Name: נוהל מקיף כדי להעריך את ביצועי במבחנה כורוידאלית Hemangioblastoma בשם משתמש את ספרואיד הלבלוב Assay (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-12T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: חקור מנגנוני ניאווסקולריזציה בהמנגיובלסטומה באמצעות מבחן נביטת ספרואידים במבחנה. השיטה מאפשרת הערכת אנגיוגנזה קלאסית ומסייעת בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים שנגחאי ועדת המדע והטכנולוגיה (15411951800, 15410723200). המחברים רוצים להודות פרופסור של YuMei וון וז'או צ'או פרופסור באוניברסיטת פתוגניים מיקרואורגניזם המחלקה של פודאן לסיוע טכני שלהם.

שיטה זו בוצעה בהתאם הנחיות שאושרו והתקנות של מחקר אתיקה הוועדה של Huashan חולים, אוניברסיטת פודאן (fudan). אמצעי בטיחות סטנדרטית המתאימה עקבו כל צעד. עבור מצגת סכמטית, נא עיין באיור 1.
1. תא תרבות ובבניית פלסמיד
<ol><li>באופן שגרתי לשמור על התא אנדותל יפתור (HUVEC) ב Dulbecco המתואמת של בינוני הנשר (DMEM) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), יחידה/mL 100 של פניצילין, µg/mL 100 של סטרפטומיצין % 5 humidified CO2 מגשים ב 37 º C.</li>
	<li>תקציר PLKO.1 פלסמיד עם ApaI, EcoRI לסינתזה של פרגמנט shRNA. ודא כי הרצף oligonucleotide של וקטור shRNA אייצ '-אל CCGGGATCTGGAAGACCACCCAAATCTCGAGA TTTGGGTGGTCTTCCAGATCTTTTTG14.</li>
	<li>לאחר מכן, מערבבים 20 מערכת µΜ עם µL 5 קדימה oligo, 5 µL של oligo הפוכה, 5 µL של 10 x מאגר נב ו 35 µL של ddH2O יחד (לנפח הכללי הוא 50 µL). מחממים את התערובת ב 98 ° C 4 דקות, לאט מגניב עד לטמפרטורת החדר בעוד כמה שעות.</li>
	<li>מאתרים ומפסיקים את annealed oligos ואת פלסמיד PLKO.1 יחד עם T4 ליגאז ב 4 ° C נלון. 16 h מאוחר יותר, הוסף 5 µL של מצדו מיקס 25 µL תאים DH5α המוסמכת. לאחר מכן, מסך של פלסמידים מחוברים בהצלחה ולאחר לאמת השבר שנוסף על-ידי רצף.</li>
</ol>2. lentivirus החבילה ואת זיהום
<ol><li>בסך הכל, מערבבים µg 10 של וקטור PLKO.1-shVHL או PLKO.1-shScramble, µg 7.5 של אריזת פלסמיד psPAX2 ו- 2.5 µg של המעטפה pMD2.G פלסמיד ב 500 µL של התקשורת DMEM ללא סרום שור עוברית (FBS) במשך 25 דקות.</li>
	<li>להוסיף mLDMEM 7 ללא FBS הפתרון המוכן מעל.</li>
	<li>התרבות התאים מטרים 293 DMEM ללא FBS במנות תרביות רקמה 10 ס מ קוטר. ודא מספר התאים מטרים 293 1 x 107 באמצעות מונה התא.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של הפתרון המוכן מעל למדיום של תאים מטרים 293 על תרביות תאים. הערה: שורת התאים מטרים 293 נגזר מן הקו תא 293F ולבטא stably גדול SV40 T אנטיגן. לכן, זה פונדקאי מתאים לייצור lentiviral.</li>
	<li>להחליף את המדיום התרבות DMEM המכיל 10% FBS לאחר 6 שעות.</li>
	<li>לאסוף את המדיה באמצעות פיפטה ב- 48 שעות לאחר תרביות תאים. הערה: הוירוס קיים DMEM המכיל 10% FBS. התאים המתים לצוף על בינוני. להשתמש ממברנה סטרילי מיקרומטר 0.45 לסינון של תאים מתים וזוהמה. באופן כללי, יש צורך לבדוק את הריבוי של זיהום (MOI). זה כדי לייסד. תאים יציב. בשלב האחרון, כל התאים החיים ללא זיהום מוצלחת תמות עד puromycin. ShScramble קבוצה של תאים HUVEC הם קבוצת הביקורת. ודא כי כל התאים HUVEC למות עם ריכוז puromycin בשימוש על ידי 72 h. כל טוב יש את אותו מספר של תאים.</li>
	<li>התרבות התאים HUVEC בתקשורת lentiviral עבור 72 h. לאחר מכן, להוסיף puromycin התקשורת של תאי HUVEC-ריכוז של µg/mL 2 עבור ה 24 תאים לשימוש HUVEC ללא כל טיפול כחלק מקבוצת הביקורת. ודא כי כל לשלוט תאים מתים בזמן הזה. הערה: התאים החיים מייצגים קו תא יציב של תאים תמונות ציפורים אייצ '-אל ותאים shSramble. צפיפות ציפוי היא 5000/טוב ב 96-ובכן צלחות.</li>
</ol>3. הדור של תאי אנדותל Spheroids
<ol><li>Trypsinize תאי HUVECs, resuspend בטווח הבינוני DMEM עם 10% FBS. עם מספר תאים לצלחת תרבות 10-ס מ, להוסיף 1 מ"ל של typsin-EDTA.</li>
	<li>זרע התאים בצלחת 96-ובכן למטה סיבוב תלת-ממד, ב צפיפות התאים של 1 × 103 תאים/טוב. השתמש גם להכיל ספרואיד של µL 0.50 להשעות את ספרואיד. ספירת תאים באמצעות מערכת מונה תא ההוראות של היצרן.</li>
	<li>דגירה התאים ב 37 ° C ו- 5% CO2 ברציפות במשך 72 h. בתנאים אלה, ודא כי התאים מושעה טופס על spheroids תא באופן אוטומטי. להחליף חצי של המדיום תרבות לאחר 36 שעות.</li>
</ol>4. במבחנה Assay אנגיוגנזה
<ol><li>להפשיר את הפתרון ג'ל ב 4 ° C, לדלל את זה עם המדיום סרום מופחת ביחס דילול של 1:5.</li>
	<li>למצוץ את spheroids של המדיום התרבות DMEM עם micropipette. לאחר הרחצה spheroids עם 5 מ של מדיום מופחת סרום, להשעות את spheroids בעדינות ובזהירות הג'ל מדולל. ודא כי ישנם אין בועות אוויר.</li>
	<li>הטבע µL 300 של נוזל מעורב לתוך צלחת 15-. טוב. לאחר דגירה-37 ° C ו- 5% CO2 עבור 1 h, להוסיף 400 µL מדיום מופחת סרום מכל קידוח. למלא במים סטריליים סביב הבארות ליצירת סביבה humidified לעכב אידוי.</li>
	<li>לאחר מכן, תרבות הצלחת ב 37 ° C ב- 5% CO2 ב- 100% לחות לשעה.</li>
	<li>בזהירות תשאף המדיום הישן ולהחליף אותו על ידי 600 µL של מדיום מופחת סרום 1% תא אנדותל הצמיחה תוספי כל היטב.</li>
	<li>לאחר 12 שעות או 24 שעות ביממה, לקחת תמונות תחת מיקרוסקופ אור הפוך (40 *).</li>
</ol>5. ניתוח נתונים
<ol><li>להעלות את התמונות פלטפורמת ניתוח תמונה באינטרנט כדי לקבל נתוני אורך נבט (טבלה של חומרים).</li>
	<li>בדף האינטרנט, ליצור חשבון בדואר אלקטרוני.</li>
	<li>ואז להעלות את התמונות על ידי לחיצה על כפתור ההעלאה.</li>
	<li>להוריד את התוצאה על ידי לחיצה על לחצן הורד. הערה: התוכנה יפיק את התמונה המעובדת ואת הנתונים. הנתונים מכילים לחמישה חלקים: נבט המצטבר אורך, אורך נבט מרושע, סטיית התקן של נבט אורך, נבט אזור ואזור ספרואיד. בתמונה מעובד, כל פרמטר המותווה בצבע שונה כדי להקל על זיהוי בתמונה המעובדת: אדום מייצג נבטים שלד, צהוב מספר נבטים, כחול את מבנה נבט, וסוף לבן נבט, ספרואיד כתום.</li>
</ol>

<ol><li>Lonser, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0140673603136434">von Hippel-Lindau disease.</a> Lancet. 361 (9374), 2059-2067 (2003).</li>
<li>Hussein, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+capillary+haemangioblastoma%3A+the+pathologist%27s+viewpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">Central nervous system capillary haemangioblastoma: the pathologist's viewpoint.</a> Int J Exp Pathol. 88 (5), 311-324 (2007).</li>
<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemangioblastomas+might+derive+from+neoplastic+transformation+of+neural+stem+cells%2Fprogenitors+in+the+specific+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Hemangioblastomas might derive from neoplastic transformation of neural stem cells/progenitors in the specific niche.</a> Carcinogenesis. 32 (1), 102-109 (2011).</li>
<li>Zhuang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+derived+vasculogenesis+in+von+Hippel-Lindau+disease-associated+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Tumor derived vasculogenesis in von Hippel-Lindau disease-associated tumors.</a> Sci Rep. 4, 4102(2014).</li>
<li>Glasker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VHL-deficient+vasculogenesis+in+hemangioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">VHL-deficient vasculogenesis in hemangioblastoma.</a> Exp Mol Pathol. 96 (2), 162-167 (2014).</li>
<li>Wizigmann-Voos, S., Breier, G., Risau, W., Plate, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+vascular+endothelial+growth+factor+and+its+receptors+in+von+Hippel-Lindau+disease-associated+and+sporadic+hemangioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of vascular endothelial growth factor and its receptors in von Hippel-Lindau disease-associated and sporadic hemangioblastomas.</a> Cancer Res. 55 (6), 1358-1364 (1995).</li>
<li>Cancilla, P. A., Zimmerman, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+structure+of+a+cerebellar+hemangioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The fine structure of a cerebellar hemangioblastoma.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 24 (4), 621-628 (1965).</li>
<li>Kawamura, J., Garcia, J. H., Kamijyo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+hemangioblastoma%3A+histogenesis+of+stroma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Cerebellar hemangioblastoma: histogenesis of stroma cells.</a> Cancer. 31 (6), 1528-1540 (1973).</li>
<li>Jurco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemangioblastomas%3A+histogenesis+of+the+stromal+cell+studied+by+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hemangioblastomas: histogenesis of the stromal cell studied by immunocytochemistry.</a> Hum Pathol. 13 (1), 13-18 (1982).</li>
<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+tumorigenic+cells+and+implication+of+their+aberrant+differentiation+in+human+hemangioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of tumorigenic cells and implication of their aberrant differentiation in human hemangioblastomas.</a> Cancer Biol Ther. 12 (8), 727-736 (2011).</li>
<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD41+and+CD45+expression+marks+the+angioformative+initiation+of+neovascularisation+in+human+haemangioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Tumour+Biol%22%5BJournal%5D)">CD41 and CD45 expression marks the angioformative initiation of neovascularisation in human haemangioblastoma.</a> Tumour Biol. 37 (3), 3765-3774 (2016).</li>
<li>Sharifpanah, F., Sauer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Spheroid-Based+Sprout+Assay+in+Three-Dimensional+Fibrin+Scaffold%3A+A+Novel+In+Vitro+Model+for+the+Study+of+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Spheroid-Based Sprout Assay in Three-Dimensional Fibrin Scaffold: A Novel In Vitro Model for the Study of Angiogenesis.</a> Methods Mol Biol. 1430, 179-189 (2016).</li>
<li>Cai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNA+taurine+upregulated+1+enhances+tumor-induced+angiogenesis+through+inhibiting+microRNA-299+in+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNA taurine upregulated 1 enhances tumor-induced angiogenesis through inhibiting microRNA-299 in human glioblastoma.</a> Oncogene. 36 (3), 318-331 (2017).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Conveniently+Screening+pLKO.1-TRC+Vector+Tagged+with+TurboGFP%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Biochem+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Construction of Conveniently Screening pLKO.1-TRC Vector Tagged with TurboGFP.</a> Appl Biochem Biotechnol. 181 (2), 699-709 (2017).</li>
<li>Laib, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid-based+human+endothelial+cell+microvessel+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1202-1215 (2009).</li>
<li>D'Alessio, A., Moccia, F., Li, J. H., Micera, A., Kyriakides, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+and+Vasculogenesis+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis and Vasculogenesis in Health and Disease.</a> Biomed Res Int. 2015, 126582(2015).</li>
<li>Finkenzeller, G., Graner, S., Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Stark, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+in+vivo+vasculogenic+potential+of+endothelial+progenitor+cells+in+comparison+to+human+umbilical+vein+endothelial+cells+in+a+spheroid-based+implantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Impaired in vivo vasculogenic potential of endothelial progenitor cells in comparison to human umbilical vein endothelial cells in a spheroid-based implantation model.</a> Cell Prolif. 42 (4), 498-505 (2009).</li>
<li>Morin, K. T., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+angiogenesis+and+vasculogenesis+in+fibrin+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro models of angiogenesis and vasculogenesis in fibrin gel.</a> Exp Cell Res. 319 (16), 2409-2417 (2013).</li>
<li>Blacher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+invasion+in+the+spheroid+sprouting+assay%3A+a+spatial+organisation+analysis+adaptable+to+cell+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cell invasion in the spheroid sprouting assay: a spatial organisation analysis adaptable to cell behaviour.</a> PLoS One. 9 (5), 97019(2014).</li>
<li>Straume, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+heat+shock+protein+27+induces+long-term+dormancy+in+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Suppression of heat shock protein 27 induces long-term dormancy in human breast cancer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (22), 8699-8704 (2012).</li>
<li>Naumov, G. N., Akslen, L. A., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+angiogenesis+in+human+tumor+dormancy%3A+animal+models+of+the+angiogenic+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Role of angiogenesis in human tumor dormancy: animal models of the angiogenic switch.</a> Cell Cycle. 5 (16), 1779-1787 (2006).</li>
<li>Naumov, G. N., Folkman, J., Straume, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+dormancy+due+to+failure+of+angiogenesis%3A+role+of+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Tumor dormancy due to failure of angiogenesis: role of the microenvironment.</a> Clin Exp Metastasis. 26 (1), 51-60 (2009).</li>
<li>Wang, Y., Yang, J., Du, G., Ma, D., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+respond+to+cerebral+ischemia+without+susceptibility+to+HB-tumorigenesis+in+VHL+heterozygous+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects respond to cerebral ischemia without susceptibility to HB-tumorigenesis in VHL heterozygous knockout mice.</a> Mol Carcinog. 56 (10), 2342-2351 (2017).</li>
<li>Stratmann, R., Krieg, M., Haas, R., Plate, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+control+of+angiogenesis+in+hemangioblastomas+by+the+von+Hippel-Lindau+tumor+suppressor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Putative control of angiogenesis in hemangioblastomas by the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 56 (11), 1242-1252 (1997).</li>
<li>Correa de Sampaio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heterogeneous+in+vitro+three+dimensional+model+of+tumour-stroma+interactions+regulating+sprouting+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis.</a> PLoS One. 7 (2), 30753(2012).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

לאחרונה, מספר תחומי מחקר לביולוגיה היו מגורה על ידי המחקר של אנדותל האנגיוגנזה15. במאמר זה, פיתחנו ספרואיד אנדותל של לבלוב טכניקה כמודל ניסויי ללמוד היווצרות כלי שמקורו ג'ין אייצ '-אל אובדן התפקוד בתאי האנדותל מניפולציות כדי לזהות מולקולות המועמד הרומן של אשד אנגיוגנזה. למיטב ידיעתנו, זה הדו ח הראשון לבחון את ההשפעות אנגיוגנזה של תאי אנדותל ששונה endogenic.
כורוידאלית רקמה (כולל גידול רקמות) היא תהליך מורכב המתרחשת באמצעות האנגיוגנזה, vasculogenic מנגנונים במהל...

Hemangioblastomas (HBs) הם גידולים שפירים כלי הדם אשר נמצאים אך ורק בתוך האדם מערכת העצבים המרכזית (CNS). הם מפתחים אצל חולים עם מחלת פון היפל-לינדאו (אייצ '-אל) או נגעים סדיר. אייצ '-אל-HBs קשה לרפא באמצעות טיפול כירורגי עקב הישנות תכופים, נגעים מרובים לנבוע זה גנטי ההפרעה1. למרות איון של הגן מדכא הגידול אייצ '-אל נחשב שורש tumorigenesis של אייצ '-אל-HBs, המקור cytological (כולל כורוידאלית) ואת התהליך האבולוציוני של HBs נותרו במחלוקת במידה רבה2. לכן, הבנה טובה יותר של המנגנונים הביולוגיים HB-neovascular עשוי לספק תובנות שימושיות האסטרטגיות אנטי-וסקולרית המבטיחים ביותר אייצ '-אל-HBs.
מחקרים אחרונים הראו כי על בסיס חצי פנסיון-כורוידאלית דומה4,3,embryologic vasculogenesis5. קלאסי כלי הדם צמיחה אנדותל (VEGF)-אנגיוגנזה בתיווך כי מקורם אנדותל כלי הדם, אשר מונעת על ידי אייצ '-אל אובדן התפקוד, גרמו התפשטות והזמנו neovascular היווצרות, אשר כבר6. בשנת 1965, Cancilla וצימרמן מצא, באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, כי HBs מקורם אנדותל7. מאוחר יותר התברר כי תאי סטרומה נגזרים מתוך רכיב vasoformative8. בשנת 1982, Jurco. et al. נמצא כי תאי סטרומה הם מקור אנדותל9. לכן, שיערנו כי תאי אנדותל כלי הדם אדם הם התאים המקוריים של HB-כורוידאלית10. אמנם עדיף להשתמש התרבויות העיקרי מתאי HB נגזר אייצ '-אל המטופל ניתוחים, מחקרים קודמים שלנו ציינו כי תרבויות העיקרי של HB אינם יציבים, שורות תאים לא יכול להיות הוקמה3. יתר על כן, תרבויות ראשי בסביבת 3D לא יוכל לזהות המקור cytological של HB-כורוידאלית כי הם כוללים המוצא לאגס התרבותי מרכיבים על בסיס חצי פנסיון-וסקולרית10,11. לכן, כמודל פרימיטיביים וקלאסי של תאי אנדותל, תאי אנדותל כלי הדם (HUVEC) אדם יכול לשמש מודל הסלולר אלטרנטיבי HBs.
וזמינותו נבטי ספרואיד הוא מודל חדש12,הנדסת רקמות,13. בנייר זה, יישום תלת-ממד coculture מבוססי קולגן מערכת במבחנה באמצעות ספרואיד את לבלוב assay פותחה, עם מטרה הכוללת כדי להעריך אם אנגיוגנזה קלאסי קיימת ב- HBs, וכן את תפקידו ב- HBs.

<table><tbody><tr><td>תא אנדותל וריד טבורי אנושי</td><td>מרכז תאי המעי הרגיז פודאן</td><td>FDCC-HXN180</td><td></td></tr><tr><td>dulbecco' נשר שונה' s בינוני&nbsp;</td><td>סרום בקר עוברי Gibco</td><td>11995040</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>&nbsp; </td><td></td>26400044</tr><tr><td>PLKO.1-puro וקטור</td><td>Addgene</td> <td># 8453</td><td></td></tr><tr><td>אריזת פלסמיד psPAX2&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12260</td><td></td></tr><tr><td>מעטפת פלסמיד pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td></td></tr><tr><td>צלחות תלת מימד עגולות-תחתונות 96 בארות</td><td>S-Bio</td><td>MS-9096M</td><td></td></tr><tr><td>matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM בינוני</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>מדיום סרום מופחת&nbsp;</td></tr><tr><td>צלחת 15 בארות</td><td>Ibidi</td><td>81501</td><td>ניתן להפחית בועות אוויר בג'ל על ידי איזון ה-&mu; &ndash; החלק אנגיוגנזה לפני השימוש בתוך החממה תוספי</td></tr><tr><td>צמיחת תאי אנדותל</td> לילה <td>Sciencell</td><td>#1052</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית 10 ס"מ</td><td>Corning</td><td>Scipu000813</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>typsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>מערכת מונה תאים אוטומטית &nbsp;</td><td>תוכנה לניתוח תמונות ביוטק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>ווינמסיס</td><td></td><td>http://mywim.wimasis.com&nbsp;</td></tr></tbody></table>

נוהל מקיף כדי להעריך את ביצועי במבחנה כורוידאלית hemangioblastoma בשם משתמש את ספרואיד הלבלוב assay

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

איון של הגן מדכא הגידול פון היפל-Lindau. אייצ ' (.-אל) ממלא תפקיד מכריע בהתפתחות של hemangioblastomas (HBs) בתוך מערכת העצבים המרכזית אנושי (CNS). עם זאת, התהליך האבולוציוני של HBs (כולל כורוידאלית) והן המקור cytological נותרו שנויים במחלוקת, אנגיוגנזה עבור אייצ '-אל-HBs, בהתבסס על קלאסי על בסיס חצי פנסיון אנגיוגנזה, יצרו תוצאות מאכזבות בניסויים קליניים. מכשול רציני תרגום קליני מוצלח של טיפול אנטי-כלי הדם היא חוסר הבנה מעמיקה של כורוידאלית זה הגידול בכלי הדם. במאמר זה, נציג נוהל מקיף כדי להעריך במבחנה אם אנגיוגנזה קלאסי קיימת ב- HBs, וכן את תפקידו ב- HBs. באמצעות הליך זה, חוקרים יכולים במדויק להבין את המורכבות של כורוידאלית על בסיס חצי פנסיון ולזהות את הפונקציה של זו הצורה השכיחה של אנגיוגנזה HBs. פרוטוקולים אלה ניתן להשתמש כדי להעריך את הטיפול האנטי-וסקולרית המבטיחים ביותר עבור גידולים, אשר יש פוטנציאל גבוה translational לטיפול גידולים או לסיוע באופטימיזציה של הטיפול האנגיוגנזה anti HBs בעתיד תרגומים. התוצאות להאיר את המורכבות של כורוידאלית על בסיס חצי פנסיון, מציע כי אנגיוגנזה טופס הנפוץ הזה הוא רק מנגנון משלים בכורוידאלית על בסיס חצי פנסיון.

התמונות המקוריות נלקחים על ידי מיקרוסקופ אור הפוך. דמויות טיפוסיות של קבוצת הביקורת וקבוצת אייצ '-אל מוצגים באיור2-A1 , איור 2-A2. אורך נבטי של קבוצת הביקורת היא קצרה יותר מזו של קבוצת אייצ '-.
לאחר העלאת התמונות, הפלטפורמה המקוונת מספקת תוצאות ניתוח ישירות. הפלט מורכב משני חלקים: התמונה המעובדת ואת התוצאות המתקבלות ניתוח. תמונות מעובד ...

מאמר זה מציג נוהל מקיף כדי להעריך במבחנה אם אנגיוגנזה קלאסי קיימת ב- hemangioblastomas (HBs) ותפקידו HBs. התוצאות להאיר את המורכבות של HB-כורוידאלית, מציע כי זו הצורה השכיחה של אנגיוגנזה הוא רק מנגנון משלים ב- HB-כורוידאלית.

נוהל מקיף כדי להעריך את ביצועי במבחנה כורוידאלית Hemangioblastoma בשם משתמש את ספרואיד הלבלוב Assay

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להעריך את הביצועים של הניאו-וסקולריזציה המשוערת של המנגיובלסטומה באמצעות בדיקת הנבטת הספרואידים במבחנה. השיטה יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האנגיוגני, כגון אנגיוגנזה של גידולים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא תוצר של הליך מקיף להערכה במבחנה היכן אנגיוגנזה הגידולית הקלאסית קיימת בהמנגיובלסטומה והיא גדלה בהמנגיובלסטומה.ההשלכה של טכניקה זו משתרעת על טיפול בהמנגיובלסטמור וכלי דם מכיוון שהתוצאה מדגישה את המורכבות של המנגיובלסטמור ניאו-וסקולריזציה, וזה מצביע על כך שצורה נפוצה זו של אנגיוגנזה היא רק מנגנון משלים. כך ששיטה זו יכולה לספק תובנה לחקר המנגיובלסטמור ניאו-וסקולריזציה. ניתן ליישם אותו גם על גידולים, אנגיוגנזה ויישומים הקשורים לכלי דם בגידול מוצק כלשהו, כגון חיקוי כלי דם של גידול בגידול זכוכית.הדגמה אמיתית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה ללמוד את הדור של צעד ספרואיד תאי אנדותל מניפולטיביים אלה. כי התנאי המתאים חשוב. ראשית, תרבית תאי האנדותל HUVEC במדיום תרבית DMEM בתוספת עשרה אחוז סרום בקר עוברי, פניצילין וסטרפטומיצין.לאחר מכן, שמרו על התרבית בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם חמישה אחוזי פחמן דו חמצני. לאחר מכן, כדי לסנתז את שבר ה-shRNA, עכל את הפלסמיד עם אנזימי הגבלה ApaI ו-EcoRI. לאחר מכן לפלסמיד המעוכל, הוסף גם את האוליגו קדימה וגם אחורה, מאגר NEB פי 10 ומים מזוקקים כפול לנפח סופי של 50 מיקרוליטר.לאחר הוספת כל הריאגנטים, מחממים את התערובת בחום של 98 מעלות צלזיוס למשך ארבע דקות. לאחר מכן, התקררו בהדרגה לטמפרטורת החדר בטווח של מספר שעות. השתמש ב-T4 ligase כדי לקשור את האוליגו המחוסם ואת הפלסמיד.דגרו את הצינור בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, הוסף חמישה מיקרוליטרים של תערובת קשירה ל-25 מיקרוליטר של תאים מוכשרים DH5alpha. ב-500 מיקרוליטר של מדיום DMEM, הוסף את הווקטור הלנטי-ויראלי או את הווקטור המקושקש, יחד עם פלסמידים אחרים של אריזה.לאחר מכן, דגרו על התערובת הלנטי-ויראלית למשך 25 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, הוסף 7 מיליליטר של מדיום ה- DMEM לתמיסה המעורבת המקושקשת או הלנטיויראלית. תרבית תאי 293FT במדיום DMEM ללא סרום בקר עוברי בצלחת תרבית של 10 סנטימטרים.הוסף מיליליטר אחד של התמיסה הלנטי-ויראלית או המקושקשת לתאי 293FT בצלחת התרבית. לאחר שש שעות, שאפו את המדיום הישן ממנת התרבות. לאחר מכן, החלף את המדיום הישן במדיום DMEM טרי המכיל 10 אחוז סרום בקר עוברי.לאחר 48 שעות, אוספים את המדיום. העבירו את תאי האנדותל של HUVEC בתווך הלנטי-ויראלי ושמרו למשך 72 שעות. לאחר מכן, הוסף שני מיקרוגרם למיליליטר פורומיצין למדיום תרבית התאים HUVEC.לבסוף, דגרו על התרבות למשך 24 שעות נוספות. למחרת, הוסף מיליליטר אחד של טריפסין EDTA כדי לטריפסין תאי HUVEC. לאחר מכן השעו מחדש את תרחיף התאים הטריפסיני במדיום DMEM עם סרום בקר עוברי של 10 אחוז.ספור את מספר התאים באמצעות מונה תאים. לאחר הספירה, זרעו את התאים בצלחת תלת מימדית תחתונה עגולה של 96 בארות. לאחר הזריעה יש לדגור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם חמישה אחוזי פחמן דו חמצני למשך 72 שעות ברציפות.לאחר 36 שעות, החלף מחצית ממדיום התרבות במדיום טרי. ראשית, יש להפשיר את תמיסת הג'ל בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לדלל אותה ביחס של אחת לחמש עם מדיום הסרום המופחת. מוצצים את הספרואידים ממדיום ה- DMEM באמצעות מיקרופיפטה.לאחר מכן, שטפו את הספרואידים עם חמישה מיליליטר של מדיום סרום מופחת. העבירו בזהירות את הכדורים התלויים ואת הג'ל המדולל. בצלחת של 15 בארות, הטמיעו 300 מיקרוליטרים של הנוזל המעורב של ספרואידים וג'ל מדולל.דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים פחמן דו חמצני למשך שעה. לאחר מכן, הוסף 400 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת לבאר אחת. כדי למנוע אידוי, מלאו את סביבת הבאר במים סטריליים.לאחר מכן, תרבית התאים ב-37 מעלות צלזיוס, חמישה אחוז פחמן דו חמצני ו-100 אחוז לחות למשך שעה. לאחר הדגירה יש לשאוב את המדיום הישן ולהוסיף 600 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת עם אחוז אחד של תוסף צמיחת תאי אנדותל לבאר ולדגור למשך יום. צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך.כאן, הנבטה ספרואידית של התאים נלכדת באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך כדי לחקור את ההשפעה של השתקת גן VHL על הפוטנציאל האנגיוגני של תאי האנדותל. נראה כי ספרואיד נובט 12 שעות לאחר הטיפול הלנטי-ויראלי הן בתאי הביקורת והן בתאי האנדותל המושתקים של VHL. לאחר מכן, מבוצע ניתוח סטטיסטי כדי לכמת את אורך הנבטים שנוצרו על ידי הספרואידים המושתקים של הגן VHL.נראה שאורך הנבט הממוצע הוא כ-125 מיקרומטר בקבוצות המושתקות של VHL בעוד שהוא רק כ-65 מיקרומטר בקבוצת הביקורת. אורך הנבט המצטבר הממוצע של קבוצת ה-VHL המושתקת הוא כ-1250 מיקרומטר בעוד של קבוצת הביקורת הוא 680 מיקרומטר. תוצאות אלו מצביעות על עלייה של פי שניים באורך הנבט בקבוצות המושתקות של VHL.לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 48 שעות אם היא מבוצעת כראוי. ביצוע הליך ושיטה זו כמו בדיקת היווצרות נימים ניתן לבצע על מנת לענות על שאלות נוספות. כמו לחקור את היכולת האנגיוגנית של תאי אנדותל כלי דם.לאחר התפתחות זו, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האנגיוגנזה לחקור את כלי הדם הפנימיים של הגידול. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב אילו גנים מאבדים פונקציה בתאי אנדותל שעברו מניפולציה המשמשים לבדיקת פיצוץ.

a-comprehensive-procedure-to-evaluate-vitro-performance-putative

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

פלישה לרקמות נורמליות שמסביב היא מאפיין מגדיר של גידולים ממאירים. אנו מספקים כאן מבחן מיקרו-צלחת פשוט ואוטומטי למחצה של פלישה לביומטריצה תלת מימדית טבעית שהודגמה במספר מודלים של סרטן אנושי מתקדם.

Assay (3D) תלת ממדי גידול ספרואיד הפלישה

הפרוטוקול מתאר כיצד מהנדס רשת כלי הדם perfusable ב ספרואיד. Microenvironment שמסביב של ספרואיד הוא פיתח כדי לגרום אנגיוגנזה ולהתחבר ספרואיד של microchannels את התקן microfluidic. השיטה מאפשרת את זלוף של ספרואיד, אשר היא טכניקה המיוחל בתרבויות תלת מימדי.

רשת כלי הדם perfusable עם דגם רקמה במכשיר Microfluidic

מתנות פרוטוקול זה חרוז הרומן במבחנה assay זה יותר כראוי מודלים מתהליך ויוו הלבלוב אנגיוגנזה על-ידי שילוב pericytes. שינוי זה מאפשר וזמינותו חרוז רוצה להתרכז יותר בנאמנות באינטראקציה תאית heterotypic בין תאי אנדותל ותאים ציור קיר זה הם קריטיים עבור אנגיוגנזה.

שילוב Pericytes חרוז תא אנדותל הלבלוב Assay

שיטה זו מתארת את התרבות של תאים מבוססי iPSC-נגזרות כמו 40 מיקרוכלי תלת-ממד של מיקרו בפלטפורמת microfluאידיג מתוקננת. פלטפורמה זו מאפשרת לימוד של לבלוב אנגיוגנטית מונחה הדרגתי ב-3D, כולל השקה וייצוב של נבטי האנגיוגנטי באופן מדרגי ותפוקה גבוהה.

שיטת הלימוד הסטנדרטית והמדמדית למחקר בלבלוב אנגיוגנטית בתלת-ממד של התאים הנגזרים מתוך מבחנה

מערכת שיתוף התרבות התלת-ממדית של החברה מיועדת לחקות את האנגיוגנזה הפיזיולוגי. שיתוף תרבות הספרואידים נוצרות על ידי שני מקדים האדם תא כלי דם, ECFCs ו MSCs, ו מוטבע ג'ל קולגן. המערכת החדשה יעילה להערכת מאפטורים מאופגנטיים, ומספקת מידע רלבנטי יותר למחקר בvivo.

3-מימדי אנגיוגנזה שיטת מערכת באמצעות Spheroids שיתוף תרבות נוצר על ידי ויוצרים מושבת המושבה תאים ותאי גזע Mesenchymal

פרוטוקול זה מציג בדיקה נבטי choroid, מודל vivo לשעבר של התפשטות מיקרוווסקולרית. בדיקה זו יכולה לשמש כדי להעריך מסלולים המעורבים בהתרבות כלי מיקרו choroidal ולהעריך טיפולים תרופתיים באמצעות סוג פראי רקמת עכבר מהונדסים גנטית.

אקס ויוו צ'רויד נבט א-סאי של אנגיוגנזה מיקרו-וסקולרית עינית

בדיקה זו משתמשת בתאי גזע עובריים של עכברים המתמיינים לגופי עובר בתרבית בג'ל קולגן תלת-ממדי כדי לנתח את התהליכים הביולוגיים השולטים באנגיוגנזה נובטת במבחנה. הטכניקה יכולה להיות מיושמת לבדיקת תרופות, מידול מחלות, ולחקר גנים ספציפיים בהקשר של מחיקות קטלניות עוברית.

במבחנה בדיקת הנבטה תלת מימדית של אנגיוגנזה באמצעות תאי גזע עובריים של עכבר לצורך מידול מחלות כלי דם ובדיקות סמים

הצלבה בין תאי אפיתל חלביים לתאי אנדותל תורמת חשובה להתקדמות סרטן השד, לצמיחת הגידול ולגרורות. במחקר זה, כדוריות נעשו מתאי סרטן השד יחד עם תאי אנדותל כלי דם ו/או לימפתיים ולהדגים את ישימותם כמערכת במבחנה לחקר סרטן השד.

כדורי תא אפיתל ואנדותל של חלבי כמודל הפריה תפקודי פוטנציאלי לחקר סרטן השד

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר ייצור מהיר, חזק וזול של ספרואידים סרטניים ואחריו אנקפסולציה הידרוג'ל. זה ישים באופן נרחב כפי שהוא אינו דורש ציוד מיוחד. זה יהיה שימושי במיוחד לחקר אינטראקציות ספרואידים-מטריצה ובניית פיזיולוגיה של רקמות חוץ גופיות או מודלים פתולוגיים.

ייצור ספרואידי גידול ואנקפסולציה בהידרוג'ל פוליאתילן גליקול לחקר אינטראקציות ספרואידים-מטריצה

מחקר זה מציג את בדיקת נדידת פצעי השריטה הדו-ממדית (2D) ואת בדיקת הנבטת הספרואידים התלת-ממדית (3D), יחד עם שיטות הניתוח שלהם במורד הזרם, כולל מיצוי RNA ואימונוציטוכימיה, כבדיקות מתאימות לחקר אנגיוגנזה במבחנה.

חקירת אנגיוגנזה ברמה תפקודית ומולקולרית על ידי מינוף בדיקת נדידת פצע השריטה ובדיקת הנבטת הספרואיד

חקור מנגנוני ניאווסקולריזציה בהמנגיובלסטומה באמצעות מבחן נביטת ספרואידים במבחנה. השיטה מאפשרת הערכת אנגיוגנזה קלאסית ומסייעת בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות.

נוהל מקיף כדי להעריך את ביצועי במבחנה כורוידאלית Hemangioblastoma בשם משתמש את ספרואיד הלבלוב Assay

גלה סרטונים נוספים