אופטימיזציה של השימוש של רובוט טיפול נוזלי לנהל גבוהה תפוקה קדימה כימי גנטיקה מסך של תודרנית לבנה

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לבצע סקר גנטיקה כימית בתפוקה גבוהה קדימה על שתילי Arabidopsis. בשיטה זו אנו יכולים לגלות ביעילות וביעילות מולקולות קטנות חדשות המשפיעות על הפיזיולוגיה של הצמח. תגליות אלו יספקו את הבסיס למחקרים נוספים בתהליכים פיזיולוגיים, כגון סינתזת דופן התא.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לסנן עשרות אלפי מולקולות קטנות בפרק זמן קצר. אף על פי שפרוטוקול זה מיועד למין צמח המודל Arabidopsis, ניתן להתאים אותו בקלות לאורגניזמים אחרים, כגון חרקים, מיקרואורגניזמים או תרבית תאים. הרעיון לפרוטוקול הזה עלה לנו לראשונה כשלמדנו שהמרכז הגנומי של האוניברסיטה צריך למצוא בית לרובוט לטיפול בנוזלים עודפים.

מיד התנדבנו להוריד את זה מהידיים שלהם. הכן את ספריית הדילול ואת Multichannel Tip Wash Automated Labware Positioner או ALP כמתואר בפרוטוקול הטקסט. טען ידנית את ה-Stacker 10s המחוברים לקרוסלת המערם.

במלונות A עד D, טען תחילה קופסה אחת של קצות פיפטה AP96 P20 בחדר 1. לאחר מכן, טען ארבע צלחות V תחתונות של 96 בארות בחדרים 2 עד 5 עם שתי לוחות עליונים המכילים ריכוזי מלאי מהספרייה המסודרת ושתי הלוחות התחתונים האחרים ריקים. בנוסף, טען קופסה אחת של קצות פיפטה AP96 P20 בחדר שש.

טען ארבע צלחות תחתונות V בעלות 96 בארות בחדרים שבע עד תשע כאשר שתי הלוחות העליונים מכילים ריכוזי מלאי של הספרייה המסודרת ושתי הלוחות התחתונים ריקים. הגדר את הסיפון עם 300 מיליליטר מים במאגר ב-P3, אמבט אתנול של 300 מיליליטר 70% ב-P7, ה-Tip Loader ALP וה-Multichannel Tip Wash ALP. באמצעות תוכנת ההפעלה של הרובוט לטיפול בנוזלים, הצג קצות פיפטה AP96 P20 מה-Stacker 10 והעבר אותם ל-Tip Loader ALP.

הציגו את חדר 2 ממלון A והפרידו את כל ארבעת לוחות ה-V התחתונים עם 96 בארות על הסיפון, והניחו את השניים התחתונים על P4 ו-P8 ואת השניים העליונים על P5 ו-P9. טען את קצות הפיפטה AP96 P20 עם ה-Tip Loader ALP על ראש 96 ערוצים בנפח 200 מיקרוליטר. שאפו 90 מיקרוליטר ממאגר המים של 300 מיליליטר והוציאו לתוך צלחת הדילול של 96 בארות עם תחתית V ב-P4. חזור על השלב עבור הצלחת ב- P8. מערבבים את לוחית הספרייה הכימית על P5 על ידי שאיבה חוזרת ונשנית של 15 מיקרוליטר שלוש פעמים. בנוסף, שאפו 10 מיקרוליטר מלוח הספרייה הכימית ב-P5 והוציאו 10 מיקרוליטר לתוך לוחית הדילול ב-P4. מערבבים את תמיסות הצלחת ב-P4 על ידי שאיבה חוזרת ונשנית של 50 מיקרוליטר בסך הכל שלוש פעמים.

לאחר הערבוב, נקו את קצות הפיפטה AP96 P20 על ידי שאיבה והוצאה של 70 מיקרוליטר של 70% אתנול מ-P7, ולאחר מכן שטפו אותם ב-Multichannel Tip Wash ALP על ידי שאיבה והוצאה של 110% נפח מים ארבע פעמים. חזור על שלבים אלה עבור זוג הלוחות השני ב- P8 ו- P9. עם יצירת צלחת הדילול השנייה עם 96 בארות V-bottom, ערמו את לוחות P9, P5, P8 ו-P4 בסדר זה מלמטה למעלה. לאחר מכן, מקם את המחסנית על ALP סטטי ריק אחד.

השתמש ב- P1, P2, P6, P10, P11, P12 או P13. חזור על שלבים אלה עד שחדר חמש במלון A יתרוקן, ולאחר מכן התחל את התהליך שוב עם ההגעה לחדר שש, העבר את קצות הפיפטה החדשים של AP96 P20 ל-Tip Loader ALP והנח את קצות הפיפטה המשומשים AP96 P20 על ALP סטטי ריק. חזור על ההליך עד שחדר 9 במלון A יתרוקן.

על מנת להמשיך למלון B, יש לטעון מחדש את הצלחות והטיפים על הסיפון למלון A.למרות שהרובוט יכול לעבוד ללא השגחה, יש צורך למלא מחדש את מאגר המים לאחר כל מחזור דילול. אם המחזור יתחיל מחדש עם מים לא מספיקים, הרובוט ישאב אוויר והכימיקלים לא ידוללו. מלא ידנית את מאגר המים בנפח 300 מיליליטר.

תוכנת המחשב יכולה לשלב הפסקה המפרטת הודעה זו, המחייבת את המשתמש ללחוץ על המשך לפני ביצוע השלב הבא. חזור על שלבי הדילול עבור שלושת המלונות הנותרים. הוסף ידנית זרעים למדיה בצפיפות של 0.1 גרם ל 100 מיליליטר.

צפיפות זו מביאה לממוצע של 3-10 זרעים לבאר של צלחת של 96 בארות. הנח ידנית ארבע צלחות עם תחתית שטוחה של 96 בארות בחדרים 1 ו-2 של מלון A.הנח קופסה של קצות פיפטות AP96 P250 על מעמיס הקצה ALP, מאגר של 300 מיליליטר מלא בתערובת זרעי המדיה ב-P3, ומאגר של 300 מיליליטר מלא באתנול 70% ב-P7. באמצעות תוכנת ההפעלה, הציגו את חדרים 1 ו-2 במלון A והפרידו את ערימות ארבע הלוחות. הנח צלחת אחת על כל אחד מה-ALPs הסטטיים הריקים, ולאחר מכן טען את קצות הפיפטה AP96 P250 על ראש 96 ערוצים של 200 מיקרוליטר.

שאפו 90 מיקרוליטר ממאגר זרעי המדיה בנפח 300 מיליליטר ב-P3 והוציאו אותו לצלחת התחתונה השטוחה הראשונה של 96 בארות. חזור על תהליך זה עד שכל שמונה הצלחות מכילות את תערובת זרעי המדיה. נקה את קצות הפיפטה AP96 P250 על ידי שאיבה והוצאה של 70 מיקרוליטר ממאגר ה-300 מיליליטר המלא ב-70% אתנול ב-P7. שטפו את הקצוות ב-Multichannel Tip Wash ALP על ידי שאיבה והוצאה של 110% נפח מים ארבע פעמים, ולאחר מכן פרקו את הקצוות ב-TL1.

לבסוף, אספו את הצלחות ביד. טען ידנית קופסה של קצות פיפטה AP96 P250 לחדר הראשון של מלון A.כמו כן, טען שתי צלחות ספריית דילול תחתית V של 96 בארות לחדרים שתיים, ארבע, שש ושמונה. טען שתי לוחות סינון עם תחתית שטוחה של 96 בארות לחדרים שלוש, חמש, שבע ותשע.

באמצעות תוכנת ההפעלה, הגדר את הסיפון כך שיכיל מאגר שטיפה של 300 מיליליטר של 70% אתנול ב-P7. ניתן להשאיר את מאגר זרעי המדיה על הסיפון ב-P3. בנוסף, הפעל את כונן הקונסולה באמצעות חיבור בקר ההתקן כדי להזרים מים דרך Multichannel Tip Wash ALP. פעולה זו תכבה באופן אוטומטי בסוף הפרוטוקול. הציגו את קופסת קצה הפיפטה AP96 P250 ממלון A והעבירו אותה ל-Tip Loader ALP.

לאחר מכן, הציגו את לוחות ספריית הדילול של 96 בארות V מחדר 2 של מלון A לסיפון. הנח צלחת אחת על ALP P4 סטטי וצלחת אחת על P8. לאחר מכן, הציגו את לוחות ההקרנה עם 96 בארות עם תחתית שטוחה מחדר 3 של מלון A לסיפון. הנח צלחת אחת על ALP P5 סטטי ואחת על P9. טען את קצות הפיפטה AP96 P250 עם ה-Tip Loader ALP על ראש 96 ערוצים של 200 מיקרוליטר.

מערבבים את צלחת הדילול התחתונה V עם 96 בארות ב-P4 על ידי שאיבה וחלוקה של 50 מיקרוליטר שלוש פעמים. לאחר מכן, שאפו 10 מיקרוליטר מהצלחת הזו והוציאו לתוך צלחת הסינון התחתונה השטוחה עם 96 בארות ב-P5. מערבבים את התמיסות בצלחת ב-P5 על ידי שאיבה וחלוקה של 50 מיקרוליטר שלוש פעמים. נקה את קצות הפיפטה AP96 P250 עם אתנול על ידי שאיבה וחלוקה של 70 מיקרוליטר של 70% אתנול מהמאגר ב-P7. לאחר מכן, שטפו את הקצוות ב-Multichannel Tip Wash ALP על ידי שאיבה והוצאה של 110% נפח מים ארבע פעמים.

חזור על שלבים אלה עבור צלחת ספריית הדילול השנייה של 96 בארות V וצלחת הקרנה עם תחתית שטוחה של 96 בארות. ערמו את שתי צלחות ספריית הדילול בתחתית V עם 96 בארות יחד ואת שתי לוחות ההקרנה עם תחתית שטוחה של 96 בארות יחד. העבר את הלוחות ל- ALPs הסטטיים.

לאחר מכן, חזור על התהליך שלוש פעמים, הוסף כימיקלים מדוללים לצלחות ההקרנה בסך הכל שמונה פעמים. לבסוף, בדוק את מספר הזרעים בכל באר של לוחות ההקרנה באמצעות אישור חזותי. השלם את הבארות בפחות משלושה זרעים על ידי תוספת זרעים מעוקרים וורנליים.

חשוב לוודא שהמדיה בה גדלים השתילים לא תתייבש, מכיוון שהדבר יביא לנביטה לקויה. יש לשמור צלחות המכילות שתילים בלחות גבוהה או לאחסן במיכלים עמידים בפני ייבוש. דגרו את לוחות הסינון עם 96 בארות עם תחתית שטוחה למשך ארבעה ימים בתא סביבתי בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס במחזור אור / חושך של 16/8 במיכל חסין ייבוש.

דמיין את לוחות הסינון עם תחתית שטוחה של 96 בארות תחת מיקרוסקופ מנתח ורשום את כל הפנוטיפים החריגים להמשך חקירה. דוגמאות לפנוטיפים נורמליים וחריגים אינם חריגות מורפולוגיות נראות לעין, שערות שורש חומות, שורש מעוכב, שורש מעוכב קשות, מולבן, ריר ירוק, נביטה לא שלמה וללא נביטה. פנוטיפים גלויים לפי אחוזים מוצגים בתרשים עוגה.

שתילים הראו חריגות במורפולוגיה של שורשים, פיגמנטציה, שערות שורש ונביטה. כלול גם מגוון אחרים, הכוללים ייצור ריר ירוק. לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להגביר מאוד את היעילות והדיוק של מסכים גנטיים כימיים גדולים קדימה.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעקר ולהפוך זרעים לוורנליזציה, למלא מחדש את מאגר המים במהלך שלבי הדילול, לוודא שהדגימות מאוחסנות במיכלים עמידים בפני ייבוש, ושכל ההדמיה נעשית בצלחות עם תחתית שטוחה. בהתאם לתהליך הפיזיולוגי שאתה מעוניין לחקור, ניתן לעקוב אחר הבדיקה הראשונית הזו עם בדיקות נוספות שיעזרו לקבוע את אופן הפעולה של כל כימיקל. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש ברובוט לטיפול בנוזלים כדי לשפר את היעילות והדיוק של מסך גנטי כימי.