף את הפליטה. לאחר מכן, לאחר איזון עמודת אי הכללת גודל וריכוז והבהרת דגימת החלבון בהתאם לפרוטוקול הטקסט, טען את הדגימה על עמודת סינון הג'ל 26/60 המאוזנת מראש. יש למרוח את Buffer A בקצב זרימה של ארבעה מ"ל לדקה ולעקוב אחר עקבות ה-UV לפליטת חלבון.

TIp3-LBD נפלט בנפח שמירה של 210 עד 220 מ"ל. לבסוף, לאחר כרומטוגרפיה, אסוף את השברים ואז מודד את ריכוז החלבון ובצע SDS-PAGE. הליך בידוד החלבון שהודגם בסרטון זה הניב 10 עד 20 מ"ג של TIp3-LBD טהור ולא מתויג לכל ליטר אחד של תרבית חיידקים.

כפי שניתן לראות כאן, לחלבון שנפלט מעמודת סינון הג'ל יש שיא יחיד וסימטרי, התואם לנפח שמירה של 220 מ"ל עם משקל מולקולרי מחושב של 29 kDa. כפי שמוצג כאן על ידי SDS-PAGE, גופי הכללה הכילו בעיקר hexahistadine TIp3-LBD עם משקל מולקולרי לכאורה של 28 kDa, שהוא קרוב לערך המחושב מרצף חומצות האמינו של 31.8 kDa. הסרת תג המשושה, כרומטוגרפיה של זיקה ושלבי סינון ג'ל הניבו חלבון טהור ביותר.

ספקטרוסקופיה CD באמצעות CDSSTR גילתה כי המבנה המשני של hexahistidine TIp3-LBD מורכב מ-31% אלפא-סליל ו-23% תוכן גיליון בטא. אלה היו גם קרובים לערכים החזויים של 37% ו-26% בהתאמה מניתוח רצף באמצעות שרת JPred 3. פרוטוקול זה דורש מינימום חמישה ימים מתחילתו ועד סופו, וניתן להשהות אותו במידת הצורך בשלושה שלבים שונים.

כאשר מנסים הליך זה, חשוב לזכור כי השעיה יסודית ומלאה של גופי ההכללה במאגר הדנטורינג על ידי מערבולת או פיפטינג למעלה ולמטה היא קריטית לכל המימוש הזה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לחדש ולטהר את תחום קשירת הליגנד של הקולטן הכימי TIp3. החלבון המטוהר יכול לשמש לקשירת חומצות כדי לחקור את הספציפיות של הליגנד לקולטן זה.

בנוסף, הראינו בעבר כי החלבון המתקבל בהליך זה יכול לשמש לייצור גבישים מסודרים מאוד, וזה סלל את הדרך למחקרי הבסיס המבני לספציפיות הליגנד שלו. הליך זה עשוי להיות שימושי בדרך כלל לייצור כמויות מ"ג של קולטנים כימיים מחיידקים אחרים בצורה מגובשת ומסיסה. השתמשנו בפרוטוקול זה בצורתו המקורית או בצורתו השונה מעט כדי לחדש ולטהר את תחום קשירת הליגנד של קולטנים כימיים אחרים מסוג זה למחקרים קריסטלוגרפיים.

אנא זכור כי בכל מקרה נפרד, אופטימיזציה של הפרוטוקול, למשל, סביר להניח שיהיה צורך בהרכב המאגרים והקיפול מחדש וזמני הדגירה.