שיטת Microarray לקביעת סרולוגית לזיהום Clostridium difficile נוגדן התגובות הבאות אנטיגן ספציפי

שיטה זו עשויה לסייע באופטימיזציה ובבחירה של אימונותרפיות שימושיות מבחינה קלינית לזיהום קלוסטרידיום דיפיצילה באופן ספציפי למטופל, ולהבהיר את התגובות החיסוניות האנושיות לקלוסטרידיום דיפיצילה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת כימות מדויק ובו זמנית של תגובות נוגדנים מרובות איזוטיפים וזן ספציפי לאנטיגנים של C.difficile. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שנדרשת מומחיות בהקמה ואופטימיזציה של פאנל של אנטיגנים מטוהרים מאוד, והקמת הפלטפורמה הטכנולוגית.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן סוגי רשימות מתודולוגיות המעורבים בהכנת לוחית המיקרוגל, הדפסת מערכים, הליך בטוח וניתוח הנתונים דורשים תשומת לב לפרטים. הדגמה של חלק מההליך תהיה על ידי סם גרינווד, טכנאי מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, יש לדלל את האנטיגנים של קלוסטרידיום דיפיצילה ואת מאגר ההדפסה לריכוז אופטימלי.

לאחר מכן, העבירו 10 מיקרוליטר של תמיסת אנטיגן לצלחת 384 באר. מכסים את הצלחת בחותם צלחת, וצנטריפוגה בכוח הכבידה פי 300 למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. להדפסת מיקרו-מערך, השתמש במבער גז ידני כדי לחמם את קוד ה-PIN מסיליקון שלוש פעמים למשך שתי שניות כל אחת.

לאחר מכן, שטפו את קוד הסיליקון במים נקיים שלוש פעמים למשך שלוש שניות כל אחת. הנח את לוחית המיקרו-מערך במחסנית הטעינה של מערך. הוצא את המגש ולאחר מכן הנח את שקופיות האמינו סילאן במגש השקופיות ולחץ על כפתור אישור כדי להפעיל את הוואקום.

ודא שכל השקופיות מאובטחות ולאחר מכן לחץ על אישור. מחזירים את המגש למקור וסוגרים את המכסה. לאחר מכן, הפעל את התוכנית המתאימה ועבור אל קובץ, לאחר מכן פרמטרים של מיקרו-מערך ולאחר מכן פתח. בחר Clostridium difficile file להדפסת כל האנטיגנים ברביעייה.

תחת חלון זה, פתח את הכרטיסייה מקור כדי לציין אחסון לדוגמה, ואת הכרטיסייה יעד כדי להזין פרטי מיקרו-מערך. לאחר מכן, פתחו את הכרטיסייה אפשרויות כדי לבחור את כלי הכביסה. תחת הכרטיסיה כללי של העדפות הפעלה, בסרגל הכלים של חבילת היישומים של TAS, בחר שטיפה בתחילת ההפעלה ושטיפה בסוף ההפעלה.

פתח את הכרטיסייה אקלים, והגדר את רמת הלחות בין 55 ל-60%כעת התחל את הריצה, ובדוק מעת לעת את המערך כדי להבטיח תפקוד תקין. לאחר ההדפסה, הנח בזהירות את השקופיות המודפסות במחזיק שקופיות עם 16 תאים מרובי בארות. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר של 5% BSAT לכל בלוק.

מכסים את השקופיות ודוגרים במשך שעה בטמפרטורת החדר בניעור. השתמש ב-120 מיקרוליטר PBST כדי לשטוף כל בלוק חמש פעמים למשך דקה אחת כל אחת בניעור. לאחר מכן, הפשירו את דגימות הסרום שהתקבלו מחולים שנדבקו ב-C difficile ובקרות בריאות על קרח למשך 20 דקות.

הוסף מדלל נוגדנים זמין מסחרית לבלוק הראשי, ולאחר מכן הוסף דגימות לבלוק הראשי וערבב. השליכו את מאגר הכביסה והוסיפו 100 מיקרוליטר מכל דגימה מדוללת לבלוקים הניסיוניים. עבור בלוק הבקרה השלילי, הוסף 100 מיקרוליטר של מדלל הנוגדנים בלבד.

לאחר מכן, דגרו את המגלשות למשך שעה בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין. לאחר מכן, השתמש ב-120 מיקרוליטר PBST כדי לשטוף כל בלוק חמש פעמים למשך שלוש דקות כל אחת עם ניעור. לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטר של נוגדן אנטי-אנושי ביוטיניל מדולל בנוגדנים מדולל לכל בלוק.

מכסים את השקופיות ודוגרים במשך שעה בטמפרטורת החדר בניעור עדין. השתמש ב-120 מיקרוליטר PBST כדי לשטוף כל בלוק חמש פעמים במשך שלוש דקות כל אחת בניעור. לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטר מצומד סטרפטווידין SY5 מדולל ב -5% BSAT, ביחס של אחד לאלפיים לכל בלוק.

מכסים את השקופיות בנייר כסף ומדגרים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בניעור עדין. שטפו תחילה את השקופיות עם 120 מיקרוליטר PBST חמש פעמים למשך דקה אחת כל אחת, ולאחר מכן שטפו אותן פעמיים נוספות למשך דקה אחת כל אחת עם PBS. כדי לייבש את המגלשות, סובב אותן במשך חמש דקות בכוח הכבידה פי 300.

הפעל את סורק הלייזר 30 דקות לפני הסריקה, כדי לאפשר לו להתחמם. לאחר מכן הנח את השקופית בסורק כשהמשטח המודפס פונה כלפי מעלה עד שנורית הצלחת הופכת לירוקה קבועה. לאחר מכן, לחץ על כפתור ההגדרות.

בכרטיסייה הראשונה, ודא שהגלילה האוטומטית והברקוד אינם מסומנים. לאחר מכן, הגדר את גודל הפיקסלים ל-10, מצב סריקה לבינוני, רכישה ל-635 בלבד, מצב רכישה לידני, רווח ל-20 והספק לנמוך. בכרטיסיה השניה, ודא שסוג השקופית אינו מסומן בתווית.

בכרטיסייה השלישית, הגדר את הגדרת המיקוד למיקוד אוטומטי. לחץ על לחצן רשת הייבוא כדי לבחור את רשימת המערכים המתאימה המשויכת לתמונה הסרוקה. לאחר מכן, לחץ על כפתור החיפוש האוטומטי כדי ליישר את הרשת לנקודות בשקופית.

לבסוף, לחץ על כפתור תהליך הכימות כדי למדוד את עוצמת הקרינה של כל נקודה. לאחר מכן, שמור את התוצאות בפורמט מתאים להמשך ניתוח. בפרוטוקול זה, מיקרו-מערך חלבונים מושווה ל-ELISA כדי להעריך את יכולת השחזור בין שתי הטכניקות הללו.

ניתוח מקדם המתאם של ספירמן מראה הסכמה משמעותית בין המיקרו-מערך ל-ELISA לזיהוי רמות IgG, Anti-toxin A ו-Anti-toxin B בדגימות סרום. מבחן מבוא ושחזור בין מבחנים של מערך המיקרו של החלבון מחושבים באמצעות דגימות סרום של שבעה חולים. הדגימות שנותחו בשתי שקופיות מערך שונות כנגד רעלן A, רעלן B, SLP001, SLP002, SLP027, רעלן B מרעלן B המייצר רק זן CCUG, ואנטיגנים pCDTb מגלים יכולת שחזור טובה.

מיקרו-מערך חלבונים מבוצע כדי לזהות תגובת נוגדנים ספציפית לאיזוטיפ כנגד רעלני קלוסטרידיום דיפיצילה. דגימות הסרום של חולים ואנשים בריאים משמשות לאיתור רמות IgG ו-IgA כנגד רעלן A, רעלן B, רעלן B מרעלן B של קלוסטרידיום דיפיצילה המבטא רק מתח, וצורת מבשר של מקטע B של רעלן בינארי. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבע שעות.

יש להעריך את ניסוי בקרת האיכות, פרמטרים שונים כגון בחירת כימיה מתאימה של פני השטח, מאגרי הדפסה, חוצצים חוסמים ודילול של דגימות סרום ונוגדנים משניים לפני הפעלת דגימות. הדפסת מערך איכותי דורשת הבנה טובה של המערך או התוכנה כדי להתאים את הדפסת הפרמטרים בהתאם לפרוטוקול הניסוי. חיוני לשמור על ביצועים מיטביים של המערך, וסביבה נטולת אבק לאורך כל הניסוי.

טכניקה זו תסלול את הדרך לחוקרים בתחום האימונולוגיה והביולוגיה המולקולרית, במונחים של אפיון תגובות חיסוניות הומורליות לזיהום, וגילוי אנטיגנים סרודיאגנוסטיים. אל תשכח שעבודה עם דגימות דם נגועות ורעלנים חיידקיים עלולה להיות מסוכנת. באופן כללי, במעבדה, תמיד יש לקחת בחשבון בטיחות ואמצעי זהירות סטנדרטיים בעת ביצוע הליך זה.