דגימה יעילה של מרחב תכנון חיישנים ביולוגיים מקודדים גנטית מתאפשרת עם תכנון ניסויים וזרימת עבודה של אוטומציה

הפיתוח והאופטימיזציה של חיישנים ביולוגיים ליישומים ביוטכנולוגיים הוא היקף המחקר שלנו. באופן ספציפי, אנו שואפים להבין כיצד לייעל ולהנדס חיישנים ביולוגיים באמצעות אפנון של האלמנטים הגנטיים שלהם. בחירות עיצוב מונעות אינטואיציה, כגון הנדסת מקדם קלאסית ומיון תאים פלואורסצנטי הן טכניקות המיושמות באופן שגרתי באפיון ועיצוב של חיישנים ביולוגיים.

תכנון מתודולוגיות ניסוי עדיין לא אומץ באופן נרחב בתכנון מעגלים גנטיים. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מבקשים להגביר את הקליטה של טכניקות מסוג זה בתכנון מעגלים גנטיים וחיישנים ביולוגיים. כדי להתחיל, קבע את גודל הספרייה התיאורטית וחשב את מספר הגרסאות הבודדות הדרושות כדי להבטיח כיסוי ספרייה גדול מ-95%.

חשב את הנפח הנדרש של מצע מרק ליזוגני בתוספת אנטיביוטיקה בהתאם למספר המושבות שיש להקרין. פתח את תוכנת הטיפול בנוזלים ולחץ על הפעל לצד תוכנית העברת הנוזלים MTP. הנח את המדיה המוכנה במיקום המאגר המתאים.

לאחר מכן מלאו את הסיפון בלוחות מיקרוטיטר ריקים בהתאם לפריסה. הגדר את התוכנית להוציא 200 מיקרוליטר מדיה. לחץ על אישור כדי לאשר את הפעלת התוכנית.

כעת, העבירו בארות צלחות מיקרוטיטר מלאות לפלטפורמת בורר מושבות ופתחו והעבירו לוחות מקדחים מרובעים של Pseudomonas putida שהפכו עם DNA של ספריית וריאנט פלסמיד לפלטפורמת בורר המושבה. השתמש בבורר המושבות כדי לחסן כל באר ממולאת מראש במושבה אחת מלוחות הטרנספורמציה. אטמו מחדש את הצלחות המחוסנות והעבירו אותן לחממת טלטול לא מקוונת.

לאחר הדגירה, החזר את הצלחות הגדלות לפלטפורמת המטפל בנוזלים ופתח את האטם. לחץ על הפעל לצד הפרוטוקול הוסף גליצרול ל- MTP. ודא שפריסת הצלחת על המסך תואמת לזו של רציף המטפל בנוזלים.

וברצף, לחץ על אישור כדי שהפרוטוקול יפעל. לאחר שתסיים, אטמו את הצלחות וערבבו אותן בקצרה בחממת טלטול לא מקוונת במהירות של 800 סיבובים לדקה למשך חמש דקות. מקודדים את הצלחות ושומרים בחום של 80 מעלות צלזיוס עד הצורך.

חשב את הנפח הנדרש של מדיה משלימה לאנטיביוטיקה עבור בלוקים בבארות עמוקות. לחץ על הפעל ליד תוכנית העברת הנוזלים DWB. ודא שהמדיה נוספה למאגר הנכון.

גושי הבאר העמוקים הריקים נמצאים במיקומי פריסה נכונים וכי אספקה מספקת של טיפים זמינה. הגדר את התוכנית להפצת 495 מיקרוליטר מדיה. כשתהיה מוכן, לחץ ברצף על אישור כדי להפעיל את התוכנית.

כעת, אטמו את גושי הבאר העמוקים המלאים בקרום נושם והעבירו לאחסון זמני בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לחץ על הפעל ליד החיסון מתוכנית MTP מופשרת. ודא שמלאי קריו MTP ובלוקים למילוי בארות עמוקות מועברים לפלטפורמה לכל פריסה וכי נטענים מספיק טיפים.

ברצף, לחץ על אישור כדי לאתחל. בסיום התוכנית, אטמו את בלוקי הבאר העמוקים המחוסנים למשך הלילה עם קרום נושם. העבירו אותם לחממת שייקר צלחות לא מקוונת למשך 16 שעות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס, 800 סיבובים לדקה ו-75% לחות.

אטום מחדש, ערבב והחזיר צלחות מיקרוטיטר קריוסטוק למקפיא 80 מעלות צלזיוס. כעת, חשב את הנפח הנדרש של מדיה בתוספת ריכוזים שונים של אפקטורים ואנטיביוטיקה עבור בלוקים של בארות עמוקות למשך הלילה שיסוננו. לחץ על הפעל ליד תוכנית העברת הנוזלים DWB.

לאחר מכן ודא שמאגרי המדיה בתוספת אפקטור ממוקמים כהלכה. הוסף בלוקים ריקים של בארות עמוקות לפלטפורמת המטפל בנוזלים. כאשר יש מספיק טיפים זמינים, לחץ ברצף על אישור כדי להפעיל את הפרוטוקול כדי ליצור בלוקים של בארות עמוקות לבדיקה.

לאחר המילוי, אטום את גושי הבאר העמוקים של הבדיקה בקרום נושם. מלאו מחדש את המטפל בנוזלים בצלחות ריקות. חזור על החיסון עד שכל גושי הבדיקה מתמלאים.

לאחר מכן, לחץ על הפעל לצד תוכנית ההעברה לבדיקה DWB. לאחר בדיקה לא אטומה בלוקים של בארות עמוקות עם מדיה בתוספת אפקטור ממוקמים כהלכה, מעבירים ופותחים למשך הלילה בלוקים של בארות עמוקות המכילים P.putida גדל לכל פריסה. לחץ ברצף על אישור כדי להפעיל את הפרוטוקול.

לאחר סיום התוכנית, איטום העברת לוחות בדיקה לחממה לא מקוונת. השליכו את גושי הבאר העמוקה למשך הלילה לאחר החיסון. לאחר מכן, העבירו את גושי הבאר העמוקים לצנטריפוגה.

תאי גלולה ב-4,000 גרם ברוטור מבוקר קרח ב-18 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר השלכת הסופרנטנט, הנח את גושי הצנטריפוגה על פלטפורמת המטפל בנוזלים. חשב את הנפח של פעם אחת PBS הנדרש על סמך מספר בלוקי הבארות העמוקות שיש להקרין.

לחץ על הפעל ליד הבדיקה הגדר PBS השעיה מחדש תוכנית DWB, והגדר את נפח החלוקה ל-500 מיקרוליטר. לאחר מכן ודא ש-PBS נוסף למאגר הנכון, וסדר את הלוחות הצנטריפוגים בהתאם לפריסה. לחץ על אישור כדי להתחיל את התוכנית לאחר אישור זמינות הטיפ.

אטום מחדש והסר בלוקים של בארות עמוקות תלויים מהמטפל בנוזלים. בדוק את הצד התחתון של הצלחת כדי לוודא שהכדורים מושעים לחלוטין. לחץ על הפעל לצד תאי הגדרת הבדיקה ותוכנית MTP של מהדורת PBS.

לאחר מכן העבירו בלוקים תלויים לבאר עמוקה לתוך המטפל בנוזלים בהתאם לפריסה. טען את לוחות המיקרוטיטר הריקים בהתאם לפריסה והגדר את נפח החלוקה ל-200 מיקרוליטר לפני לחיצה על אישור. העבר את לוחות המיקרוטיטר המלאים לקורא צלחות רב-מצבי לא מקוון ומדוד את הקרינה היחסית ואת OD600.

סינון אוטומטי של 5,000 גרסאות מקדמים זיהה מועמדים מובילים שהראו הפעלה של יותר מפי 3.6. ערכי EC 50 עבור 100 גרסאות ייחודיות תווו כדי להמחיש את התפלגות הרגישות ולזהות מועמדים חזקים. ערכי EC 50 חושבו עבור 226 גרסאות מועשרות ודורגו באמצעות טרנספורמציה של Lin-log ליצירת ספרייה בקנה מידה של רגישות.

תכנון סינון סופי נבנה תוך שימוש בשונות רמה של 1, 0 ו-1 מארבעה מודולים. פרופילי מודל הובלה, רגולטור, P-out ופלט Ribosome-Binding Site חשפו כיצד שינויים ברמות הביטוי של ארבעת המודולים השפיעו באופן לא ליניארי על EC 50 ועל מקדם היל. זיהוי שילובי ביטוי אופטימליים עם RBS-Out, המראה השפעה חיובית חזקה הן על הרגישות והן על השיפוע.

גרסת החיישנים הביולוגיים המותאמת באופן גלובלי המשלבת חוזקות מודול אידיאליות הדגימה רגישות משופרת, ומקדם היל בהשוואה הן לגרסאות ההורים והן לגרסאות המותאמות ל-DSD.