פיתוח Microfluidic ללמוד את היכולת התארכות של תאי צמחים הגדלים עצה בחללים קטנים מאוד
22 במאי 2018
אנו מתארים שיטה כדי לחקור את היכולת של עצה גידול תאי צמחים, כולל אבקה צינורות, שערות השורש, וטחב protonemata, להאריך להידחק למרווחים צרים מאוד (~ 1 מיקרומטר) במכשיר microfluidic.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של תאי הצמח, כגון כיצד תאי צמחים הגדלים חודרים למחסומים הפיזיים של התא. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהה הבונות מחדש את תהליך העיוות של התא בפער בקנה מידה מיקרומטרי תחת מיקרוסקופ קונבנציונאלי. כדי ליצור מכשיר לבחינת צינורות האבקה הגדלים ופרוטונמטת הטחב, הכינו תחילה כ-11 גרם של PDMS, וטענו אותו לתבנית בגודל ארבעה אינץ'.
לאחר מכן, הסירו את התבנית למשך 20 דקות בתא ואקום. לאחר מכן, רפאו את התבנית בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. לאחר הריפוי, קלף את שכבת ה-PDMS מהתבנית, ופתח את חורי הגישה לתעלה בתוך ה-PDMS באמצעות כלי ניקוב ביופסיה.
לאחר מכן, חשוף את ה-PDMS ואת צלחת הזכוכית של חמישה סנטימטרים לפלזמת אוויר למשך 50 שניות. כדי לאטום את הרשת המיקרופלואידית, לחץ את שכבת ה-PDMS על צלחת הזכוכית, ורפא אותה במשך 30 דקות ב-65 מעלות צלזיוס. לייצור מיקרו-מכשיר המיועד לבדיקת שיער שורש, נטענות ומרפאות שתי תבניות.
בעת ניקוב חורי התעלה, השתמש באגרוף של שני מילימטרים. לאחר חשיפת שתי השכבות לפלזמת אוויר למשך 50 שניות, חבר אותן יחד, כולל כיסוי, תחת סטריאומיקרוסקופ. השתמש בכלי קשתיות היישור המותאם אישית כדי להשיג זאת.
רפאו את המכלול למשך 30 דקות בתנור כדי לאטום את הרשת המיקרופלואידית. לאחר הריפוי, הסר את הכיסוי מהמכשיר והעביר אותו לכלי זכוכית של חמישה סנטימטרים. לפני השימוש במיקרו-מכשיר צינור האבקה, יש להוציא אותו בתא ואקום למשך 20 דקות.
הוסף מצע גידול לכניסת העלי באמצעות מיקרופיפטה עדינה. טען את הבארות האחרות באותו מדיום. אפשר כמה דקות למילוי הערוצים.
בינתיים, הניחו מגבת נייר לחה בכלי כדי לסייע בשמירה על הלחות המקומית. כעת, אספו גרגרי אבקה מפרח כחול ולבן T.fournieri. העבירו את הגרגירים אל הצלקת בעזרת מחט חיתוך.
לאחר מכן, חותכים סגנון האבקה באורך סנטימטר אחד לאורכו, ולאחר מכן מכניסים את סגנון החיתוך לכניסה של המכשיר המיקרופלואידי. כאשר סגנון החיתוך מוחדר לכניסה של מכשיר מיקרופלואידית עם פינצטה, חשוב לא להחזיק את הסגנון חזק מאוד מכיוון שהוא עלול לפגוע בסגנון. לאחר מכן, מהדקים מכסה על הכלי באמצעות סרט, ומעבירים את המנה לחממה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס, שם עליה להישאר בחושך במשך חמש עד שש שעות.
בעבודה מתחת למכסה זרימה למינרית, התחל בעיקור זרעי קולומביה מהונדסים A.thaliana. משרים אותם בתמיסת ניקוי למשך חמש דקות. לאחר מכן, שטפו היטב את הזרעים במים חיטוי.
לאחר העיקור, אחסן את הזרעים בארבע מעלות צלזיוס בחושך למשך 48 שעות. כמה ימים לאחר מכן, הסר את המיקרו-מכשיר למשך 20 דקות לפני השימוש בו. לאחר מכן, טען את מדיום הגידול המתאים לבארות המכשיר באמצעות פיפטה בעלת קצה דק, והמתן מספר דקות עד שהפתרון יימשך דרך כל הערוצים.
כמו כן, העמיסו מעט מגבת נייר לחה על הכלי כדי לשמור על הלחות. כעת, העבירו זרע מוכן לכניסת המכשיר. לאחר מכן, הדקו את המכסה באמצעות סרט, והעבירו את המנה לאינקובטור של 22 מעלות צלזיוס עם אור רציף.
לפני השימוש בו, יש לעקר את המיקרו-מכשיר תחת UV למשך הלילה. למחרת, הסר את המיקרו-מכשיר למשך 20 דקות. לאחר הסרת הגז, טען את המיקרו-בארות במצע הגידול המתאים.
בזמן שהתעלות מתמלאות בהדרגה, הקיפו את המיקרו-מכשיר במעט מים שעברו חיטוי כדי לשמור על לחות. העבירו חתיכה קטנה של רקמת פרוטונמטה אזוב לכניסה של המיקרו-מכשיר. כעת, תרבית את המכשיר ב -25 מעלות צלזיוס באור מתמשך.
לאחר שבועיים-שלושה של צמיחה, צלם תמונות שדה בהיר של התוצאות תחת מיקרוסקופ. תאי צמחים הגדלים בקצה נתקלים בסדרה של מחסומים פיזיים לאורך נתיבי הצמיחה שלהם in vivo, כמו במערכת ההעברה ובמיקרופיל, שלא לדבר על נתיב שערות השורש באדמה. פלטפורמות תרבית התאים המיקרופלואידיות המוצגות במבחנה מאפשרות לבחון את תהליך גידול הקצה בשלושה סוגים של תאי צמחים, צינורות אבקה, שערות שורש ופרוטונמטת טחב.
הצפייה מתבצעת באמצעות מרווחים של מיקרון אחד במכשירים. מכיוון שמיקרו-פערים בגודל זה הם שבירים, לפעמים הם ייסגרו, במיוחד לאחר שימוש חוזר. לפיכך, חשוב לוודא שהפערים שלמים לפני ביצוע הניסויים.
עבור מחקר צינור האבקה, נעשה שימוש בהדמיית תאים חיים כדי לנטר שינויים מורפולוגיים באזור האפיקלי של צינורות האבקה, כמו גם הגרעין הצמחי ותאי הזרע בתגובה למפגש עם חלל קטן במיוחד. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של תאי הצמח לחקור את יכולת ההתארכות של תאי צמחים הגדלים בקצוות, כגון צינורות אבקה, שערות שורש ופרוטונמטת טחב בחלל קטן במיוחד.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה לבחינת יכולת ההתארכות של תאי צמחים הגדלים מקצה התא (tip-growing), כגון צינורות צמחים (pollen tubes) ופרוטונמות של טחב, דרך מרווחים צרים במכשיר מיקרופלואידי. טכניקה זו מאפשרת דימוי ברזולוציה גבוהה של תהליכי דפורמציה של תאים בקנה מידה מיקרומטרי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של תאי צמחים
- מיקרופלואידיקה
- מכניקה תאית
רקע
- תאי צמחים בעלי צמיחה קטטלית (Tip-growing) ממלאים תפקיד מכריע בהתפתחות הצמח.
- הבנת האופן שבו תאים אלה חודרים מחסומים פיזיים חיונית לקידום הביולוגיה של הצמחים.
- התקנים מיקרופלואידיים יכולים לדמות סביבות צפופות למחקר תאים.
- טכניקות דימות ברזולוציה גבוהה חיוניות לצפייה בתהליכים תאיים.
מטרת המחקר
- לבחון את היכולת של תאי צמחים הגדלים בקצה להתארך דרך מרווחים צרים.
- לספק תובנות לגבי מנגנוני חדירת תאים דרך מחסומים.
- לפתח שיטה אמינה לחקר דפורמציה של תאים בסביבות מבוקרות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת התקן מיקרופלואידי מ-PDMS.
- ניקוי בועות גז (Degassing) מהתבנית בתא ואקום.
- הקשחה של ה-PDMS בטמפרטורה של 65 °C.
- יצירת חורי גישה ב-PDMS באמצעות כלי דגימה (biopsy punch).
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת בהצלחה תצפית על צינורות של פולן ועל פרוטונמות של טחב.
- תמונות ברזולוציה גבוהה חושפות את תהליכי העיוות של התאים.
- תאים יכולים להתארך דרך פערים קטנים עד כדי 1 µm.
- הטכניקה מספקת נתונים בעלי ערך להבנת התנהגות תאים במרחבים מוגבלים.
מסקנות
- שיטה זו משפרת את ההבנה של תאי צמחים בעלי גדילה קטטית (tip-growing).
- היא מציעה גישה חדשה לחקר מכניקה תאית בביולוגיה של צמחים.
- לממצאים עשויות להיות השלכות על מחקר חקלאי וביולוגי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
לימוד התנהגותן של תאי צמחים בעלי צמיחה קטטלית (tip-growing) בסביבות עם מגבלות פיזיות מספק תובנות מכניסטיות לגבי הסתגלות תאית תחת מאמץ מכני, דבר הרלוונטי להבנת ויסות הצמיחה ברקמות מורכבות. פלטפורמה מיקרופלואידית זו מאפשרת ויזואליזציה ברזולוציה גבוהה של דינמיקה סוב-צלולית במהלך חדירה דרך מחסום, ובכך תומכת בבדיקת היפותזות במכניקה תאית ובמידול חזוי של תגובות צמיחה. גישה זו מציעה מערכת in vitro ניתנת להרחבה להפחתת סיכונים באימות יעדים במסלולי התפתחות של צמחים, על ידי קישור מגבלות פיזיות למדדים מולקולריים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר לבחון כיצד מגבלות פיזיות משפיעות על דינמיקת הצמיחה של הקצה ועל ארגון מחדש תת-תאי בתאים חיים.
- ערך תפעולי: מספק פלטפורמה הניתנת לשחזור להקבלה בין גודל המרווח לבין שיעורי הצלחת ההארכה בסוגי תאים שונים.
- ערך ניבוי: תומך בהסרת סיכונים מכניסטיים על ידי חשיפה השאלה האם נדרשים שינויים במיקום הגרעין או בשלד התא למעבר דרך מחסום.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר תוצאות כמותיות לגבי יעילות החדירה ושינויים מורפולוגיים תחת הגבלה מבוקרת בקנה מידה מיקרוני.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של ממדי המרווח (למשל, ~1 µm) כדי להבטיח עקביות של הבדיקה בין ניסויים ומעבדות שונות.
- יכולת הרחבה: מאפשר בדיקה מקבילה של מספר קווי תאים או וריאנטים גנטיים ברשתות מיקרופלואידיות זהות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר בין תגובות תאיות למעמסה פיזיקלית לבין סמנים ביולוגיים פוטנציאליים של הסתגלות או כישלון בצמיחה.
- ערך תפעולי: מאפשר מעקב בשיטת time-lapse אחר רכיבים המסומנים פלואורסצנטית (למשל, גרעין, תאי זרע) כדי להקרין בין שינויים מבניים לתוצאות תפקודיות.
- ביטחון חיזוי: מספק אנלוג של מערכת רלוונטית למחלה לבחינת האופן שבו תאים מנווטים בסביבות מיקרו-מגבילות, בדומה לחדירה למטריצה extracelluar במערכות של יונקים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
בדיקת ההארכה מיקרופלואידית משתלבת בתהליכי עבודה של תגליות מוקדמות, שבהם הבנת התגובות התאיות לרמזים פיזיים מסייעת בבחירת מטרה ובתיקוף של מסלולים.
- ביולוגיה של הגילוי: מסייעת בבדיקת השערות לגבי האופן שבו הגבלה מכנית משנה את קינטיקת הצמיחה של הקצה ואת התעבורה התוך-תאית.
- סריקה: מספקת תוצאות סטנדרטיות וכמותיות על עיוות תאים והצלחת מעבר עבור מחקרי הפרעה גנטית או תרכובים.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה של קצבי התארכות, העתקת הגרעין והתאוששות הצורה כמשתנים תלויים להשוואת תנאים.
- מחקר תרגומי: מספקת מערכת רלוונטית למחלות למידול האופן שבו תאים מסתגלים למגבלות מרחביות, ובכך תומכת בהסקה לפנוטיפים של צמיחה פולשנית.
- שימוש חוזר ארגוני: פלטפורמות PDMS-זכוכית בעלות יכולת שימוש חוזר מאפשרות מחקרים אורכיים וסטנדרטיזציה בין פרויקטים בסריקות של מכנוביולוגיה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות בקישור בין גירויים פיזיים לתגובות תאיות על ידי אפשור תצפית ישירה על תהליכי דפורמציה.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות באמצעות שלבי ייצור סטנדרטיים, חיבור בפלסמה ואימות מרווחים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go בתיקוף מטרות על ידי הבהרה האם פגמי גדילה שנצפו נובעים מיכולת פנימית או מהתנגדות של מחסום חיצוני.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בתיעדוף מטרות מותאם סיכון בהתבסס על עמידותן למאמץ מכני בסביבות מיקרו מוגבלות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתכנון מיקרופלואידי, טיפול ב-PDMS וטכניקות סטריליות לתרבית תאים.
- תלוי בגישה לציוד להוצאת אוויר בוואקום, מערכות לטיפול בפלזמה וכלי ניקור מדויקים ליצירת תעלות.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים לאימות שלמות הרווח לפני כל ניסוי כדי למנוע תוצאות שגויות שליליות.
- כולל שיקולי התאמה בעת העברת המערכת בין צינורות של אבקה, שערות שורש ופרוטונמות של טחב, בשל קצבי צמיחה שונים ודרישות שונות למצע.
- מוגבל על ידי השבירות של רווחים תת-מיקרוניים, העשויים לעוות או להיסגר לאחר שימוש חוזר, מה שמחייב בדיקה שגרתית.
שאלות נפוצות בנושאי ביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:28
Fabricating the PDMS Microdevices
2:11
In Vitro Culturing of T. fournieri Pollen Tubes in the Microdevice
3:31
In Vitro Culturing of A. thaliana Root Hairs in the Microdevice
4:40
In Vitro Culturing of P. patens (moss) Protonemata in the Microfluidic Device
5:31
Results: Microfluidic Device Design and Time-lapse Imaging of Pollen Tube Growth
6:37
Conclusion
