הקרנת תפוקה גבוהה ביטוי כמותי וטיהור יישומים לחלבוני ארס רקומביננטי דיסולפיד עשירים הופק ב א coli

המטרה הכוללת של ההליך הבא היא להשתמש בפרוטוקול סינון ביטוי תפוקה גבוהה כדי לכמת באי קולי את רמת החלבונים המסיסים באמצעות רובוט אוטומטי לטיפול בנוזלים. זה מושג על ידי חיסון ראשון.96. תרביות מקדימות היטב עם תאים שעברו טרנספורמציה עם פלסמידים המקודדים את חלבוני היתוך המטרה למחרת, 24 צלחות באר מלאות באמצעי אינדוקציה אוטומטית מחוסנות בתרביות טרום הלילה כדי ליצור ביטוי.

תרביות לאחר הקטיף והקפאת חלבונים מסיסים מתרביות הביטוי מטוהרות לאחר מכן על ידי כרומטוגרפיה של זיקה מתכתית משותקת. בסופו של דבר, ניתן למדוד את רמות המסיסות עבור כל היתוך מטרה שלם כדי לקבוע את תנאי הביטוי האופטימליים לייצור חלבון ויצירת מטרות מוצלחות. מהיתרונות של טכניקה זו של שיטות מסורתיות של יעילות מוגברת, האצווה המוגבלת לקרינת אצווה ופשטות הטיפול בנתונים ומעקב הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית.

השלבים האוטומטיים יכולים להיראות מרתיעים וקשים להבנה בפורמט טקסט בלבד מכיוון שהטקסט אינו משדר את המהירות או הפשטות של ההליך. לאחר הטרנספורמציה של החיידקים, התחל בשימוש באחיזה הרובוטית כדי להניח בצד את המכסה של צלחת האגר הראשונה של 24 בארות. לאחר מכן, השתמש בזרוע הטיפול בנוזלים עם שמונה ערוצים כדי לערבב ואז שאב 50 מיקרוליטר של תערובת טרנספורמציה מצלחת טרנספורמציה של 96 בארות.

הוצא את תערובת הטרנספורמציה בתוך ארבעת הערוצים הראשונים של זרוע הטיפול בנוזל לעמודה הראשונה של לוחית האגר LB ואת הטרנספורמציות בתוך ארבעת הערוצים האחרונים לעמודה השנייה של צלחת האגר LB שטפו את כל הקצוות ביסודיות לאחר החלוקה ולאחר מכן המשיכו להעביר את תערובת הטרנספורמציה מצלחת 96 הבאר לכל הבארות בארבעת העמודים הבאים של לוחית האגר LB עד הצלחת הזו גמורה. לאחר השלמת ההעברה לצלחת הראשונה, החזר את המכסה והתחל בהעברה לצלחת הבאה. לאחר שכל הטרנספורמציות צופו, נער את כל הלוחות למשך דקה אחת ב-1200 סל"ד כדי ליצור התפלגות הומוגנית של תערובת הטרנספורמציה.

לאחר הערבוב, השתמש בזרוע הרב-ערוצית 96 כדי לשאוב 60 מיקרוליטר מתערובת הטרנספורמציה שנותרה מצלחת 96 הבאר ולחלק את התערובת לצלחת באר עמוקה 96 המכילה מרק LB. אטמו את הבאר העמוקה 96 תרביות קדם עם סרט דבק נושם כדי לאפשר אוורור אוורור תרבית, ולאחר מכן הניחו את הצלחת בחממה מטלטלת של 37 מעלות צלזיוס במהירות מקסימלית למשך הלילה. לאחר שתרביות הקדם נמצאות בחממה, סעו את צלחות האגר LB במכסה המנוע עם מכסים כבויים למשך כ -10 דקות.

לאחר מכן הפוך את הצלחות בחממת צלחות של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, השתמש בזרוע הטיפול בנוזלים כדי לשאוב 100 מיקרוליטר מהתרבית המוקדמת למשך הלילה לתוך באר עמוקה 96 צלחת כדי לחסן את תרביות הביטוי בדילול אחד 40, תוך שימוש באותה סכימה כמו קודם, שטיפת זרוע הטיפול בנוזלים ביסודיות בתחנת הכביסה בין כל עמודה של תרביות קדם. בסיום החיסון, הניחו את תרביות הביטוי באינקובטור רועד של 37 מעלות צלזיוס, אטום בדבק נושם למשך ארבע שעות.

לאחר מכן הפחיתו את הטמפרטורה ל -17 מעלות צלזיוס לדגירת לילה. למחרת בבוקר צנטריפוגה את הבאר העמוקה 24 צלחות למשך 10 דקות ב-3000 גרם.השליכו את הסופרנטנט למיכל פסולת המכיל חומר אנטי-מיקרוביאלי, ולאחר מכן הקישו את הצלחות הפוכות על נייר סופג כדי להסיר כל מדיום שיורי כדי לוודא שהתרביות גדלו כהלכה. בדוק אם יש כדורים בבאר העמוקה.

לאחר מכן שאפו 125 מיקרוליטר של מאגר ליזה, והוציאו את המאגר פעמיים לכל באר של הבאר העמוקה 24 צלחות עם ארבעה טיפים לכל באר. כדי להגיע לנפח הסופי של מיליליטר אחד של מאגר ליזה כדי להשעות מחדש את הכדורים, נענע את הצלחות ב-1200 סל"ד למשך חמש דקות. על הרובוט, העבירו את מתלי התאים בחזרה לבארות המתאימות של צלחת באר עמוקה 96 ואחסנו את הלוחות אטומים בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות.

לצורך הדגמה זו, נשתמש בפרוטוקול עם 50 מיקרוליטר של חרוזי ניקל לטיהור חלבוני היתוך המטרה. ראשית יש להפשיר את צלחת הבאר העמוקה 96 באמבט מים למשך כרבע שעה. לאחר מכן להחיות את הליזאטים של התא בחממה הרועדת במהירות מקסימלית למשך 10 דקות נוספות, התרבויות צריכות להיות צמיגות.

לאחר מכן, השתמש בפיפטה ידנית של שמונה ערוצים כדי להוציא DNA ותערובת מגנזיום גופרתי לכל באר של צלחת הבאר העמוקה 96 לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר ו-20 מיליליטר בהתאמה. יש לנער את הצלחת אטומה למשך 15 דקות נוספות, ואז התרבות אמורה להיות לא צמיגה. כדי למנוע סתימת לוחית המסנן במהלך הטיהור, חשוב לבדוק היטב ויזואלית שאף אחד מהליזטים אינו צמיג יותר.

ברובוט לטיפול בנוזלים, השתמש בקצות קדח ברוחב 200 מיקרוליטר כדי לערבב היטב את תמיסת השרף לפני העברת 200 מיקרוליטר של התרחיץ לתוך צלחת הבאר העמוקה 96 המכילה את הליזאט. נענע את צלחת הבאר העמוקה 96 ב-1400 סל"ד וטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי לאפשר כריכה, ולאחר מכן השתמש בקצות הקידוח הרחבים כדי לערבב ולאחר מכן להעביר את מלוא 1200 המיקרוליטר של תמיסת ליזאט שרף ב-200 מיקרוליטר על לוחית המסנן. כעת הפעל את הוואקום למשך כ -30 שניות כדי לסנן את הליזאט דרך הצלחת, ולאסוף את הזרימה בבאר עמוקה.

96 מתחת לבאר העמוקה 96 המכילה את הזרימה דרכה מוסרת מתחת ללוחית המסנן ומאוחסנת על מתלה עד סוף הניסוי. לאחר מכן שטפו את השרף פעמיים עם 800 מיקרוליטר של מאגר קשירה בכל פעם לאחר הכביסה השנייה, השתמשו באחיזה הרובוטית כדי להניח צלחת 96 טרייה, עמוקה ובאר מתחת לצלחת המסנן כדי לאסוף את שטיפת ה-50 מילי-מולרית I midaz. הוסף 150 מיקרוליטר של מאגר כביסה על צלחת המסנן והחל שוב את הוואקום עד שהמאגר יעבור דרך הבאר העמוקה 96 המכילה.

הכביסה מוסרת מתחת לצלחת המסנן ומאוחסנת על מתלה עד לסיום הניסוי. לאחר מכן, לאחר שטיפה פעמיים נוספות עם 800 מיקרוליטר של מאגר כביסה, כפי שהודגם עבור מאגר הכריכה, שטיפות השתמשו באחיזה הרובוטית כדי להעביר את המיקרו-פלייט על שולחן העבודה ולהניח את בלוק ה-SPE וצלחת המסנן בחזרה על גבי המיקרו-צלחת כדי לאסוף את האלוציאן. לאחר מכן הוסף 190 מיקרוליטר של מאגר Elucian לשרף בצלחת המסנן.

לאחר שלוש דקות, החל את הוואקום דקה אחת כדי לאפשר לכל המאגר לעבור. במהירות, בדוק ויזואלית שהנפחים האלוקיאניים נכונים. לבסוף, חסום דגימות של השטיפה והזרימה של Ellucian דרך צלחות לכימות רמת הביטוי המסיס.

נתח תחילה את הצלחת האלוסיאנית ורק במידת הצורך, בדוק את הכביסה הרלוונטית וזרם דרך שברים. נתונים אלה ממחישים תוצאה של אלקטרופורזה ממערכת שבבי מעבדת הקליפר. חלבוני ההיתוך השסועים השלמים מיוצגים על ידי הרצועות העליונות כאשר שברי החלבון השסועים מיוצגים כרצועות התחתונות.

תפוקות ההיתוך עבור כל חלבון מטרה נקבעו כנופלות בטווחים של 0.1 עד שניים, שניים עד 10 ו-10 עד 25 מיקרוגרם לרמות תרבית ליטר, או במקרים מסוימים לא זוהו. הערכת הצלחת ביטוי החלבון על ידי מספר קשרי הדיססולפיד הקיימים בכל מקטע חלבון היתוך מדגימה הצלחה סבירה עבור כל מספרי קשרי הדיסולפיד שנבדקו כאשר רמת ההצלחה הנמוכה ביותר היא 66% עבור מטרות המכילות שישה קשרי דיסולפיד. ניתוח התפלגות הצלחת הביטוי על סמך הנקודה האיזואלקטרית ומספר השאריות מצביע על כך שאין הטיה מיוחדת לטכניקה עם מטרות מבוטאות בהצלחה ומטרות שלא זוהו מפוזרות לאורך העלילה.

לאחר שזוהו ההיתוך ונבקעו, המטרות המטוהרות עוברות בקרת איכות על ידי יינון אלקטרו-ספריי, ספקטרומטריית מסה. כאן המטרה המייצגת המוצגת היא חלבון ארס עשיר ב-5.7 קילו-דלטון דיס סולפיד עם ארבעה קשרי דיסולפיד. ספקטרום זה מראה את התוצאות עבור החלבון לפני ההפחתה עם DTT כפי שהיה לאחר מחשוף והתפלה ללא התערבות נוספת.

ספקטרום זה מראה את החלבון לאחר הפחתה עם DTT ואחריו התפלה כדי להסיר עודפי DTT. החצים מציינים את היונים המתאימים למסות הניסוי והייעוד לכל יון מסומן בירוק. מסות האב הניסיוניות המחושבות עבור יונים אלה מוצגות בטבלה ותואמות הפרש מסה של שמונה דלטונים, שווה ערך לארבעה קשרי גופרתי מחומצנים.

כאשר הוא מוגדר, ניתן לבצע את הפרוטוקול המלא על יותר מאלף תרביות תוך שבוע. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בתרביות אי קולי בקנה מידה קטן כדי לזהות את התנאים המוצלחים הדרושים לייצור חלבון מסיס בשיטות תפוקה גבוהות.