Name: פיתוח Microfluidic ללמוד את היכולת התארכות של תאי צמחים הגדלים עצה בחללים קטנים מאוד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: חקור את יכולת ההתארכות של תאי צמחים הגדלים עצה דרך פערים צרים במכשיר מיקרו-זורם. השיטה מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של תהליכי עיוות תאים בקנה מידה מיקרומטרי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים Tsutsui ה ו Kurihara ד שסיפקו הצמחים הטרנסגניים, כולל קו ט fournieriRPS5Ap::H2B-tdTomato וקו א לבנה מק'לאבר-UBQ10pro::H2B , בהתאמה. עבודה זו נתמכה על ידי המכון של טרנספורמטיבי ביו-מולקולות של אוניברסיטת נאגויה, יפן מתקדמת צמח מדע ברשת. תמיכה כספית עבור עבודה זו העניקה מלגות יפן המדע, הטכנולוגיה סוכנות (ERATO הפרוייקט הענק לא. JPMJER1004 עבור תוצרת הארץ), מענק הסיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים (Nos. JP16H06465 ו JP16H06464 עבור תוצרת הארץ), וחברה ביפן עבור Grants-in-Aid של קידום המדע (JSPS) לצורך מחקר גישוש מאתגר (גרנט 26600061 מס עבור N.Y. וגרנט ' קט ' 25650075 ו- 15 K 14542 עבור Y.S.).

1. ייצור של Microdevice PDMS כדי לבחון גדל אבקה צינורות וטחב Protonemata
הערה: השתמשנו מכשיר פוטוליתוגרפיה maskless להכין בתבניות PDMS על שבבי סיליקון. הפרטים לגבי המבצע של המערכת מושמטים בכתב היד. טכניקת פוטוליתוגרפיה תקן9 באמצעות photomask עשוי לשמש גם ליצירת התבניות PDMS המתואר בכתב היד.
<ol><li>יוצקים 11 גרם של פולימר טרום PDMS תערובת (elastomer הבסיס: אשפרה הסוכן ביחס של 10:1) לתוך כל עובש 4 אינץ.</li>
	<li>דגה כייר מוכן בשלב 1.1 עבור 20 דקות בתוך תא ואקום.</li>
	<li>לאחר ריפוי-65 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות בתנור שאינו הסעת חום, לקלף את השכבה PDMS את העובש, מנקבים חורים גישה לתוך הערוצים fluidic באמצעות ביופסיה אגרופים. הערה: עבור ההתקן הנביטה, גודל החור חייב להיות מותאם כדי לשקף את הקוטר של העלי. ערך זה ישתנה ולכן על ידי מינים. בניסוי זה, אנחנו מנוקב חור 1 מ"מ עבור פתחי הכניסה העלי וחורים 1.5 mm עבור המאגרים בינוני נוזלי. עבור ההתקן protonemata מוס, חור 4 מ מ שימשה המאגר הדגימה.</li>
	<li>לחשוף את השכבה PDMS ואת צלחת תחתית זכוכית (3.5-5 ס מ קוטר) לשידור פלזמה 50 s.</li>
	<li>הקש את השכבה PDMS לתוך צלחת תחתית זכוכית חום-65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בתנור שחומם ללא הסעה לאטום לגמרי את הרשת microfluidic.</li>
</ol>2. ייצור של Microdevice PDMS של שערות השורש
<ol><li>חזור על שלבים 1.1-1.3 באמצעות התבניות כדי להכין שתי שכבות PDMS השורש ואת שורש השיער microdevices. הערה: השתמשנו חור 2 מ מ עבור המאגרים בינוני נוזלי ב microdevice השורש.</li>
	<li>לחשוף את שתי שכבות PDMS האווירית, פלזמה 50 s.</li>
	<li>שתי השכבות PDMS תחת stereomicroscope באמצעות aligner שולחן בהזמנה אישית להרכיב. הערה: microchannels את שכבות אלה PDMS להתייצב אחד את השני. לפני הרכבת, ודא כי הסימנים היישור על שתי שכבות התאמה.</li>
	<li>חום-65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בתנור שחומם ללא הסעה לאטום לגמרי את הרשת microfluidic.</li>
	<li>הסר תגית כיסוי microdevice שלא נבנה ומניחים את המכשיר על צלחת תחתית זכוכית הוא 5 ס מ בקוטר.</li>
</ol>3. הכנה של חוץ גופית תא תרבות בינוני אבקה צינורות (Torenia fournieri)
<ol><li>להכין בינוני של Nitsch ששונה כפי שתואר לעיל,15 והחיטוי המדיום ב 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. הערה: ההרכב של בינוני של Nitsch modifed הוא מלון NH43 (80 mg/L), יודע3 (125 מ ג/ליטר) Ca (3)2‧4H2O (500 מ ג/ליטר), MgSO4‧7H2O (125 מ"ג/ליטר), ח'2PO4 (125 מ ג/ליטר ), MnSO4‧4H2O (3 מ ג/ליטר), ZnSO4‧7H2O (0.5 מ ג/ליטר), H3בו3 (10 mg/L), CuSO4‧5H2O (0.025 mg/L), נה2MoO4‧2H2O (0.025 mg/L), סוכרוז (50,000 mg/L), קזאין (500 mg/L). המדיום מוכן שניתן לאחסן ב 4 ° C 4 חודשים לפחות.</li>
	<li>להכין 26% (w/v) פוליאתילן גליקול באמצעות מים יונים בלוק ולסנן את הפתרון עם מסנן נקבובית מיקרומטר 0.3. הערה: המדיום מוכן שניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך חודש.</li>
	<li>מערבבים את נוגדנים מוכנה בשלב 3.1 ו- 3.2 ביחס 1:1 (v/v). הערה: בינוני להכין טרי כל שימוש.</li>
</ol>4. הכנה של חוץ גופית תא תרבות בינוני שערות השורש (תודרנית לבנה)
<ol><li>להכין פתרון של 0.215% (w/v) Murashige & Skoog בינוני, 0.05% (w/v) MES, 1% (w/v) סוכרוז, ו- 1% (w/v) אגר במים יונים. אוטוקלב הפתרון ב 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.</li>
</ol>5. הכנה של חוץ גופית תא תרבות בינוני מוס Protonemata (Physcomitrella patens)
<ol><li>מראש תדגור על protonemata מוס BCDAT בינוני16 בצלחת פטרי הערה: ההרכב של BCDAT בינוני הוא 1 מ MgSO4, 10 מ מ יודע3, 45 מיקרומטר מכל4, מ מ 1.8 ח'2PO4 (pH להתאים ל- 6.5 עם קו), פתרון יסוד קורט (0.22 מיקרומטר CuSO4, ZnSO מיקרומטר 0.194, 10 מיקרומטר H3בו 3, 0.1 מיקרומטר נה2MoO4, 2 מיקרומטר MnCl2, מיקרומטר 0.23 CoCl2ו- 0.17 מיקרומטר קי), 1 מ מ CaCl2ו- 5 מ מ דיאמוניום (+)-tartrate.</li>
	<li>תרבות האיזוב במדיום BCDATG, microdevice. הערה: המדיום BCDATG היא BCDAT בינונית עם 0.5% (w/v) גלוקוז. המדיום מוכן שניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך חודש.</li>
</ol>6. Culturing במבחנה של צינורות אבקה טי fournieri Microdevice
<ol><li>במקום microdevice את האבקה בתוך תא ואקום, דגה כעשרים דקות.</li>
	<li>להסיר את microdevice מן החדר ואקום, להציג את מדיום הגידול לים פיסטיל באמצעות micropipette עם טיפ מצוין. למלא הבארות הנותרים על גגותיהם עם המדיום אותו. חכו מספר דקות עד כל microchannels את מלאים המדיום על ידי הוואקום שנוצר בתוך microchannels.</li>
	<li>מניחים מגבת נייר רטובה קצת בצלחת התחתונה זכוכית כדי לשמור על הלחות בצלחת.</li>
	<li>להעביר את גרגרי אבקה מפראי-סוג פרח "כחול ולבן" טי fournieri לסטיגמה שלה באמצעות מחט לנתיחה. הערה: גם ערכנו ניסוי זה עם הטרנסגניים טי fournieri 'כתר סגול' פרח ( RPS5Ap::H2B-tdTomato קו17), עם צינורות אבקה המכילה תאי זרע fluorescently שכותרתו, גרעינים וגטטיבי.</li>
	<li>גזור הסגנון pollinated (1 ס"מ) באמצעות סכין.</li>
	<li>הכנס את הסגנון לחתוך לתוך הים של המכשיר כמוצג באיור2.</li>
	<li>לשים מכסה על המנה, לאטום אותו עם סרט.</li>
	<li>למקם את המכשיר בתוך אינקובטור ב 28 מעלות צלזיוס במשך 5-6 h בחשכה.</li>
</ol>7. Culturing במבחנה של שערות השורש לבנה א ב Microdevice
הערה: השלבים 7.1-7.9 (למעט 7.3 ו- 7.5) צריכה להתבצע בתוך תא למינארי.
<ol><li>לעקר את הזרעים מקולומביה לבנה א (Col-0), הטרנסגניים קו UBQ10pro::H2B-מק'לאבר (המכיל את סמן גרעיני פלורסנט) בהשריה בנוזל סטרילי (מלבין ביתי 5% (v/v) ו- 0.02% (v/v) טריטון X-100) למשך 5 דקות.</li>
	<li>לשטוף ביסודיות את הזרעים סטיריליים במים בלוק.</li>
	<li>לאחסן זרעים שטופים במים במשך יומיים ב 4 ° C בחשכה.</li>
	<li>לחטא את microdevice תחת אור UV בן לילה.</li>
	<li>מניחים את microdevice תא ואקום, דגה כעשרים דקות.</li>
	<li>להציג את מדיום הגידול לבארות את ההתקן באמצעות של micropipette. המתן מספר דקות עד הריק ממלא כל microchannels את המדיום.</li>
	<li>מניחים מגבת נייר רטובה בלוק בצלחת התחתונה זכוכית כדי לשמור על הלחות בצלחת.</li>
	<li>העברת זרע סטיריליים לתוך הים של המכשיר.</li>
	<li>לשים מכסה על המנה, לאטום אותו עם סרט.</li>
	<li>מניחים את המכשיר אנכית בתוך אינקובטור ב 22 ° C תחת אור לבן רציף.</li>
	<li>בדוק צמיחת שורש השיער לאחר 4-10 ימי דגירה. להשיג את השדה החיובי והן פלורסנט תמונות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה.</li>
</ol>8. Culturing במבחנה של patens פ (מוס) Protonemata את ההתקן Microfluidic
הערה: השלבים 8.2-8.6 (למעט 8.3) צריכה להתבצע בתוך תא למינארי.
<ol><li>Preculture patens פ זן Gransden 200418 באמצעי BCDAT מכוסה צלופן בצלחת פטרי לשבוע אחד תחת אור לבן רציף ב 25 º C.</li>
	<li>לחטא את microdevice תחת אור UV ללון בתוך תא למינארי.</li>
	<li>מניחים את microdevice תא ואקום, דגה כעשרים דקות.</li>
	<li>להציג מדיום הגידול הבארות באמצעות של micropipette. המתן מספר דקות עד הריק ממלא כל microchannels את המדיום.</li>
	<li>מוסיפים מים בלוק לתוך המנה המקיפים את microdevice כדי לשמור על הלחות בצלחת.</li>
	<li>להעביר חתיכה קטנה של אזוב protonemata רקמות לים של microdevice ואת התרבות הרקמה באינקובטור 25 ° c תחת אור לבן רציף.</li>
	<li>בדוק את הצמיחה protonemata מוס לאחר 2-3 שבועות של דגירה. להשיג תמונות שדה בהיר באמצעות מיקרוסקופ.</li>
</ol>9. זמן לשגות הדמיה של צמיחה הנביטה טי fournieri
<ol><li>מניחים את microdevice על מיקרוסקופ פלורסצנטיות הפוכה מצויד עם התמונה רכישת חומרה (למשל., מצלמת CCD) ותוכנות. למצוא את מיקומי microgap. הערה: עבור התוכנה רכישת התמונה, השתמשנו מוצר זמין מסחרית (טבלה של חומרים). תוכנת קוד פתוח מיקרוסקופ כגון µManager הוא גם זמין באינטרנט (https://micro-manager.org/wiki/Micro-Manager). אנו ממליצים להתקין את הקבל מיקרוסקופ על המיקרוסקופ להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה.</li>
	<li>לכידת תמונות שדה בהיר כל 10 s באמצעות מיקרוסקופ תמונה רכישת תוכנה.</li>
	<li>כדי לבחון את תאי הזרע fluorescently שכותרתו ואת גרעין וגטטיבי בצינור אבקה של קו RPS5Ap::H2B-tdTomato , להאיר את הדגימה. עם 561 ננומטר לייזר ולהשתמש מסנן אופטי bandpass (578/105 ננומטר). הערה: למרות תמונות בצילום מואץ של האבקה הצמיחה בה נתפסים לעתים קרובות הדמיה לא נראה להשפיע על הגדילה. עם זאת, תמיד מומלץ כדי למזער את עוצמת הלייזר, זמן החשיפה, מרווח זמן לשגות, כדי למזער את phototoxicity ואת photobleaching של fluorophore.</li>
	<li>להתאים את הבהירות והחדות של התמונות והכן קובץ וידאו באמצעות תוכנת ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).</li>
</ol>

<ol><li>Higashiyama, T., Takeuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mechanism+and+Key+Molecules+Involved+in+Pollen+Tube+Guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Mechanism and Key Molecules Involved in Pollen Tube Guidance.</a> Annu. Rev. Plant. Biol. 66, 393-413 (2015).</li>
<li>Vogler, H., Shamsudhin, N., Nelson, B. J., Grossniklaus, U. Measuring cytomechanical forces on growing pollen tubes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVogler%2C+H+%22Pollen+Tip+Growth%22">Pollen Tip Growth</a>. Obermeyer, G., Feijó, J. , Springer. 65-85 (2017).</li>
<li>Kehr, J., Wagner, C., Willmitzer, L., Fisahn, J. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jxb/article/50/334/565/525736">Effect of modified carbon allocation on turgor, osmolality, sugar and potassium content and membrane potential in the epidermis of transgenic potato (Solanum tuberosum L.) plants.</a> J. Exp. Bot. 50 (334), 565-571 (1999).</li>
<li>Benkert, R., Obermeyer, G., Bentrup, F. W. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF01282125">The turgor pressure of growing lily pollen tubes.</a> Protoplasma. 198, 1-8 (1997).</li>
<li>Vogler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pollen+tube%3A+a+soft+shell+with+a+hard+core%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">The pollen tube: a soft shell with a hard core.</a> Plant J. 73 (4), 617-627 (2013).</li>
<li>Shamsudhin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallelized+pollen+tube+guidance+and+mechanical+measurements+on+a+Lab-on-a-Chip+platform%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Massively parallelized pollen tube guidance and mechanical measurements on a Lab-on-a-Chip platform.</a> PloS one. 11 (12), e0168138(2016).</li>
<li>Cheung, A. Y., Boavida, L. C., Aggarwal, M., Wu, H. M., Feijó, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pollen+tube+journey+in+the+pistil+and+imaging+the+in+vivo+process+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">The pollen tube journey in the pistil and imaging the in vivo process by two-photon microscopy.</a> J Exp Bot. 61 (7), 1907-1915 (2010).</li>
<li>Metzner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparison+of+MRI+and+X-ray+CT+technologies+for+3D+imaging+of+root+systems+in+soil%3A+Potential+and+challenges+for+root+trait+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: Potential and challenges for root trait quantification.</a> Plant Methods. 11 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+Lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Soft Lithography.</a> Angew Chemie Int Ed. 37 (5), 550-575 (1998).</li>
<li>Massalha, H., Korenblum, E., Malitsky, S., Shapiro, O. H., Aharoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+root-bacteria+interactions+in+a+microfluidics+setup%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Live imaging of root-bacteria interactions in a microfluidics setup.</a> P Natl Acad Sci. 114 (17), 4549-4554 (2017).</li>
<li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+Fluorescence+Imaging+of+Arabidopsis+Root+Growth+with+Rapid+Manipulation+of+The+Root+Environment+Using+the+RootChip%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using the RootChip.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Busch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+and+computational+platform+for+high-throughput+live+imaging+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression.</a> Nature Methods. 9, 1101-1106 (2012).</li>
<li>Parashar, A., Pandey, S. <a target="_blank" href="https://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.3604788">Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis.</a> Appl. Phys. Lett. 98, 263703(2011).</li>
<li>Bascom, C. S., Wu, S. -Z., Nelson, K., Oakey, J., Bezanilla, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27406170">Long-Term Growth of Moss.</a> in Microfluidic Devices Enables Subcellular Studies in Development. Plant Physiol. 172 (1), 28-37 (2016).</li>
<li>Higashiyama, T., Kuroiwa, H., Kawano, S., Kuroiwa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance+in+vitro+of+the+pollen+tube+to+the+naked+embryo+sac+of+Torenia+fournieri%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Guidance in vitro of the pollen tube to the naked embryo sac of Torenia fournieri.</a> Plant Cell. 10, 2019-2032 (1998).</li>
<li>Nishiyama, T., Hiwatashi, Y., Sakakibara, K., Kato, M., Hasebe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tagged+mutagenesis+and+gene-trap+in+the+moss%2C+Physcomitrella+patens+by+shuttle+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">Tagged mutagenesis and gene-trap in the moss, Physcomitrella patens by shuttle mutagenesis.</a> DNA Res. 7, 9-17 (2000).</li>
<li>Maruyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+Control+by+Each+Female+Gamete+Prevents+the+Attraction+of+Multiple+Pollen+Tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Independent Control by Each Female Gamete Prevents the Attraction of Multiple Pollen Tubes.</a> Dev. Cell. 25 (3), 317-323 (2013).</li>
<li>Rensing, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Physcomitrella+genome+reveals+evolutionary+insights+into+the+conquest+of+land+by+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Physcomitrella genome reveals evolutionary insights into the conquest of land by plants.</a> Science. 319, 64-69 (2008).</li>
<li>Yanagisawa, N., Sugimoto, N., Arata, H., Higashiyama, T., Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capability+of+tip-growing+plant+cells+to+penetrate+into+extremely+narrow+gaps%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Capability of tip-growing plant cells to penetrate into extremely narrow gaps.</a> Sci. Rep. 7 (1), 1403(2017).</li>
<li>Dolan, L., et al. <a target="_blank" href="http://dev.biologists.org/content/120/9/2465">Clonal relationships and cell patterning in the root epidermis of Arabidopsis.</a> Development. 120, 2465-2474 (1994).</li>
<li>Denais, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+envelope+rupture+and+repair+during+cancer+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nuclear envelope rupture and repair during cancer cell migration.</a> Science. 352 (6283), 353-358 (2016).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול צריך להיות מלווה בדיוק כדי להשיג את התוצאות שהוצגו לעיל. ראשית, PDMS שכבת זכוכית התחתון מאכל משטחים שניהם להתייחס עם פלזמה עבור כמות מספקת של זמן לפני מליטה. אחרת, השכבה PDMS עשוי באופן מקומי ניתוק ממשטח הזכוכית בעוד תאי גידול עצה חוצה את microgaps. עוד צעד קריטי בפרוטוקול protonemata שורש והשיער מוס הוא של microdevice העיקור. בדרך כלל, שערות השורש ותאים protonemata מוס צריך להיות בתרבית ב microdevice במשך כמה שבועות. בלי לחיטוי המכשיר, מיקרואורגניזמים ישגשג, מה שיכול להשפיע על צמיחת תאים אלה...

לאחר גרגרי אבקה לנבוט על סטיגמה, כל גרגיר מייצרת צינור אבקה יחיד שנושאת תאי זרע לתא הביצה, התא המרכזי להפרייה לדישון כפול. אבקה צינורות להאריך באמצעות הסגנון ולהגיע בסופו של דבר ביצית על ידי חישה רמזים הדרכה מרובים לאורך הדרך שלהם1. במהלך התארכות, אבקה צינורות נתקל סדרה של מכשולים פיזיים; המסלול שידור מלא תאים, אבקה צינורות עליך להזין הפתח micropylar דקה של ביצית להגיע שלהם היעד (איור 1 א')2. לכן, אבקה צינורות צריכה להיות יכולת לחדור מכשולים פיזיים, תוך כדי לנקוט הלחץ compressive של סביבתם. שערות השורש הינם סוג נוסף של גידול עצה תא צמח זה חייבים לעמוד חסימות בסביבת, בצורה של חלקיקי הקרקע ארוז (איור 1B).
תכונות מכאניות שונות הנביטה נחקרו, כולל לחץ טורגור הנוקשות של אזור הפסגה של התא, אשר ניתן למדוד באמצעות מיקרוסקופ כוח הסלולר פלסמוליזה התחלתית שיטה3,4 (CFM) 5 , 6, בהתאמה. עם זאת, שיטות אלה לבד אינם מגלים אם צינורות אבקה מסוגלים מתארך דרך מחסומים פיזיים לאורך נתיבים הצמיחה שלהם. טכניקה חלופית המאפשר התארכות הנביטה בפיקוח ויוו היא מיקרוסקופ שני הפוטונים7. עם זאת, בשיטה זו, קשה לצפות את שינויים מורפולוגיים צינורות בודדים אבקה עמוק בתוך הרקמה ביצית. בנוסף, צמיחת השיער שורש בקרקע, ניתן לאבחן באמצעות טומוגרפיה הממחושבת טומוגרפיה ממוחשבת (CT) ודימות תהודה מגנטית (MRI)8, אמנם עם רזולוציה נמוכה. כאן, אנו מציגים שיטה שבה ניתן להשתמש כדי לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהה של תהליך דפורמציה של התא במיקרוסקופ רגיל.
המטרה הכוללת של השיטה המתוארת כאן היא להמחיש את היכולת התארכות של עצה גידול תאי צמחים, כולל אבקה צינורות, שערות השורש, מוס protonemata, בחללים קטנים מאוד. כמו microdevices פולי-dimethylsiloxane (PDMS) הציג כתב יד זה שקופים שטיחות והאוויר חדיר, אנחנו יכולים התרבות תאים חיים בתוך המכשיר ובדוק אם צוינו והתנהגותם צמיחה תחת מיקרוסקופ. אפשרי גם ליצירת מיקרו ~ ננומטר רווחים בקנה מידה על ידי טכניקת הדפס אבן רכה9 עם השימוש בתבניות. תכונות אלה מאפשרות לנו ללמוד את היכולת התארכות של תאי צמחים הגדלים עצה בסביבה מוגבלת פיזית.
בעבודה זו, אנו נבנה 1 מיקרומטר רחב פערים (4 מיקרומטר בגובה) במכשירים microfluidic, בחן את היכולת של אבקה צינורות לחדור מכשולים מלאכותיים אלה, כי הם הרבה יותר קטן מאשר הקוטר של הצינור אבקה גלילי (כ 8 מיקרומטר). פלטפורמה ניסיוני זו מאפשרת לנו לדמיין של הנביטה בתגובה microgaps, ללכוד תמונות בצילום מואץ של התגובה, אשר לעקוב אחר תהליך דפורמציה של התא. פיתחנו גם את microdevices יכול לשמש כדי לחקור את יכולת החדירה של שערות השורש, מוס protonemata. מספר microdevices דווחו עד היום המאפשרים את החזיית שורש10,11,12,13 ו מוס protonemata14 צימוח ברזולוציה גבוהה. במכשיר שלנו, סדרה של שורש השיער הצמיחה ערוצי מחוברות בניצב לתא צמיחה שורש, שורש בודדים שערות (כ 7 מיקרומטר בקוטר) מודרכים ערוצי fluidic עם פער רחב 1 מיקרומטר. אנחנו גם תרבותי מוס protonemata (כ 20 מיקרומטר בקוטר) ב- microdevice המכיל microgaps לבחון את התגובות שלהם את המחסומים הפיזיים. הגישה המוצעת מבוססת-microfluidic מאפשר לנו לבחון את היכולת של תאי צמחים שונים הגדלים עצה להאריך דרך חללים קטנים מאוד, אשר לא יכול להיבדק על ידי כל שיטה אחרת זמין כרגע.

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>דאו קורנינג ושות'</td><td>סילגארד184</td><td></td></tr><tr><td>מוראשיג & Skoog Medium</td><td>Wako Pure Chemical</td><td>392-00591</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Dojindo</td><td>345-01625</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Wako Pure Chemical</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 50 מ"מ עם תחתית זכוכית</td><td>Matsunami Glass</td><td>D210402</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תחתית זכוכית 35 מ"מ</td><td>Iwaki&nbsp;</td><td>3971-035</td><td></td></tr><tr><td>להב כירורגי</td><td>נוצה</td><td>מס' 11</td><td></td></tr><tr><td>ביופסיה אגרופים</td><td>Harris</td><td></td><td>Uni-Core</td></tr><tr><td>טיפים לטעינת ג'ל</td><td>Bio-Bik</td><td>124-R-204</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>אולימפוס</td><td>IX83</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1</td><td>Yokogawa Electric</td><td></td><td>ללא מספר קטלוגי זמין עבור מיקרוסקופ</td></tr> <tr><td>מותאם אישית זהתוכנת הדמיה MetaMorph</td> מכשירים <td></td><td></td><td>מולקולריים</td></tr></tbody></table>

פיתוח microfluidic ללמוד את היכולת התארכות של תאי צמחים הגדלים עצה בחללים קטנים מאוד

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, תאי צמחים הגדלים טיפ צריך להתגבר על סדרה של מכשולים פיזיים; עם זאת, החוקרים חוסר המתודולוגיה להמחיש התנהגות הסלולר בתנאים מגבילים כאלה. כדי לטפל בבעיה זו, פותחו תאי צמיחה עבור עצה גידול הצמח תאים המכילים סדרה של פערים צר, מפוברק-מיקרו (~ 1 מיקרומטר) במצע פולי-dimethylsiloxane (PDMS). חומר שקוף זה מאפשר למשתמש לעקוב אחר עצה התארכות התהליכים תאים בודדים בזמן החדירה microgap על ידי הדמיה בצילום מואץ. באמצעות פלטפורמה ניסיוני זו, נצפו שינויים מורפולוגיים אבקה צינורות כפי שהם חדרו את microgap. אנחנו נתפס השינויים הדינמיים בצורה של גרעין וגטטיבי fluorescently שכותרתו ותאי הזרע צינור אבקה בתהליך זה. יתר על כן, אנו הפגינו את היכולת של שערות השורש, מוס protonemata לחדור הפער 1 מיקרומטר. פלטפורמה זו במבחנה ניתן ללמוד תאים מסוימים, להגיב מקומות מוגבל פיזית, עשוי לספק תובנות לגבי מנגנוני עצה-צמיחה.

כמופיע באיור1, תאי צמחים הגדלים עצה נתקלים סדרה של מחסומים פיזיים לאורך נתיבים שלהם צמיחה בתוך vivo. Microfluidic במבחנה תא תרבות פלטפורמות שהוצגו במחקר זה מופעל הבדיקה גידול עצה תהליך בשלושה סוגים של תאי צמחים (אבקה צינורות שערות השורש, מוס protonemata) באמצעות הפערים מלאכותיים 1 מיקרומטר (איור 3, איור 4, איור 5). לצורך המחקר הנביטה, הדמיה לחיות תאים ש...

אנו מתארים שיטה כדי לחקור את היכולת של עצה גידול תאי צמחים, כולל אבקה צינורות, שערות השורש, וטחב protonemata, להאריך להידחק למרווחים צרים מאוד (~ 1 מיקרומטר) במכשיר microfluidic.

פיתוח Microfluidic ללמוד את היכולת התארכות של תאי צמחים הגדלים עצה בחללים קטנים מאוד

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של תאי הצמח, כגון כיצד תאי צמחים הגדלים חודרים למחסומים הפיזיים של התא. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהה הבונות מחדש את תהליך העיוות של התא בפער בקנה מידה מיקרומטרי תחת מיקרוסקופ קונבנציונאלי. כדי ליצור מכשיר לבחינת צינורות האבקה הגדלים ופרוטונמטת הטחב, הכינו תחילה כ-11 גרם של PDMS, וטענו אותו לתבנית בגודל ארבעה אינץ'.לאחר מכן, הסירו את התבנית למשך 20 דקות בתא ואקום. לאחר מכן, רפאו את התבנית בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. לאחר הריפוי, קלף את שכבת ה-PDMS מהתבנית, ופתח את חורי הגישה לתעלה בתוך ה-PDMS באמצעות כלי ניקוב ביופסיה.לאחר מכן, חשוף את ה-PDMS ואת צלחת הזכוכית של חמישה סנטימטרים לפלזמת אוויר למשך 50 שניות. כדי לאטום את הרשת המיקרופלואידית, לחץ את שכבת ה-PDMS על צלחת הזכוכית, ורפא אותה במשך 30 דקות ב-65 מעלות צלזיוס. לייצור מיקרו-מכשיר המיועד לבדיקת שיער שורש, נטענות ומרפאות שתי תבניות.בעת ניקוב חורי התעלה, השתמש באגרוף של שני מילימטרים. לאחר חשיפת שתי השכבות לפלזמת אוויר למשך 50 שניות, חבר אותן יחד, כולל כיסוי, תחת סטריאומיקרוסקופ. השתמש בכלי קשתיות היישור המותאם אישית כדי להשיג זאת.רפאו את המכלול למשך 30 דקות בתנור כדי לאטום את הרשת המיקרופלואידית. לאחר הריפוי, הסר את הכיסוי מהמכשיר והעביר אותו לכלי זכוכית של חמישה סנטימטרים. לפני השימוש במיקרו-מכשיר צינור האבקה, יש להוציא אותו בתא ואקום למשך 20 דקות.הוסף מצע גידול לכניסת העלי באמצעות מיקרופיפטה עדינה. טען את הבארות האחרות באותו מדיום. אפשר כמה דקות למילוי הערוצים.בינתיים, הניחו מגבת נייר לחה בכלי כדי לסייע בשמירה על הלחות המקומית. כעת, אספו גרגרי אבקה מפרח כחול ולבן T.fournieri. העבירו את הגרגירים אל הצלקת בעזרת מחט חיתוך.לאחר מכן, חותכים סגנון האבקה באורך סנטימטר אחד לאורכו, ולאחר מכן מכניסים את סגנון החיתוך לכניסה של המכשיר המיקרופלואידי. כאשר סגנון החיתוך מוחדר לכניסה של מכשיר מיקרופלואידית עם פינצטה, חשוב לא להחזיק את הסגנון חזק מאוד מכיוון שהוא עלול לפגוע בסגנון. לאחר מכן, מהדקים מכסה על הכלי באמצעות סרט, ומעבירים את המנה לחממה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס, שם עליה להישאר בחושך במשך חמש עד שש שעות.בעבודה מתחת למכסה זרימה למינרית, התחל בעיקור זרעי קולומביה מהונדסים A.thaliana. משרים אותם בתמיסת ניקוי למשך חמש דקות. לאחר מכן, שטפו היטב את הזרעים במים חיטוי.לאחר העיקור, אחסן את הזרעים בארבע מעלות צלזיוס בחושך למשך 48 שעות. כמה ימים לאחר מכן, הסר את המיקרו-מכשיר למשך 20 דקות לפני השימוש בו. לאחר מכן, טען את מדיום הגידול המתאים לבארות המכשיר באמצעות פיפטה בעלת קצה דק, והמתן מספר דקות עד שהפתרון יימשך דרך כל הערוצים.כמו כן, העמיסו מעט מגבת נייר לחה על הכלי כדי לשמור על הלחות. כעת, העבירו זרע מוכן לכניסת המכשיר. לאחר מכן, הדקו את המכסה באמצעות סרט, והעבירו את המנה לאינקובטור של 22 מעלות צלזיוס עם אור רציף.לפני השימוש בו, יש לעקר את המיקרו-מכשיר תחת UV למשך הלילה. למחרת, הסר את המיקרו-מכשיר למשך 20 דקות. לאחר הסרת הגז, טען את המיקרו-בארות במצע הגידול המתאים.בזמן שהתעלות מתמלאות בהדרגה, הקיפו את המיקרו-מכשיר במעט מים שעברו חיטוי כדי לשמור על לחות. העבירו חתיכה קטנה של רקמת פרוטונמטה אזוב לכניסה של המיקרו-מכשיר. כעת, תרבית את המכשיר ב -25 מעלות צלזיוס באור מתמשך.לאחר שבועיים-שלושה של צמיחה, צלם תמונות שדה בהיר של התוצאות תחת מיקרוסקופ. תאי צמחים הגדלים בקצה נתקלים בסדרה של מחסומים פיזיים לאורך נתיבי הצמיחה שלהם in vivo, כמו במערכת ההעברה ובמיקרופיל, שלא לדבר על נתיב שערות השורש באדמה. פלטפורמות תרבית התאים המיקרופלואידיות המוצגות במבחנה מאפשרות לבחון את תהליך גידול הקצה בשלושה סוגים של תאי צמחים, צינורות אבקה, שערות שורש ופרוטונמטת טחב.הצפייה מתבצעת באמצעות מרווחים של מיקרון אחד במכשירים. מכיוון שמיקרו-פערים בגודל זה הם שבירים, לפעמים הם ייסגרו, במיוחד לאחר שימוש חוזר. לפיכך, חשוב לוודא שהפערים שלמים לפני ביצוע הניסויים.עבור מחקר צינור האבקה, נעשה שימוש בהדמיית תאים חיים כדי לנטר שינויים מורפולוגיים באזור האפיקלי של צינורות האבקה, כמו גם הגרעין הצמחי ותאי הזרע בתגובה למפגש עם חלל קטן במיוחד. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של תאי הצמח לחקור את יכולת ההתארכות של תאי צמחים הגדלים בקצוות, כגון צינורות אבקה, שערות שורש ופרוטונמטת טחב בחלל קטן במיוחד.

development-microfluidic-devices-to-study-elongation-capability-tip

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מתארים פרוטוקול עבור ייצור של מכשירים microfluidic שיכולה לאפשר לכידת תא ותרבות. בגישה זו microstructures בדוגמת כגון חריצים בתוך ערוצי microfluidic המשמשים ליצירת מתח נמוך גזירה אזורים בתוך התא שבו ניתן לעגן.

מכשיר microfluidic עם דפוסי Groove לחקר התנהגות נייד

אנו מציגים שיטה פשוטה לייצר מכשירים המסוגלים החלת תנאים דינמיים דומים לזנים שונים מרובים microfluidic, ללא צורך בחדר נקי או ליתוגרפיה הרכה.

מכשיר microfluidic ללימוד זני Distinct מרובים

מקור: קאבין, מ. ט. ואחרים. ניתוח מיקרופלואידי חד-תאי של Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (2018)הסרטון מדגים את השימוש במכשיר מיקרופלואידי לצפייה בצמיחת חיידקים ברמת התא היחיד. הוא מראה כיצד תאי חיידקים לא ניידים, הכלואים בתעלות בקנה מידה מיקרו, מוזנים ומתוחזקים באופן רציף תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ההגדרה מאפשרת ויזואליזציה בזמן אמת של חלוקת תאים ומעקב אחר שושלת לאורך דורות שונים.

מעקב אחר צמיחת חיידקים ברזולוציית תא יחיד במערכת מיקרופלואידית

בפרוטוקול זה מוצג הייצור, ההתקנה והתפעול הבסיסי של ביו-ריאקטור פיקוליטר מיקרופלואידי (PLBR) לניתוח תאים בודדים של מיקרואורגניזמים פרוקריוטיים. מיקרואורגניזמים רלוונטיים מבחינה תעשייתית נותחו כהוכחה עקרונית המאפשרת תובנות לגבי קצב גדילה, מורפולוגיה והטרוגניות פנוטיפית על פני תקופות זמן מסוימות, בקושי אפשרי בשיטות קונבנציונליות.

ביו-ריאקטור מיקרו-נוזלי פיקוליטר לניתוח מיקרוביאלי של תאים בודדים: ייצור, הגדרת מערכת ותפעול

אנו מדגימים מבוססי assay מיקרופלואידיקה כדי למדוד את הזמנים לתאים למעבר דרך רצף של אילוצי מיקרון בקנה מידה.

טכניקת Microfluidic לחקור deformability הסלולרי

התקנים מיקרו-מיוצרים המשולבים עם רכיבים נוזליים מספקים פלטפורמה במבחנה למחקרי תאים המחקים את המיקרו-סביבה in vivo. פיתחנו שבבים מיקרופלואידיים מבוססי פולימתיל-מתאקרילט לחקר תגובות תאיות תחת גירוי מתח כימי/חשמלי/גזירה יחיד או קיים.

עיצוב מכשירי microfluidic ללימוד ותגובות ניידות תחת בית או להתאבדות כימית / חשמל / שאר מתח גירויים

אנו מציגים שיטה לניתוח microfluidic של שושלות בודדים תא החיידק Bacillus subtilis כדוגמא. השיטה מתגבר על החסרונות של שיטות אנליטיות מסורתי במיקרוביולוגיה בכך שהוא מאפשר התבוננות של מאות דורות תא תחת תנאי הגידול בחוזקה לשליטה ואחידה.

ניתוח Microfluidic תא בודד של Bacillus subtilis

אנו מתארים שיטה לבניית התקנים לתרבות תלת-ממדית ולניסויים בתאים ובאורגנואידים רב-תאיים. התקן זה מאפשר ניתוח של תגובות הסלולר אותות מסיסים בסביבות תלת-ממד עם מעברי צבע כימותסטנט מוגדרים. אורגנואידים הם טובים יותר מאשר תאים בודדים בזיהוי של כניסות רעש חלש.

ניתוח תלת-מימד של תגובות מרובות-סלולר לקבוצת מעברי כימוסטנט

כאן, אנו מספקים שבב microfluidic ומערכת מיקרופלואידית במחזור מבוקרת ויעילה מאוד באופן אוטומטי, כי מסכם את microenvironment הראשונית של neovascularization, המאפשר לתאי אנדותל (ECs) להיות מגורה על ידי מתח גזירה זוהר גבוה, רמה פיזיולוגית של זרימה transendothelial, גורם צמיחה אנדותל כלי דם שונים (VEGF) הפצה בו זמנית.

מודל מיקרופלואידי לחקות אירוע ראשוני של ניאו-סקולריזציה

בשל האטימות של האדמה, לא ניתן לדמיין בקלות אינטראקציות בין המיקרובים המרכיבים אותה עם רזולוציה תאית. כאן מוצגים שני כלים מיקרופלואידיים, המציעים הזדמנויות חדשות לחקר אינטראקציות פטרייתיות-מיקרוביאליות. המכשירים הם רב-תכליתיים ופשוטים לשימוש, ומאפשרים שליטה מרחבית-טמפורלית גבוהה והדמיה ברזולוציה גבוהה ברמה התאית.

כלים מיקרופלואידיים לחקר אינטראקציות פטרייתיות-מיקרוביאליות ברמה התאית

פרוטוקול זה מפרט את התכנון והייצור של מכשיר מיקרופלואידי, המתאים לחקירת מכניקת פולימרים מיקרו-צינוריים. הסינתזה של מיקרו-ייצור, בקרת זרימה אוטומטית וטכניקות מידול חישוביות מאפשרת מערכת גמישה המתאימה באופן אידיאלי לחקירת השלד התאי במבחנה.

פיתוח גישה מבוססת מיקרופלואידיקה לחקר מכניקת פולימרים מיקרו-צינוריים

חקור את יכולת ההתארכות של תאי צמחים הגדלים עצה דרך פערים צרים במכשיר מיקרו-זורם. השיטה מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של תהליכי עיוות תאים בקנה מידה מיקרומטרי.

פיתוח Microfluidic ללמוד את היכולת התארכות של תאי צמחים הגדלים עצה בחללים קטנים מאוד

גלה סרטונים נוספים