מערכת חלבון פלואורסצנטי ירוק לדמיין Effectors מועברת בין חיידקים במהלך זיהום
24 במאי 2018
גישות מבוססות חלבון פלואורסצנטי לפקח effectors מופרש על ידי חיידקים לתוך התאים המארחים הם מאתגרים. זאת בשל בעיית אי התאימות בין חלבונים פלורסנט ומערכת ההפרשה סוג-III. כאן, מערכת ה-GFP פיצול ממוטב superfolder משמש עבור ויזואליזציה של effectors מופרש על ידי חיידקים לתוך התא הצמח הפונדקאי.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האינטראקציה בין צמח למיקרוב, כגון כיצד חיידקים פתוגניים יכולים להפריע למצב האופטימלי של תאי הצמח המארחים שלהם על ידי שימוש בחלבונים הנקראים אפקטורים המופרשים לתאי הצמח. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שחלבון האפקטור החיידקי מתבטא בתא החיידק באמצעות מערכת הביטוי המקורית שלו ולאחר מכן מועבר לתא הצמח דרך מערכת ההפרשה של חיידקים מסוג III. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו את צמחי Nicotiana benthamiana ו-Arabidopsis thaliana כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
לאחר מכן, השתמש באלקטרופורציה סטנדרטית כדי להפוך את הגן הנושא והאפקטור של הפלסמיד שהתמזג לתג sfGFP11 לזן CUCPB5500 עגבניות Pseudomonas syringae pathovar. נקודת הזמן ורמת הביטוי האופטימלית, או להרכיב מחדש את sfGFP, תלויים באמת בחלבון האפקטור שלך. אנו ממליצים לייעל את תנאי החיסון או התצפית.
מורחים בעדינות את תאי החיידקים שעברו טרנספורמציה על פני צלחות King's B Agar. לאחר מכן דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך יומיים. לאחר מכן, יש לחסן מושבת חיידקים אחת לתוך המדיום הנוזלי של King's B באנטיביוטיקה המתאימה לווקטור הזה.
דגירה בלילה ב-28 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-200 סל"ד. למחרת, הוסיפו גליצרול אוטוקלאב למדיום המחוסן לריכוז סופי של 50% אחסן בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס. כדי להתחיל, הפוך את הפלסמיד לתאי Agrobacterium tumefaciens זן GV3101 כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
גדל את התאים על מדיום LB Agar בתוספת ב -28 מעלות צלזיוס למשך יומיים. באמצעות מושבה בודדת ממדיום LB Agar, יש לחסן 5 מיליליטר של מדיום LB נוזלי בתוסף. לאחר מכן, גדל את התאים למשך הלילה ב-28 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-200 סל"ד.
לאחר מכן, צנטריפוגה ב -3000 גרם למשך 10 דקות לקצירת התאים. שפכו את הסופרנטנט ותלו מחדש את הכדור ב-1 מיליליטר של מאגר הסתננות טרי. בעזרת ספקטרופוטומטר, קבע את כמות תאי האגרובקטריום על ידי מדידת ערך הצפיפות האופטית בספיגה של 600 ננומטר.
לאחר מכן, השתמש במאגר חדירה כדי להתאים את ה-OD 600 של תאי החיידקים ל-0.5. השאירו את התרבות על נדנדה עדינה בטמפרטורת החדר למשך שעה עד חמש שעות. כדי לחדור לעלים, השתמש בקצה פיפטה של 10 מיקרוליטר כדי לתקוע חור במרכז כל עלה.
השתמש במזרק ללא מחט של 1 מיליליטר כדי להזריק בזהירות 500 מיקרוליטר של תרחיף האגרובקטריום לצד האדקסיאלי של העלה. נגב את תרחיף החיידקים שנותר מהעלים וסמן את גבול האזור שהסתנן. שמור את הצמחים שחדרו בתא גידול בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ו-60% לחות למשך יומיים.
פס את זן Pseudomonas שעבר טרנספורמציה ממאגר הגליצרול למדיום B Agar של King's עם האנטיביוטיקה המתאימה. דגירה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך יומיים. לחסן לולאה של תאי Pseudomonas במדיום נוזלי מניטול גלוטמט.
דגרו על התרבית למשך הלילה ב-28 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-200 סל"ד. לאחר מכן, צנטריפוגה ב -3000 גרם למשך 10 דקות לקצירת התאים. שפכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה בתמיסת מגנזיום כלוריד של 10 מילי-מולרי.
לאחר מכן, התאם את הצפיפות האופטית ל-0.02 עבור עלי Nicotiana benthamiana ול-0.002 עבור עלי Arabidopsis. עבור עלי Nicotiana benthamiana, הסתננו לתרחיף Pseudomonas לאותו אזור שבו חדר האגרובקטריום יומיים קודם לכן. עבור ה-Arabidopsis הטרנסגני, הסתננו לתרחיף Pseudomonas לשני עלים קצרים בני ארבעה שבועות שגדלו ביום.
לבסוף, גזרו דיסק עלים לעלים המחוסנים בפסאודומונס. בנקודות זמן ספציפיות לאחר חדירת פסאודומונס, השתמש במערכת סריקת לייזר קונפוקלית כדי לצלם שני דיסקי עלים של שני סנטימטרים רבועים מהצמח הבודד. התבוננו בתאים הרחק מחור ההסתננות כדי למנוע תאים מתים שנהרגו מפציעה.
אפקטורים שהועברו מהחיידקים קיימים רק בכמויות קטנות מאוד. לכן, אתה יכול להגדיל את עוצמת הלייזר ולהשיג פליטת פלואורסצנטיות כדי לזהות אות פלורסנט. עם זאת, אל תגזים כדי להימנע מלכידת אות כוזב מאוטופלואורסצנטיות מתאי הצמח.
במחקר זה, נעשה שימוש בגישה מבוססת חלבון פלואורסצנטי לניטור אפקטורים המופרשים על ידי חיידקים לתאי מארח. סריקת לייזר קונפוקלית של עלה Nicotiana benthamiana שלוש שעות לאחר ההדבקה מוצגת כאן. תאים המבטאים sfGFP אופטימלי עם AvrB בלבד אינם מראים שום אות פלואורסצנטי.
עם זאת, אותות GFP נראים מהתאים הנגועים המכילים AvrB, sfGFP11. זה מוודא כי קומפלקס AvrB sfGFP11 מורכב מחדש עם sfGFP אופטימלי בציטוזול ולאחר מכן עובר לקרום הפלזמה. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על בריאות החומרים הצמחיים ולהכין תרבית חיידקים טריים לתאים פעילים.
בעקבות הליך זה, ניתן להקדים שיטות אחרות כמו ניתוח דם שרף כדי להבין שינוי תרגום שגוי של חלבוני אפקטור חיידקים בתאי הצמח במהלך תגובות חיסוניות של הצמח. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לדמיין את העברת האפקטור מסוג III בתאי צמחים נגועים. יש להשליך חומרים צמחיים ותרביות חיידקים בהתאם לקריטריונים של המעבדה שלך לפסולת ביולוגית מסוכנת ואל תשכח ללבוש את ה-PPE שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג מערכת split superfolder GFP מותאמת כדי להדגים אפקטורים חיידקיים המופרשים לתאי צמח מאח$. שיטה זו נותנת מענה לאתגרים הקשורים לתאימות של חלבונים פלואורסצנטיים ולמערכת הפרשה מסוג III.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- אינטראקציות בין צמחים למיקרובים
- חיידקים פתוגניים
- ויזואליזציה באמצעות חלבון פלואורסצנטי
רקע
- חיידקים פתוגניים מפרישים אפקטורים כדי להשפיע על תאי הצמח המארח.
- שיטות מסורתיות המבוססות על חלבונים פלואורסצנטיים נתקלות בבעיות תאימות.
- מערכת הפרשה מסוג III (Type-III secretion system) היא קריטית להעברת אפקטורים.
- אופטימיזציה של טכניקות ויזואליזציה היא חיונית לצורך המחקר.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה להדמיה של אפקטורים בקטריאליים בתאי צמחים.
- שיפור ההבנה של אינטראקציות בין צמחים למיקרובים.
- אספקת פרוטוקול עבור חוקרים בתחום.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של צמחי Nicotiana benthamiana ו-Arabidopsis thaliana.
- אלקטרופורציה להחדרת פלסמידים הנושאים גנים של אפקטורים.
- שימוש בתג sfGFP11 לוויזואליזציה של אפקטורים.
- אופטימיזציה של תנאי ההחדרה והתצפית בהתבסס על חלבוני האפקטורים.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של אפקטורים בקטריאליים בתאי מאכסן.
- הדגמת תאימות של מערכת ה-split superfolder GFP.
- מתן תובנות לגבי התזמון ורמות הביטוי להשגת תוצאות אופטימליות.
- ביסוס פרוטוקול למחקרים עתידיים באינטראקציות בין צמחים למיקרובים.
מסקנות
- מערכת ה-split superfolder GFP המותאמת היא יעילה לחקר אפקטורים.
- שיטה זו יכולה לקדם את המחקר באינטראקציות בין צמחים לפתוגנים.
- אופטימיזציה נוספת עשויה לשפר את תוצאות הוויזואליזציה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ויזואליזציה של הובלת חלבוני אפקטורים מפתוגנים חיידקיים אל תוך תאי המארח היא קריטית להבנת מנגנוני virulent וזיהוי מטרות טיפוליות באינטראקציות בין צמחים למיקרובים. מערכת ה-sfGFP המפוצלת מאפשרת תצפית ישירה על אפקטורים שעברו טרנסלוקציה באמצעות מערכת ההפרשה מסוג III טבעית, ובכך היא מתגברת על מחסומי תאימות של חלבונים פלואורסצנטיים. גישה זו תומכת בתיקוף המטרה על ידי אישור הלוקליזציה התת-תאית והדינמיקה של חלבונים ממקור פתוגני במערכת הרלוונטית למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של translocation של אפקטורים ומדוריות (compartmentalization) של המארח בזמן אמת.
- ערך תפעולי: משתמש במערכות ביטוי והפרשה חיידקיות טבעיות כדי לשמר את תפקודיות האפקטור ולהימנע מערטייקים (artifacts) הנובעים מביטוי הטרולוגי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר קריאות פלואורסצנציה כמותיות באברונים ספציפיים, ובכך תומך בסטנדרטיזציה של בדיקות למחקרי לוקליזציה של אפקטורים.
- ערך תפעולי: תואם לפלטפורמות של דימיון קונפוקאלי, מה שמאפשר סריקה ניתנת להרחבה של וריאנטים או מוטנטים של אפקטורים במודלים של צמחים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מספק תובנות מערכתיות הרלוונטיות למחלה לגבי מיקוד של אפקטורים בממברנת הפלזמה ובציטוזול, ובכך מסייע בהסרת סיכונים מכניסטיים של גורמי virulentce.
- ערך תפעולי: מבסס תהליך עבודה הניתן לשחזור, החל מתרבית חיידקים ועד להדבקת צמחים ודימות, ובכך מאפשר שיתוף פעולה רב-תחומי בין צוותי מיקרוביולוגיה וביולוגיה של צמחים.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים, שבהם יש לאשש את העברת האפקטור ואת התמידה במארח לפני זיהוי מובילים (leads) או קמפיינים של סריקה מכניסטית.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבדיקת השערות לגבי תפקוד אפקטורים על ידי קישור הפרשה למיקום תת-תאי בתאי צמח חיים.
- סריקה: מאפשר מוכנות של בדיקה באמצעות הרכבה סטנדרטית של GFP מפוצל עם מסירת האפקטור, ובכך מספק תוצאה בינארית להצלחת התעתוק.
- אנליטיקה: מייצר אותות פלואורסצנציה עם רזולוציה מרחבית המאפשרים השוואה של וריאנטים או מוטנטים של אפקטורים in planta.
- מחקר תרגומי: מתחבר להמשכיות פרה-קלינית על ידי תיקוף פעילות אפקטורים בהקשר של מאחס טבעי, ובכך תומך בניתוח מסלולים המותאמים לסמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן להתאים את הפלטפורמה לזוגות אפקטור-אברון אחרים על ידי החלפת קונסטרוקטים של sfGFP11-effector ו-organelle-targeted sfGFP1-10OPT.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתפקוד האפקטור על ידי אישור המסירה והמיקום ללא הסתמכות על מערכות תחליפיות.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות סטנדרטיזציה של הכנת החיידקים, ההסננה ותנאי הדימוג בין מעבדות שונות.
- ערך אסטרטגי: מפחית את הסיכון הביולוגי בבחירת המטרה על ידי תיקוף התנהגות האפקטור במודל זיהום טבעי.
- השפעה על הפורטפוליו: מספק בסיס לתעדוף מותאם סיכון של אסטרטגיות המכוונות לאפקטורים, על ידי אישור פעילות תת-תאית in planta.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגנטיקה של חיידקים, חדירה (infiltration) לצמחים ומיקרוסקופיה קונפוקלית.
- תלוי במכשור לגילוי פלואורסצנציה וביכולות הפרדה ספקטרלית כדי להבדיל בין האות לבין פלואורסצנציית רקע (autofluorescence) של הצמח.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים לתנאי תרבית חיידקים, התאמת OD ותזמון החדירה כדי להבטיח תוצאות הניתנות לשחזור.
- חייב לקחת בחשבון שונות בביטוי האפקטור, ביציבותו וביעילות ההפרשה שלו בין זני פתוגנים שונים ומסוגי מאכסנים שונים.
- מוגבל לרמות נמוכות של טרנסלוקציית אפקטורים, מה שדורש אופטימיזציה של עוצמת הלייזר והגבר (gain) כדי למנוע אותות שגויים תוך שמירה על רגישות.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פרמה
Chapters in this video
0:04
Title
0:49
Preparation of Plant Materials and Pseudomonas Culture
2:09
Transient Expression of Organelle-targeted sfGFP1-10OPT in N. benthamiana
3:58
Inoculation of Pseudomonas and Observation of sfGFP Signal via Confocal Microscopy
5:46
Results: Split Superfolder Fluorescent Protein System: A Useful Tool to Examine the Dynamics of Effectors in Host Plants
6:32
Conclusion
