May 22nd, 2018
אנו מתארים שיטה כדי לחקור את היכולת של עצה גידול תאי צמחים, כולל אבקה צינורות, שערות השורש, וטחב protonemata, להאריך להידחק למרווחים צרים מאוד (~ 1 מיקרומטר) במכשיר microfluidic.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של תאי הצמח, כגון כיצד תאי צמחים הגדלים חודרים למחסומים הפיזיים של התא. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהה הבונות מחדש את תהליך העיוות של התא בפער בקנה מידה מיקרומטרי תחת מיקרוסקופ קונבנציונאלי. כדי ליצור מכשיר לבחינת צינורות האבקה הגדלים ופרוטונמטת הטחב, הכינו תחילה כ-11 גרם של PDMS, וטענו אותו לתבנית בגודל ארבעה אינץ'.
לאחר מכן, הסירו את התבנית למשך 20 דקות בתא ואקום. לאחר מכן, רפאו את התבנית בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. לאחר הריפוי, קלף את שכבת ה-PDMS מהתבנית, ופתח את חורי הגישה לתעלה בתוך ה-PDMS באמצעות כלי ניקוב ביופסיה.
לאחר מכן, חשוף את ה-PDMS ואת צלחת הזכוכית של חמישה סנטימטרים לפלזמת אוויר למשך 50 שניות. כדי לאטום את הרשת המיקרופלואידית, לחץ את שכבת ה-PDMS על צלחת הזכוכית, ורפא אותה במשך 30 דקות ב-65 מעלות צלזיוס. לייצור מיקרו-מכשיר המיועד לבדיקת שיער שורש, נטענות ומרפאות שתי תבניות.
בעת ניקוב חורי התעלה, השתמש באגרוף של שני מילימטרים. לאחר חשיפת שתי השכבות לפלזמת אוויר למשך 50 שניות, חבר אותן יחד, כולל כיסוי, תחת סטריאומיקרוסקופ. השתמש בכלי קשתיות היישור המותאם אישית כדי להשיג זאת.
רפאו את המכלול למשך 30 דקות בתנור כדי לאטום את הרשת המיקרופלואידית. לאחר הריפוי, הסר את הכיסוי מהמכשיר והעביר אותו לכלי זכוכית של חמישה סנטימטרים. לפני השימוש במיקרו-מכשיר צינור האבקה, יש להוציא אותו בתא ואקום למשך 20 דקות.
הוסף מצע גידול לכניסת העלי באמצעות מיקרופיפטה עדינה. טען את הבארות האחרות באותו מדיום. אפשר כמה דקות למילוי הערוצים.
בינתיים, הניחו מגבת נייר לחה בכלי כדי לסייע בשמירה על הלחות המקומית. כעת, אספו גרגרי אבקה מפרח כחול ולבן T.fournieri. העבירו את הגרגירים אל הצלקת בעזרת מחט חיתוך.
לאחר מכן, חותכים סגנון האבקה באורך סנטימטר אחד לאורכו, ולאחר מכן מכניסים את סגנון החיתוך לכניסה של המכשיר המיקרופלואידי. כאשר סגנון החיתוך מוחדר לכניסה של מכשיר מיקרופלואידית עם פינצטה, חשוב לא להחזיק את הסגנון חזק מאוד מכיוון שהוא עלול לפגוע בסגנון. לאחר מכן, מהדקים מכסה על הכלי באמצעות סרט, ומעבירים את המנה לחממה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס, שם עליה להישאר בחושך במשך חמש עד שש שעות.
בעבודה מתחת למכסה זרימה למינרית, התחל בעיקור זרעי קולומביה מהונדסים A.thaliana. משרים אותם בתמיסת ניקוי למשך חמש דקות. לאחר מכן, שטפו היטב את הזרעים במים חיטוי.
לאחר העיקור, אחסן את הזרעים בארבע מעלות צלזיוס בחושך למשך 48 שעות. כמה ימים לאחר מכן, הסר את המיקרו-מכשיר למשך 20 דקות לפני השימוש בו. לאחר מכן, טען את מדיום הגידול המתאים לבארות המכשיר באמצעות פיפטה בעלת קצה דק, והמתן מספר דקות עד שהפתרון יימשך דרך כל הערוצים.
כמו כן, העמיסו מעט מגבת נייר לחה על הכלי כדי לשמור על הלחות. כעת, העבירו זרע מוכן לכניסת המכשיר. לאחר מכן, הדקו את המכסה באמצעות סרט, והעבירו את המנה לאינקובטור של 22 מעלות צלזיוס עם אור רציף.
לפני השימוש בו, יש לעקר את המיקרו-מכשיר תחת UV למשך הלילה. למחרת, הסר את המיקרו-מכשיר למשך 20 דקות. לאחר הסרת הגז, טען את המיקרו-בארות במצע הגידול המתאים.
בזמן שהתעלות מתמלאות בהדרגה, הקיפו את המיקרו-מכשיר במעט מים שעברו חיטוי כדי לשמור על לחות. העבירו חתיכה קטנה של רקמת פרוטונמטה אזוב לכניסה של המיקרו-מכשיר. כעת, תרבית את המכשיר ב -25 מעלות צלזיוס באור מתמשך.
לאחר שבועיים-שלושה של צמיחה, צלם תמונות שדה בהיר של התוצאות תחת מיקרוסקופ. תאי צמחים הגדלים בקצה נתקלים בסדרה של מחסומים פיזיים לאורך נתיבי הצמיחה שלהם in vivo, כמו במערכת ההעברה ובמיקרופיל, שלא לדבר על נתיב שערות השורש באדמה. פלטפורמות תרבית התאים המיקרופלואידיות המוצגות במבחנה מאפשרות לבחון את תהליך גידול הקצה בשלושה סוגים של תאי צמחים, צינורות אבקה, שערות שורש ופרוטונמטת טחב.
הצפייה מתבצעת באמצעות מרווחים של מיקרון אחד במכשירים. מכיוון שמיקרו-פערים בגודל זה הם שבירים, לפעמים הם ייסגרו, במיוחד לאחר שימוש חוזר. לפיכך, חשוב לוודא שהפערים שלמים לפני ביצוע הניסויים.
עבור מחקר צינור האבקה, נעשה שימוש בהדמיית תאים חיים כדי לנטר שינויים מורפולוגיים באזור האפיקלי של צינורות האבקה, כמו גם הגרעין הצמחי ותאי הזרע בתגובה למפגש עם חלל קטן במיוחד. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של תאי הצמח לחקור את יכולת ההתארכות של תאי צמחים הגדלים בקצוות, כגון צינורות אבקה, שערות שורש ופרוטונמטת טחב בחלל קטן במיוחד.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
מאמר זה מתאר שיטה לחקירת יכולת הארכה של תאי צמח שגדלים בקצה, כגון צינורות אבקה ופרוטו-נמטות של טחב, דרך פערים צרים במכשיר מיקרו-נוזלי. הטכניקה מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של תהליכי עיוות התאים בקנה מידה מיקרומטרי.
Studying tip-growing plant cell behavior in physically constrained environments provides mechanistic insights into cellular adaptation under mechanical stress, relevant for understanding growth regulation in complex tissues. This microfluidic platform enables high-resolution visualization of subcellular dynamics during barrier penetration, supporting hypothesis testing in cellular mechanics and predictive modeling of growth responses. The approach offers a scalable in vitro system to de-risk target validation in plant developmental pathways by linking physical constraints to molecular readouts.
The microfluidic elongation assay fits within early discovery workflows where understanding cellular responses to physical cues informs target selection and pathway validation.