Name: הדמיה כרונית של עכבר-Visual Cortex שימוש ההכנה סחוט הגולגולת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-25T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: למדו הדמיה כרונית של קליפת המוח הויזואלית בעכברים באמצעות הכנת גולגולת מורדדת. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר דינמיקת קוצי דנדריטים ומנגנוני פלסטיות מוחית לאורך זמן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי פרס Wellcome קריירה בורוז במדעי ביו (AKM), קרן וייטהול מענק מחקר (AKM), מלגת קרן סלואן (AKM), NIH EY019277 (AKM), וכן במימון ניי, חזון הדרכה גרנט, EY013319 ( EAK).

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש את הנוירונים במוח שלם באמצעות שני פוטונים מיקרוסקופיה, הכנה שבו הנוירונים מסומנים עם סמנים ניאון משמש. בניסויים שהוצגו כאן אנו משתמשים בקו ה-GFP-M עכבר מהונדס אשר תוויות שכבה 5 תאים פירמידליים 1. 5 שכבת תאים פירמידליים פרויקט תהליכים דנדריטיים לשכבות שטחיות, המאפשר ויזואליזציה של דנדריטים הקוצים הדנדריטים עד לעומק של 300 מיקרומטר מתחת לרמה של פיא. גישה חלופית היא להשתמש בתאים התווית סמנים ויראלי (ראה Lowery et al. שהוגשה יופיטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את סביבת העבודה באמצעות אתנול 70% כלים החיטוי לניתוח aseptic. כיסוי משטח הפעלה עם רוטב נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכברים עם קוקטייל פנטניל (פנטניל 0.05 מ"ג / ק"ג; midazolam 5 מ"ג / ק"ג; metatomadin 0.5 מ"ג / ק"ג) ואחריו מנה רבע Avertin (0.0075 מ"ג / מ"ל) באמצעות נהלים שאושרו IACUC. Pretreat עכברים עם משכך כאבים, עצירות (0.5 מ"ג / ק"ג) מנוהל תת עורית (SQ). צג את רמת מטוס הרדמה מהתגובה בדיקות לצבוט זנב / הבוהן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה על בעלי חיים 37.5 ° C באמצעות שמיכה חימום עם מדחום רקטלי המצורפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל משחה עיניים אל העיניים כדי למנוע את העיניים מהתייבשות. הוד העיניים עם גיליון נייר קטנה כדי להגן על העיניים ממקור אור במהלך הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים, להסיר שיער מהחלק האחורי של הראש (מאחורי האוזניים) לעיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את הראש של החיה עם יישום רציף של אתנול 70%, ואחריו לשפשף בבטאדין פתרון בבטאדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע חתך L-לחתוך מאחורי האוזניים לאורך הצד או הימני או השמאלי של קו האמצע (תלוי באיזה חצי כדור תהיה הדמיה) לעיניים. מקפלים את העור מעל מהמקום הניתוח. אין להסיר עור כמו העור יהיה sutured בעקבות הפגישה הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בסדר משוך בעדינות את העור כלפי מעלה והרחק מאזור העניין שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לגרד ממנו את periosteum מאזור חשוף של הגולגולת עם מלקחיים נקי או להב microsurgical. בעזרת צמר גפן, מרחו כמות קטנה של כלוריד Ferric 10% הגולגולת לגמרי יבש הממברנה periosteum ולוודא כי הוא הוסר לחלוטין. חשוב הגולגולת יבש לחלוטין, כדי להבטיח שמירה נאותה של דבק (ראה 11). באמצעות מלקחיים או סכין microsurgical, בעדינות לגרד ממנו קרום periosteum יבשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרוח שכבה דקה של דבק cyanoacrylate סביב החלון הדמיה של צלחת ראש נירוסטה (ראה איור 1) ו להטביע את הצלחת לגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת קצה של מקל עץ כותנה מקלון, כדי להחיל דבק התפרים בתוך החלון הדמיה; לוודא למלא את כל הפערים בין הצלחת הדמיה העקמומיות של הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים טיפת דבק מאיץ לתוך החלון. במהירות למחות מאיץ דבק עודף עם מטלית כותנה או קים לנגב. הדבק צריך להיות מוצק לחלוטין לפני הקידוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין דק את הגולגולת בחלון הדמיה באמצעות מקדח שיניים מודבקת עם 0.7 מ"מ נירוסטה בר. קידוח חלופית עם יישום מזדמנים של תמיסת מלח סטרילית 0.9%, כדי למנוע יצירת חום רב מדי על הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלון Thin 4x4 מ"מ בגולגולת באמצעות משיכות קטנות על פני השטח את הגולגולת עם המקדחה שיניים. בדוק את הרזון של הגולגולת עם מלקחיים סוף בוטה. פני הגולגולת תהיה הכניסה מעט עם לחץ עדין. עובי הגולגולת אופטימלי עבור הדמיה הוא בין 10 ל 30 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הגולגולת הוא דק החלון לנקות את כל הפסולת, המקום מלוחים על הגולגולת. צילום חלון הדמיה עם מצלמה דיגיטלית רכוב על היקף הניתוחים. צילום ושימוש בכלי הדם במוח יסייעו באיתור המיקום למקום צלחת הדמיה עבור הפעלות הדמיה הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחבורה את בעל החיים מעטה 2-הפוטון. החיה צריכה להישאר על השמיכה חימום (עם בדיקה רקטלית) במהלך הפגישה הדמיה כולו. הערה: בעוד תחת סדציה, הגוף הליבה של החיה טמפרטורה ינוע מאוד בהעדר יחידת החימום וכתוצאה מכך פגיעה בקליפת המוח או אולי מוות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ שני הפוטונים עם המאי טאי לייזר, משאבה 10W מצב מוצק כוח מקסימלית אולימפוס שונה יחידת Fluoview confocal משמש. המערכת מותאמת במיוחד עבור הדמיה רקמות עמוק גלאי חיצוני מותקנים קרוב אובייקטיבי ככל האפשר, כדי לאפשר גילוי מרבי של הקרינה מהמוח. LUMPlan Olympus FL / IR עדשה 20X/0.95NA אובייקטיבי משמש. מלח 0.9% משמש במהלך הדמיה עבור הטבילה אובייקטיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במיקרוסקופ, עם זום דיגיטלי נמוכה (x1) לזהות אזור המכיל נוירונים שכותרתו במאור פנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במצלמה דיגיטלית מודבקת פיסת עין המיקרוסקופ, לצלם באזור הדמיה. לחלופין, לשרטט את התבנית vasculature דם. זה הכרחי מחדשלהפוך את המיקום הדמיה אותו בנקודת הזמן שלאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג ערימה הגדלה נמוכה (X20 אובייקטיבי, 512x512 פיקסל; 5 צעד מיקרומטר) באמצעות במידה לעין כל של המוח (בדרך כלל פורש ~ 200 מיקרומטר) מראה את מידת הסתעפות דנדריטים. הערה: את התמונה בהגדלה נמוכה ישמש כדי לאתר את האזור הדמיה בנקודות זמן עוקבות כמו גם כלי הדם דנדריטים לשמור על המבנה שלהם בבעלי חיים צעירים למבוגרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תוכנת הדמיה (Fluoview, נ '5.0, FV300), להגדיל הגדלה דיגיטלית 8 פי. התאם את X, Y קואורדינטות (מחבת הקואורדינטות) אם יש צורך לאסוף ערימה בהגדלה גדולה אשר יראה מורפולוגיה הדנדריטים מפורט כולל את מיקומי ואת המבנה של הקוצים הדנדריטים. הערות מפורטות לגבי כל אוסף ערימה, כלומר מחבת קואורדינטות, טווח של איסוף, גודל Z-צעד את מספר הצעדים בערימה שלך. הערות אלה ישמשו כאשר חוזרים דנדריט זה או האקסון בנקודת הזמן שלאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הדמיה, הסר את צלחת הראש בעדינות על ידי הפרדת צלחת מפני השטח הגולגולת. בעזרת מלקחיים, להסיר את כל שאריות הדבק שנותרו על הגולגולת לנגב משטח הגולגולת עם תמיסת מלח סטרילית 0.9%. לתפור את העור מעל הגולגולת יחד באמצעות # 6 חוט התפירה. אזור נגב עם 70% אתנול. כדי להקל על הכאב במהלך ההתאוששות שלאחר הניתוח, לנהל 0.1 מ"ג / ק"ג כאבים עצירות, SQ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום חיות בכלוב נקי מתחת לפנס חום עד מתעורר הוא נייד. חזור החיה לכלוב המקורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי החי Reimage בשלב מאוחר יותר (זמן שלנו הדמיה נקודות יכול להיות בכל מקום בין 2 ימים חודשים רבים בנפרד), להסיר את התפרים או לפתוח מחדש את העור על הראש באמצעות שיטות aseptic לעיל. השתמש תמונה דיגיטלית של המוח vasculature (שצולמו במועד הניתוח הראשון) כדי לאתר את המיקום הדמיה המקורי. Reaffix נירוסטה headplate (שלבים 10-12). השתמש להב microsurgical בעדינות דקה משם כל עצם שאולי מחדש גדל בין נקודות הדמיה הזמן. אם יש צורך, דק עם מקדח שיניים. הדמיה חלון שקוף של פסולת וליישם ירידה של 0.9% סליין סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Carry החיה מיקרוסקופ שני הפוטונים ולאתר בתחום ההדמיה המקורית. השתמש בצילום דיגיטלי נלקח במהלך הפגישה הדמיה הראשון סיוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התוכנית Fluoview ולפתוח את התמונה המקורית בהגדלה נמוכה. לצרף גיליון שקיפות למסך המחשב לשרטט את כלי הדם הגדולים דפוס באמצעות עט שקיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התמונה חיה ויישר מחדש את הדם בכלי הדם לדפוס שירטט על הסרט שקיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי Reimage 8x zoomed במבנים, לפתוח את מחסנית שנאספו הרצוי מההפעלה הדמיה הקודם. סקיצה המבנה (axonal כלומר, דנדריטים, גליה) על סרט שקיפות, מודבקת על מסך המחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרב 8x מהתמונה חי ולהגדיר את המחבת קואורדינטות הפרמטרים הדמיה היום הראשון. בהתאם דיוק של יישור מיקום הגדלה נמוך, ייתכן שיהיה צורך גם לשנות את הזווית של התמונה במקצת. לאחר המבנה המבוקש נמצא, להתאים את המבנה לדפוס שירטט שלך בהגדלה גבוהה. אסוף את Z-מחסנית עם גודל צעד מספר זהה של Z-מחסנית תמונות לניתוח שלאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 29 ו - 30 עד שכל התמונות בהגדלה גבוהה מחדש שנאספו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ההדמיה תושלם, חזור על שלבים 22-24. Re-הדמיה ניתן לחזור במהירות של עד 2 נקודות זמן נפרדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי ביבר אגף לרפואה של בעלי חיים המעבדה של אוניברסיטת רוצ'סטר בית הספר לרפואה ורפואת שיניים, ב ההסמכה מלא על ידי האגודה הערכה וההסמכה של טיפול בבעלי חיים במעבדה, הבינלאומי (AAALAC) ונמצאים ציות לחוק המדינה, החוק הפדרלי מדיניות NIH. </li></ol> נציג תוצאות ב-GFP-M עכברים להביע, קבוצת משנה של שכבה 5 תאים דנדריטים פירמידה ותהליכים המתאימים יכול בקלות להיות דמיינו באמצעות 2-פוטון סריקת לייזר מיקרוסקופית (2PLSM) 1. כאן אנו הפגינו הכנה דליל-הגולגולת שבו הגולגולת מעל המיקום הרצוי הדמיה מדולל ל ~ 10-30 מיקרומטר. בביצוע נכון, פרוטוקול שלנו אפשרה לנו בבירור לדמיין דנדריטים קליפת המוח ועמוד השדרה בקליפת המוח הראייתית שלם לניתוח אקוטית או כרונית (איור 2). <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. ראש מותאם אישית צלחת הבסיס. (א) להציג לראש בראש בהתאמה אישית ועל צלחת הבסיס המשמשים להכנת דליל, ניתוח בגולגולת. (ב) להציג צד של הראש מחוייט צלחת הבסיס. (C, D) סכמטי מפורט תמונה של צלחת ראש. <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> in vivo בקליפת המוח הראייתית של עכבר ה-GFP-M מהונדס באמצעות שני פוטונים במיקרוסקופ. התמונה היא הקרנה של תמונה אחת להשיג כל 5 מיקרומטר מן פיא לעומק סופי של 175 מיקרומטר. אזור ארוזות מייצג את האזור מוגדל ב (ב) ו - (ג) צילמו ביום 0 (D0) וארבעה ימים מאוחר יותר (D4). (D, E) הגדלה גבוהה של הסניף הדנדריטים ארוזות B ו-C הוכחת שדרה יציב (ראשי חץ לבן), איבד / קוצים retracting (ראשי חץ אדום) ואת עמוד השדרה החדש (ראשי חץ ירוק). ברים סולם = א 200 מיקרומטר, B, C. 20 מיקרומטר, D, E. 5 מיקרומטר.

<ol><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
<li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+synaptic+structure+in+sensory+cortical+areas+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo.</a> J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li>
<li>Xu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הדמיה כרונית באמצעות שני פוטונים מיקרוסקופיה הופכת פופולרית יותר ויותר טכניקה ללמוד שינויים מורפולוגיים מופעלות במהלך 2-5 הפלסטיות. כאן אנו מדגימים הכנה דליל, גולגולת לעקוב הקוצים הדנדריטים מזוהה במוח העכבר על ימים שלמים הדמיה שונים. בפרוטוקול זה, הגולגולת נותר בשלמותו, גרימת נזק מינימלי לקליפת המוח וכתוצאה מכך רמות נמוכות מאוד של neuroinflammation אשר עשוי לשנות את תפקוד המוח 6. זה מאפשר את החיה להיות צילמו מיד לאחר הניתוח הראשון ולאחר מכן reimaged ימים לאחר...

<table><tbody><tr><td>פנטניל ציטראט</td><td></td><td>בתוך המוסד</td><td></td><td>תערובת פנטניל: תערובת חומרי הרדמה;&lt;br/&gt;מינון IP: 0.0125 מ"ל/גרם&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;ריכוז תמיסת קוקטייל סופית: 0.05 mg/kg</td></tr><tr><td>מדעטומידין הידרוכלוריד</td><td></td><td>בתוך המוסד (In House)</td><td></td><td>תערובת פנטניל: תערובת חומרי הרדמה;&lt;דימות in vivo באמצעות מיקרוסקופיית סריקה בלייזר דו-פוטונית (2PLSM) מאפשר את חקירת תאים חיים ותהליכים עצביים במוח השלם. הטכניקה המוצגת כאן מאפשרת דימות של אותו אזור במוח במספר נקודות זמן (דימות כרוני) ברזולוציה מיקרוסקופית המאפשרת מעקב אחר קוצים דנדריטיים, שהם המבנים הקטנים המהווים את מרבית האתרים הפוסט-סינפטיים המעוררים במערכת העצבים המרכזית (CNS). היכולת להבחין בבירור במבנים קורטיקליים עדינים לאורך מספר נקודות זמן בעלת יתרונות רבים, ובמיוחד בחקר פלסטיות מוחית, שבה שינויים מורפולוגיים בסינפסות ועיצוב מחדש של מעגלים עשויים לסייע בהסבר המנגנונים העומדים בבסיסן. בסרטון זה ובחומרים הנלווים, אנו מציגים פרוטוקול לדימות כרוני in vivo של המוח השלם באמצעות הכנה של גולגולת מודקת (thinned-skull preparation). הכנה של גולגולת מודקת היא גישה זעיר-פולשנית, המונעת נזק פוטנציאלי לקרום העבה (dura) ו/או לקורטקס, ובכך מפחיתה את התפתחות התגובה הדלקתית. כאשר פרוטוקול זה מבוצע נכון, ניתן לנטר בבירור שינויים במאפייני הקוצים הדנדריטיים במוח השלם לאורך תקופה ממושכת.&gt;מינון IP: 0.0125 מ"ל/ג'&lt;דימות במודל חי (in vivo) באמצעות מיקרוסקופיה של סריקת לייזר דו-פוטונית (2PLSM) מאפשרת את חקר התאים החיים והתהליכים העצביים במוח שלם. הטכניקה המוצגת כאן מאפשרת דימות של אותו אזור במוח במספר נקודות זמן (דימות כרוני) ברזולוציה מיקרוסקופית, המאפשרת מעקב אחר קוצים דנדריטיים, שהם המבנים הקטנים המהווים את מרבית האתרים העשירים פוסט-סינפטיים במערכת העצבים המרכזית (CNS). ליכולת להבחין בבירור במבנים קורטיקליים עדינים לאורך מספר נקודות זמן ישנם יתרונות רבים, במיוחד בחקר הפלסטיות של המה, שבו שינויים מורפולוגיים בסינפסות ועיצוב מחדש של מעגלים עשויים לסייע בהסברת המנגנונים העומדים בבסיסם. בסרטון זה ובחומרים הנלווים, אנו מציגים פרוטוקול לדימות כרוני במודל חי של מוח שלם באמצעות הכנה של גולגולת מודקה (thinned-skull). הכנת גולגולת מודקה היא גישה עם פולשנות מינימלית, המונעת נזק פוטנציאלי לדורה (קרומי הגולגולת) ו/או לקורטקס, ובכך מפחיתה את התפתחות התגובה הדלקתית. כאשר פרוטוקול זה מבוצע כהלכה, ניתן לנטר בבירור שינויים במאפייני הקוצים הדנדריטיים במוח שלם לאורך תקופה ממושכת.&gt;&lt;br/&gt;ריכוז סופי של תערובת: 0.05 mg/kg</td></tr><tr><td>מידזולאם HCl</td><td></td><td>בתוך המבנה</td><td></td><td>תמיסת פנטניל: תמיסת הרדמה;&lt;br/&gt;מינון IP: 0.0125 מ"ל/ג'&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;ריכוז תמיסת קוקטייל סופית: 0.05 mg/kg</td></tr><tr><td>2,2,2-טריברומו&amp;#8211;אתנול </td><td></td><td></td><td></td><td>תערובת אברטין (Avertin Cocktail): חומר הרדמה;&lt;br/&gt;מינון IP: 0.0075 סמ"ק/גרם&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;ריכוז תמיסת קוקטייל סופית: 1%</td></tr><tr><td>2-methyl-2-butanol (ריכוז סופי: 0.775%)</td><td></td><td></td><td></td><td>תערובת אברטין (Avertin Cocktail): חומר הרדמה;&lt;br/&gt;מינון IP: 0.0075 cc/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;ריכוז תמיסה סופית: .775%</td></tr><tr><td>מערכת בקרת טמפרטורה TC-1000 לעכברים</td><td></td><td>.CWE, Inc</td><td>עכבר TC-1000</td><td>ויסות טמפרטורת הגוף</td></tr><tr><td>Toberadex</td><td></td><td>במעבדה</td><td></td><td>משחה לעיניים</td></tr><tr><td>10% Ferric Chloride</td><td></td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3120-32</td><td>הכנה של גולגולת דקה</td></tr><tr><td>להב מיקרו-כירורגי</td><td></td><td>Sable Industries</td><td>S-6400</td><td>הכנת גולגולת מדוקקת</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate 404,401</td><td></td><td>Loctite</td><td>מק"ט 46551</td><td>הכנת גולגולת מודקה</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate 401</td><td></td><td>Loctite</td><td>מק"ט 40140</td><td>הכנת גולגולת דקה</td></tr><tr><td>מאיץ דבק Zip Kicker</td><td></td><td>טכנולוגיית Pacer</td><td>PT-29</td><td>הכנה של גולגולת מדללת</td></tr><tr><td>מקדחים זעירים מפלדה, קוטר ראש 0.7 מ"מ</td><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-07</td><td>הכנת גולגולת מודקה</td></tr><tr><td>תיבת בקרה של מיקרו-מומנט ויחידת יד Tech2000</td><td></td><td>Ram Products, Inc.</td><td>TECH2000ON/OFF</td><td>הכנת גולגולת מדוקקת</td></tr><tr><td>תפר משי מס' 6-0 (0.7 מטרי)</td><td></td><td>Ethicon Inc.</td><td>K8894H</td><td>קונוס C-1</td></tr><tr><td>פינצטה לחבישת עיניים, 10 ס"מ, רוחב קצה 0.5 מ"מ, מעוקלת</td><td>כלים כירורגיים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>מספרי Bonn עדינים במיוחד, 8.5 ס"מ, קצה ישר, קצה חיתוך 13 מ"מ</td><td>כלים כירורגיים</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה סטנדרטית לדגימה, ישרה, קצה 2.5 מ"מx1.35 מ"מ, 12 ס"מ</td><td>כלי ניתוח</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה כרונית של עכבר-visual cortex שימוש ההכנה סחוט הגולגולת

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

בשנת vivo הדמיה באמצעות שני פוטונים לייזר מיקרוסקופיית (2PLSM) מאפשר לימוד של תאים חיים תהליכים עצביים במוח שלם. הטכניקה המוצגת כאן מאפשרת הדמיה של אותו אזור של המוח במספר נקודות זמן (הדמיה כרונית) עם רזולוציה מיקרוסקופי המאפשר מעקב של הקוצים הדנדריטים שהם מבנים קטנים המייצגים את רוב אתרי מעוררים postsynaptic במערכת העצבים המרכזית. היכולת בבירור לפתור מבנים קורטיקליים קנס על מספר נקודות זמן יש יתרונות רבים, במיוחד במחקר של פלסטיות המוח שבו שינויים מורפולוגיים על הסינפסות שיפוץ מעגל עשוי לעזור להסביר את המנגנונים. בחומר וידאו משלימים זה, אנו מראים פרוטוקול עבור כרונית in vivo הדמיה של המוח שלם באמצעות הכנה דליל-הגולגולת. ההכנה סחוט הגולגולת היא גישה פולשנית, אשר ימנע נזק אפשרי ואת הדורה / או קליפת המוח, ובכך להקטין את תחילתה של תגובה דלקתית. כאשר בפרוטוקול זה מבוצע כהלכה, אפשר בבירור לעקוב אחר השינויים המאפיינים עמוד השדרה הדנדריטים במוח שלם על פני תקופה ממושכת.

בחומר וידאו משלים זה, אנו מראים פרוטוקול עבור כרונית<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של המוח שלם באמצעות הכנה דליל-הגולגולת.

הדמיה כרונית של עכבר-Visual Cortex שימוש ההכנה סחוט הגולגולת

דימות בחי (in vivo) באמצעות מיקרוסקופיית סריקה לייזר דו-פוטונית (2PLSM) מאפשרת את חקרם של תאים חיים ותהליכים נוירונליים במוח השלם. ה...

קוצים דנדריטיים הם בליטות ממברנה מהדנדריט של נוירון המקבלות קלט סינפטי. התארכות, התכווצות, הופעה או היעלמות של קוצים מתרחשות בתגובה לשינויים בתפקוד הרשת העצבית הנובעים מדפוסים ספציפיים של פעילות עצבית. תופעה זו ידועה כפלסטיות קורטיקלית, המשמשת לצפייה בשינויים מורפולוגיים בקוצים דנדריטיים.בבעלי חיים חיים, לוח דימוי מוצמד לגולגולת של עכבר. אזור בגולגולת מודק surgically ונדרשים תמונות בהגדלה נמוכה וגבוהה. האזורים נסרקים שוב בנקודות זמן מאוחרות יותר.התוצאות שהתקבלו מראות כי ניתן להדמיות באופן ברור את מורפולוגיית הקוצים הדנדריטיים באמצעות הכנת גולגולת דקה בנקודות זמן מרובות. כמו כן, מורפולוגיית הקוצים היא פלסטית מאוד, ומציגה שינויים במבנה וכן הופעה והיעלמות של קוצים דנדריטיים. שלום, אני אמילי קלי מהמעבדה של אנאיה מאקה במחלקה לנוירוביולוגיה ואנטומיה באוניברסיטת רוצ'סטר.היום נדגים את ההליך לצילום כרוני של קורטקס הראייה בעכבר בעקבות הכנה מסוג חלון קריסטלי. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את קצב התחלופה של קוצי דנדריטים. אז בואו נתחיל.התחילו את הפרוצדורה בסטריליזציה של הכלים לניתוח אספטי. לאחר מכן, סטריליזו את מרחב העבודה באמצעות 70% ethanol וכסו את משטח הניתוח בבתחבשה נקייה. נטרו את עומק ההרדמה בעכבר שהורדם באמצעות תערובת פנטניל על ידי בדיקת תגובתו לצביטה בבוהן; העכבר המוצג כאן הוא עכבר טרנסגני A-G-F-P-M שבו מבוטא GFP.בשכבה חמישה קיימים תאי פרא-מטאלים השולחים שלוחות דנדריטיות לשכבות השטחיות. כדי לשמור על טמפרטורת גוף של 37.5 °C, הניחו את בעל החיים על שמיכת חימום ועקבו אחריו באמצעות מדחום רקטלי מחובר. לאחר מכן, מרחו משחה עינית על העיניים באמצעות מספריים כדי למנוע את התייבשותן.הסר את הפרווה מהחלק האחורי של ראש העכבר, מאזור מאחורי האוזניים ועד העיניים. לאחר מכן, נקה את חלקו העליון של ראש החיה באמצעות יישום של 70% ethanol, ולאחר מכן קרצוף ב-Betadine ותמיסת Betadine. בצע חתך LCU מאחורי האוזניים וסבב לאורך הצד הימני או השמאלי של קו האמצע, בהתאם להמיספירה שצולמה, עד לעיניים, וקפל את העור הרחק מאזור הניתוח.אין להסיר את העור, שכן הוא ייסגר מאוחר יותר באמצעות תפרים בעזרת פינצטה עדינה. משכו בעדינות את העור כלפי מעלה והרחיקו אותו מאזור העניין. בעזרת פינצטה נקייה, גרדו בעדינות את הפריאוסטאום (periosteum) מהאזור החשוף של הגולגולת.מרחו כמות קטנה של תמיסת fair chloride בריכוז 10% על הגולגולת כדי לייבש לחלוטין את קרומי הפריאוסטאום (periosteum) ולוודא שהם הוסרו במלואם. חשוב שהגולגולת תהיה יבשה לחלוטין. כדי להבטיח הידבקות תקינה של הדבק, גרדו בעדינות את שאריות קרומי הפריאוסטאום היבשים באמצעות להב מיקרו-כירורגי.בשלב הבא, מרחו שכבה דקה של דבק אקרילי מסוג Sano מסביב לחלון ההדמיה של לוחית הראש מנירוסטה והצמידו את הלוחית לגולגולת. בעזרת הקצה העץ של מקל צמר גפן, מרחו דבק בתפרים הפנימיים של חלון ההדמיה, תוך הקפדה על מילוי כל הרווחים שבין לוחית ההדמיה לקימור הגולגולת. טפטפו טיפה של מאיץ דבק אל תוך החלון.לאחר מכן, נגבו במהירות את העודפים. המתינו לייבוש מלא של הדבק. באמצעות מקדח שיניים המצויד בקוצב (burr) מפלדת אל-חלד בקוטר 0.7 millimeter, התחילו לדלל את הגולגולת בחלון הדימוי.בצע קידוח לסירוגין עם יישום מזדמן של 0.9% sterile saline, כדי למנוע יצירת חום רב מדי על הגולגולת. דקק חלון של ארבעה על ארבעה מילימטרים בגולגולת באמצעות תנועות קטנות על פני שטח הגולגולת.בעזרת מקדחת שיניים. יש לבדוק את עובי הגולגולת באמצעות פינצטה בעלת קצה קהה. פני השטח של הגולגולת ישקעו מעט תחת לחץ עדין.עובי הגולגולת האופטימלי לדימוי הוא בין 10 ל-30 מיקרון. לאחר דילול הגולגולת, נקה את החלון משאריות פסולת והנח תמיסת סלין על הגולגולת. צלם את חלון הדימוי באמצעות מצלמה דיגיטלית המורכבת על מיקרוסקופ דיסקציה.כלי הדם במוח בתצלום זה יסייעו באיתור המיקום להנחת לוח הדימות עבור מפגשי דימוי עוקבים. העבירו את בעל החיים למערך הדו-פוטון. בעל החיים צריך להישאר על שמיכת החימום ויש לנטר את טמפרטורת הגוף באופן רציף לאורך כל מפגש הדימוי.מיקרוסקופ דו-פוטוני עם לייזר mi tai. נעשה שימוש במשאבה במצב מוצק בהספק 10 watt להשגת עוצמה מקסימלית וביחידת קונפוקלית flow view של Olympus שעברה התאמה. המערכת מותאמת לדימוי של רקמות עמוקות, וגלאים חיצוניים מותקנים קרוב ככל האפשר לעדשה כדי לאפשר זיהוי מקסימלי של פלואורסצנציה מהמוח; יש להוסיף טיפה של תמיסת סליין לחלון הדימוי תוך שימוש בזום דיגיטלי נמוך.זהה אזור המכיל נוירונים המסומנים בצורה בהירה באמצעות מצלמה דיגיטלית המחוברת למיקרוסקופ. לאחר מכן, צלם את אזור הדימוי. פעולה זו נחוצה כדי לחזור לאותו מיקום דימוי בנקודת זמן עוקבת.השיגו סדרת תמונות (stack) בהגדלה נמוכה לאורך כל ההיקף הנראה של המוח, המציגה את מידת הסתעפות הדנדריטים. סדרה זו תשמש לאיתור אזור הדימות בנקודות זמן עוקבות, שכן הן כלי הדם והן הדנדריטים שומרים על מבנהם בבעלי חיים צעירים ובוגרים באמצעות תוכנת דימוי.הגדילו את ההגדלה הדיגיטלית פי שמונה, התאימו את קואורדינטות XY במידת הצורך, ואספו סדרת תמונות (stack) בהגדלה גבוהה, אשר תציג מורפולוגיה דנדריטית מפורטת, כולל המיקומים והמבנה של קוצים דנדריטיים. רשמו הערות מפורטות לגבי כל איסוף סדרה, כולל קואורדינטות ניווט (pan), טווח האיסוף, גודל צעד ה-Z ומספר הצעדים בסדרה. הערות אלו ישמשו בעת החזרה לדנדריט או לאקסון זה בנקודת זמן מאוחרת יותר.לאחר הדמיון, הסר את פלטת הראש על ידי הפרדה עדינה שלה מפני השגולגולת. בעזרת פינצטה, הסר שאריות דבק ונגב את הגולגולת עם סליין סטרילי 0.9%.תפרו את העור מעל הגולגולת באמצעות חוט תפר מספר 6. נגבו את האזור ב-70% ethanol לאחר סיום הליך הדימוי. הניחו את החיה בכלוב נקי תחת מנורת חימום עד להתעוררותה ויכולתה לנוע.לאחר מכן, החזירו את בעל החיים לכלובו המקורי כדי לדמות אותו שוב בנקודת זמן מאוחרת יותר, בטווח של יומיים עד מספר חודשים; הסירו את התפרים ופתחו מחדש את העור באזור הראש. בשימוש בשיטות אספטיות, השתמשו בתמונה הדיגיטלית של כלי הדם במוח שצולמה במהלך הניתוח הראשון כדי לאתר את מיקום הדימוי המקורי. לאחר מכן, קבעו מחדש את לוחית הראש כפי שנעשה בעבר.השתמשו בלהב מיקרו-כירורגי כדי לדלל בעדינות כל עצם שייתכן שצמחה מחדש בין נקודות הזמן של הדימות, במידת הצורך. דללו באמצעות מקדחה דנטלית, נקו את חלון הדימות משאריות והחילו טיפה של 0.9% sterile saline. העבירו את בעל החיים למיקרוסקופ דו-פוטוני ואתרו את אזור הדימות המקורי באמצעות התמונה הפלואורסצנטית הדיגיטלית שצולמה במהלך הסשן הקודם.הפעל את תוכנת תצוגת הזרימה. פתח את תמונת המקור בהגדלה נמוכה, הצמד דף שקיפות למסך המחשב ושרטט את דפוס כלי הדם העיקריים באמצעות טוש שקיפות. לאחר מכן, פתח את התמונה בשידור חי ויישר מחדש את כלי הדם בהתאם לדפוס ששורטט על דף השקיפות.הסיר את דף השקיפות כדי לצלם מחדש את המבנים במגדילה של שמונה פעמים. פתח את ערימת התמונות (stack) הרצויה שנאספה במפגש הצילום הקודם. שרטט את המבנה על דף שקיפות המודבק למסך המחשב.בצעו הגדלה של פי שמונה (8x) מהתמונה החיה ויישרו את התמונה עם השקיפות. בהתאם לדיוק של יישור המיקום בהגדלה נמוכה, ייתכן שיהיה צורך לכוון מעט גם את זווית התמונה. הגדירו את קואורדינטות הסריקה (pan) לפרמטרי ההדמיה של היום הראשון, כולל גודל הצעד ומספר התמונות לאיסוף. ניתן לבצע את הדמיות ה-Z-stack פעמיים. יש להגביל את מספר הפעמים שבהן נפתחת הקרקפת כדי למנוע פגיעה בשלמות הגולגולת, דבר שיוביל לרזולוציית הדמיה נמוכה בעכברים המבטאים GFPM.תת-קבוצה של תאי parametal בשכבה חמש ותהליכים דנדריטיים תואמים הודגמו באמצעות מיקרוסקופיה סורקת דו-פוטונית in vivo; כאן מוצגים דנדריטים של קליפת המוח הוויזואלית המסומנים ב-GFP. תמונה זו היא היטל של תמונה בודדת שהושגה בכל 5 µm מה-PIA ועד לעומק סופי של 175 µm. האזור הממסגר מוצג כאן בהגדלה גבוהה יותר ביום אפס, ושוב כאן ביום רביעי; מוצגת השוואה של הגדלה גבוהה יותר של תמונה של ענף דנדריטי מיום אפס ומיום רביעי.תמונות אלו מדגימות קוצים יציבים המסומנים בחצי חצים לבנים, קוצים נסוגים שאבדו המסומנים בחצי חצים אדומים, וקוצים חדשים המסומנים בחצי חצים ירוקים. כעת הצגנו בפניכם כיצד לבצע דימיון כרוני בדו-פוטון בקליפת המוח הראייתית של עכבר באמצעות הכנה של גולגולת דקה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להקפיד במיוחד במהלך תהליך הדילול כדי למנוע נזק לגולגולת ולדורה שמתחתיה, שכן הדבר יגרום לרזולוציית דימיון נמוכה, וכן לרשום הערות מפורטות.זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

chronic-imaging-mouse-visual-cortex-using-thinned-skull

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

זה וידאו פרוטוקול להדגים כיצד השתל מכוסה זכוכית חלון גולגולתי במכרסמים. תכשירים אלה יכולים לשמש כרונית in vivo שני הפוטונים הדמיה של הניאוקורטקס על סולמות זמן של חודשים. זה יכול לשמש גם עבור סוגים אחרים של הדמיה, כולל הדמיה אופטית אות מהותי.

כירורגיה Craniotomy נוהל הדמיה מוחית כרונית

אנו מתארים שיטה שוב ושוב לדמיין microglia Murine והפצת...

הגולגולת דק חלון טכניקה כרונית דו פוטון ב-vivo הדמיה של microglia Murine של מודלים של Neuroinflammation

אנו מציגים שיטה ליצירת חלון הדמיה בגולגולת העכבר החובקת מילימטרים והוא יציב במשך חודשים ללא דלקת של המוח. שיטה זו גם מתאים מחקרים ארוכי טווח של זרימת דם, דינמיקה סלולריים, ותא / מבנה כלי הדם באמצעות שני פוטונים במיקרוסקופ.

מלוטשת מחוזק דליל, הגולגולת חלון הדמיה לטווח ארוך של מוח עכבר

על ידי שילוב של-גולגולת דקה מלוטשת ומחוזקת (יציאות) גולגולתי חלון והזרקת גליובלסטומה (GBM) תא, אנו יכולים לצפות בייזום וצמיחה מתאים מוזרקים GBM במוח של עכבר חי longitudinally גליומה.

הדמית Glioma ייזום<em&gt; In Vivo</em&gt; דרך חלון גולגולתי מלוטש ומחוזק-גולגולת דקה

אנו מציגים שיטה ליצירת חלון גולגולת דללה קליפת מוח (TSCW) במודל של עכברים...

טכניקת חלון קליפת מוח, גולגולת דקה יותר עבור<em&gt; In Vivo</em&gt; טומוגרפיה קוהרנטיות אופטית הדמיה

הדמיית זמן-lapse בבעל חיים חי מספקת מידע רב ערך על ארגון מחדש מבני במוח השלם. כאן, אנו מציגים תכשיר גולגולת דק המאפשר הדמיה טרנס-גולגולתית של מבנים סינפטיים בעלי תווית פלואורסצנטית בקליפת העכבר החי על ידי מיקרוסקופ דו-פוטוני.

שני פוטונים<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של קוצים הדנדריטים בCortex העכבר באמצעות דלילה, גולגולת הכנה

טראומה מוחית חריפה היא פגיעה חמורה שאין לה טיפול הולם עד כה. מיקרוסקופיה multiphoton מאפשרת לימוד אורכי התהליך של התפתחות טראומה המוחית חריפה וחיטוט אסטרטגיות טיפוליות במכרסמים. שני דגמים של טראומה מוחית חריפה למדה אצל בשני פוטונים הדמיה vivo של המוח הם הפגינו בפרוטוקול זה.

טראומה מוחית חריפה בעכברים אחריו שני פוטונים הדמיה אורכית

כתב יד זה מתאר הליך לעקוב אחר השיפוץ של cerebrovasculature במהלך הצטברות פלאק עמילואיד in vivo באמצעות שני פוטונים במיקרוסקופ אורך. הכנה הגולגולת דליל מאפשר הדמיה של צבעי ניאון כדי להעריך את התקדמות הנזק כלי דם במוח במודל של עכברים של מחלת אלצהיימר.

אֹרכִּי<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של Cerebrovasculature: רלוונטיות למחלות של מערכת העצבים המרכזית

פרוטוקול זה מתאר טכניקת השרשה כרונית חלון הגולגולת שניתן להשתמש בהם עבור הדמיה האורך של מבנים נוירווליו-כלי דם, אינטראקציות, ותפקוד בתנאים בריאים ונגועים. היא משמשת כחלופה משלימה לגישת הדימות הtranscranial, שבזמן הרצוי לעתים קרובות, יש כמה מגבלות קריטיות.

מיפוי המוח מדויק לבצע חוזרות ונשנות של הדמיה Vivo של נוירודינמיקה החיסונית בעכברים

מוצג כאן פרוטוקול להשתלת חלון גולגולתי כרוני להדמיה אורכית של תאי מוח בעכברים ערים ומרוסנים ראש.

השתלת חלון גולגולת להדמיה חוזרת ונשנית In Vivo בעכברים ערים

למדו הדמיה כרונית של קליפת המוח הויזואלית בעכברים באמצעות הכנת גולגולת מורדדת. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר דינמיקת קוצי דנדריטים ומנגנוני פלסטיות מוחית לאורך זמן.

הדמיה כרונית של עכבר-Visual Cortex שימוש ההכנה סחוט הגולגולת

גלה סרטונים נוספים