נוהל מקיף כדי להעריך את ביצועי במבחנה כורוידאלית Hemangioblastoma בשם משתמש את ספרואיד הלבלוב Assay

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להעריך את הביצועים של הניאו-וסקולריזציה המשוערת של המנגיובלסטומה באמצעות בדיקת הנבטת הספרואידים במבחנה. השיטה יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האנגיוגני, כגון אנגיוגנזה של גידולים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא תוצר של הליך מקיף להערכה במבחנה היכן אנגיוגנזה הגידולית הקלאסית קיימת בהמנגיובלסטומה והיא גדלה בהמנגיובלסטומה.

ההשלכה של טכניקה זו משתרעת על טיפול בהמנגיובלסטמור וכלי דם מכיוון שהתוצאה מדגישה את המורכבות של המנגיובלסטמור ניאו-וסקולריזציה, וזה מצביע על כך שצורה נפוצה זו של אנגיוגנזה היא רק מנגנון משלים. כך ששיטה זו יכולה לספק תובנה לחקר המנגיובלסטמור ניאו-וסקולריזציה. ניתן ליישם אותו גם על גידולים, אנגיוגנזה ויישומים הקשורים לכלי דם בגידול מוצק כלשהו, כגון חיקוי כלי דם של גידול בגידול זכוכית.

הדגמה אמיתית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את הדור של צעד ספרואיד תאי אנדותל מניפולטיביים אלה. כי התנאי המתאים חשוב. ראשית, תרבית תאי האנדותל HUVEC במדיום תרבית DMEM בתוספת עשרה אחוז סרום בקר עוברי, פניצילין וסטרפטומיצין.

לאחר מכן, שמרו על התרבית בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם חמישה אחוזי פחמן דו חמצני. לאחר מכן, כדי לסנתז את שבר ה-shRNA, עכל את הפלסמיד עם אנזימי הגבלה ApaI ו-EcoRI. לאחר מכן לפלסמיד המעוכל, הוסף גם את האוליגו קדימה וגם אחורה, מאגר NEB פי 10 ומים מזוקקים כפול לנפח סופי של 50 מיקרוליטר.

לאחר הוספת כל הריאגנטים, מחממים את התערובת בחום של 98 מעלות צלזיוס למשך ארבע דקות. לאחר מכן, התקררו בהדרגה לטמפרטורת החדר בטווח של מספר שעות. השתמש ב-T4 ligase כדי לקשור את האוליגו המחוסם ואת הפלסמיד.

דגרו את הצינור בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, הוסף חמישה מיקרוליטרים של תערובת קשירה ל-25 מיקרוליטר של תאים מוכשרים DH5alpha. ב-500 מיקרוליטר של מדיום DMEM, הוסף את הווקטור הלנטי-ויראלי או את הווקטור המקושקש, יחד עם פלסמידים אחרים של אריזה.

לאחר מכן, דגרו על התערובת הלנטי-ויראלית למשך 25 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, הוסף 7 מיליליטר של מדיום ה- DMEM לתמיסה המעורבת המקושקשת או הלנטיויראלית. תרבית תאי 293FT במדיום DMEM ללא סרום בקר עוברי בצלחת תרבית של 10 סנטימטרים.

הוסף מיליליטר אחד של התמיסה הלנטי-ויראלית או המקושקשת לתאי 293FT בצלחת התרבית. לאחר שש שעות, שאפו את המדיום הישן ממנת התרבות. לאחר מכן, החלף את המדיום הישן במדיום DMEM טרי המכיל 10 אחוז סרום בקר עוברי.

לאחר 48 שעות, אוספים את המדיום. העבירו את תאי האנדותל של HUVEC בתווך הלנטי-ויראלי ושמרו למשך 72 שעות. לאחר מכן, הוסף שני מיקרוגרם למיליליטר פורומיצין למדיום תרבית התאים HUVEC.

לבסוף, דגרו על התרבות למשך 24 שעות נוספות. למחרת, הוסף מיליליטר אחד של טריפסין EDTA כדי לטריפסין תאי HUVEC. לאחר מכן השעו מחדש את תרחיף התאים הטריפסיני במדיום DMEM עם סרום בקר עוברי של 10 אחוז

ספור את מספר התאים באמצעות מונה תאים. לאחר הספירה, זרעו את התאים בצלחת תלת מימדית תחתונה עגולה של 96 בארות. לאחר הזריעה יש לדגור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם חמישה אחוזי פחמן דו חמצני למשך 72 שעות ברציפות.

לאחר 36 שעות, החלף מחצית ממדיום התרבות במדיום טרי. ראשית, יש להפשיר את תמיסת הג'ל בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לדלל אותה ביחס של אחת לחמש עם מדיום הסרום המופחת. מוצצים את הספרואידים ממדיום ה- DMEM באמצעות מיקרופיפטה.

לאחר מכן, שטפו את הספרואידים עם חמישה מיליליטר של מדיום סרום מופחת. העבירו בזהירות את הכדורים התלויים ואת הג'ל המדולל. בצלחת של 15 בארות, הטמיעו 300 מיקרוליטרים של הנוזל המעורב של ספרואידים וג'ל מדולל.

דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים פחמן דו חמצני למשך שעה. לאחר מכן, הוסף 400 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת לבאר אחת. כדי למנוע אידוי, מלאו את סביבת הבאר במים סטריליים.

לאחר מכן, תרבית התאים ב-37 מעלות צלזיוס, חמישה אחוז פחמן דו חמצני ו-100 אחוז לחות למשך שעה. לאחר הדגירה יש לשאוב את המדיום הישן ולהוסיף 600 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת עם אחוז אחד של תוסף צמיחת תאי אנדותל לבאר ולדגור למשך יום. צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך.

כאן, הנבטה ספרואידית של התאים נלכדת באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך כדי לחקור את ההשפעה של השתקת גן VHL על הפוטנציאל האנגיוגני של תאי האנדותל. נראה כי ספרואיד נובט 12 שעות לאחר הטיפול הלנטי-ויראלי הן בתאי הביקורת והן בתאי האנדותל המושתקים של VHL. לאחר מכן, מבוצע ניתוח סטטיסטי כדי לכמת את אורך הנבטים שנוצרו על ידי הספרואידים המושתקים של הגן VHL.

נראה שאורך הנבט הממוצע הוא כ-125 מיקרומטר בקבוצות המושתקות של VHL בעוד שהוא רק כ-65 מיקרומטר בקבוצת הביקורת. אורך הנבט המצטבר הממוצע של קבוצת ה-VHL המושתקת הוא כ-1250 מיקרומטר בעוד של קבוצת הביקורת הוא 680 מיקרומטר. תוצאות אלו מצביעות על עלייה של פי שניים באורך הנבט בקבוצות המושתקות של VHL.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 48 שעות אם היא מבוצעת כראוי. ביצוע הליך ושיטה זו כמו בדיקת היווצרות נימים ניתן לבצע על מנת לענות על שאלות נוספות. כמו לחקור את היכולת האנגיוגנית של תאי אנדותל כלי דם.

לאחר התפתחות זו, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האנגיוגנזה לחקור את כלי הדם הפנימיים של הגידול. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב אילו גנים מאבדים פונקציה בתאי אנדותל שעברו מניפולציה המשמשים לבדיקת פיצוץ.