מערכת חלבון פלואורסצנטי ירוק לדמיין Effectors מועברת בין חיידקים במהלך זיהום

גישות מבוססות חלבון פלואורסצנטי לפקח effectors מופרש על ידי חיידקים לתוך התאים המארחים הם מאתגרים. זאת בשל בעיית אי התאימות בין חלבונים פלורסנט ומערכת ההפרשה סוג-III. כאן, מערכת ה-GFP פיצול ממוטב superfolder משמש עבור ויזואליזציה של effectors מופרש על ידי חיידקים לתוך התא הצמח הפונדקאי.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האינטראקציה בין צמח למיקרוב, כגון כיצד חיידקים פתוגניים יכולים להפריע למצב האופטימלי של תאי הצמח המארחים שלהם על ידי שימוש בחלבונים הנקראים אפקטורים המופרשים לתאי הצמח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שחלבון האפקטור החיידקי מתבטא בתא החיידק באמצעות מערכת הביטוי המקורית שלו ולאחר מכן מועבר לתא הצמח דרך מערכת ההפרשה של חיידקים מסוג III. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו את צמחי Nicotiana benthamiana ו-Arabidopsis thaliana כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

לאחר מכן, השתמש באלקטרופורציה סטנדרטית כדי להפוך את הגן הנושא והאפקטור של הפלסמיד שהתמזג לתג sfGFP11 לזן CUCPB5500 עגבניות Pseudomonas syringae pathovar. נקודת הזמן ורמת הביטוי האופטימלית, או להרכיב מחדש את sfGFP, תלויים באמת בחלבון האפקטור שלך. אנו ממליצים לייעל את תנאי החיסון או התצפית.

מורחים בעדינות את תאי החיידקים שעברו טרנספורמציה על פני צלחות King's B Agar. לאחר מכן דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך יומיים. לאחר מכן, יש לחסן מושבת חיידקים אחת לתוך המדיום הנוזלי של King's B באנטיביוטיקה המתאימה לווקטור הזה.

דגירה בלילה ב-28 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-200 סל"ד. למחרת, הוסיפו גליצרול אוטוקלאב למדיום המחוסן לריכוז סופי של 50% אחסן בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס. כדי להתחיל, הפוך את הפלסמיד לתאי Agrobacterium tumefaciens זן GV3101 כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

גדל את התאים על מדיום LB Agar בתוספת ב -28 מעלות צלזיוס למשך יומיים. באמצעות מושבה בודדת ממדיום LB Agar, יש לחסן 5 מיליליטר של מדיום LB נוזלי בתוסף. לאחר מכן, גדל את התאים למשך הלילה ב-28 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-200 סל"ד.

לאחר מכן, צנטריפוגה ב -3000 גרם למשך 10 דקות לקצירת התאים. שפכו את הסופרנטנט ותלו מחדש את הכדור ב-1 מיליליטר של מאגר הסתננות טרי. בעזרת ספקטרופוטומטר, קבע את כמות תאי האגרובקטריום על ידי מדידת ערך הצפיפות האופטית בספיגה של 600 ננומטר.

לאחר מכן, השתמש במאגר חדירה כדי להתאים את ה-OD 600 של תאי החיידקים ל-0.5. השאירו את התרבות על נדנדה עדינה בטמפרטורת החדר למשך שעה עד חמש שעות. כדי לחדור לעלים, השתמש בקצה פיפטה של 10 מיקרוליטר כדי לתקוע חור במרכז כל עלה.

השתמש במזרק ללא מחט של 1 מיליליטר כדי להזריק בזהירות 500 מיקרוליטר של תרחיף האגרובקטריום לצד האדקסיאלי של העלה. נגב את תרחיף החיידקים שנותר מהעלים וסמן את גבול האזור שהסתנן. שמור את הצמחים שחדרו בתא גידול בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ו-60% לחות למשך יומיים.

פס את זן Pseudomonas שעבר טרנספורמציה ממאגר הגליצרול למדיום B Agar של King's עם האנטיביוטיקה המתאימה. דגירה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך יומיים. לחסן לולאה של תאי Pseudomonas במדיום נוזלי מניטול גלוטמט.

דגרו על התרבית למשך הלילה ב-28 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-200 סל"ד. לאחר מכן, צנטריפוגה ב -3000 גרם למשך 10 דקות לקצירת התאים. שפכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה בתמיסת מגנזיום כלוריד של 10 מילי-מולרי.

לאחר מכן, התאם את הצפיפות האופטית ל-0.02 עבור עלי Nicotiana benthamiana ול-0.002 עבור עלי Arabidopsis. עבור עלי Nicotiana benthamiana, הסתננו לתרחיף Pseudomonas לאותו אזור שבו חדר האגרובקטריום יומיים קודם לכן. עבור ה-Arabidopsis הטרנסגני, הסתננו לתרחיף Pseudomonas לשני עלים קצרים בני ארבעה שבועות שגדלו ביום.

לבסוף, גזרו דיסק עלים לעלים המחוסנים בפסאודומונס. בנקודות זמן ספציפיות לאחר חדירת פסאודומונס, השתמש במערכת סריקת לייזר קונפוקלית כדי לצלם שני דיסקי עלים של שני סנטימטרים רבועים מהצמח הבודד. התבוננו בתאים הרחק מחור ההסתננות כדי למנוע תאים מתים שנהרגו מפציעה.

אפקטורים שהועברו מהחיידקים קיימים רק בכמויות קטנות מאוד. לכן, אתה יכול להגדיל את עוצמת הלייזר ולהשיג פליטת פלואורסצנטיות כדי לזהות אות פלורסנט. עם זאת, אל תגזים כדי להימנע מלכידת אות כוזב מאוטופלואורסצנטיות מתאי הצמח.

במחקר זה, נעשה שימוש בגישה מבוססת חלבון פלואורסצנטי לניטור אפקטורים המופרשים על ידי חיידקים לתאי מארח. סריקת לייזר קונפוקלית של עלה Nicotiana benthamiana שלוש שעות לאחר ההדבקה מוצגת כאן. תאים המבטאים sfGFP אופטימלי עם AvrB בלבד אינם מראים שום אות פלואורסצנטי.

עם זאת, אותות GFP נראים מהתאים הנגועים המכילים AvrB, sfGFP11. זה מוודא כי קומפלקס AvrB sfGFP11 מורכב מחדש עם sfGFP אופטימלי בציטוזול ולאחר מכן עובר לקרום הפלזמה. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על בריאות החומרים הצמחיים ולהכין תרבית חיידקים טריים לתאים פעילים.

בעקבות הליך זה, ניתן להקדים שיטות אחרות כמו ניתוח דם שרף כדי להבין שינוי תרגום שגוי של חלבוני אפקטור חיידקים בתאי הצמח במהלך תגובות חיסוניות של הצמח. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לדמיין את העברת האפקטור מסוג III בתאי צמחים נגועים. יש להשליך חומרים צמחיים ותרביות חיידקים בהתאם לקריטריונים של המעבדה שלך לפסולת ביולוגית מסוכנת ואל תשכח ללבוש את ה-PPE שלך.