הדמיה כרונית של עכבר-Visual Cortex שימוש ההכנה סחוט הגולגולת

קוצים דנדריטיים הם בליטות ממברנה מהדנדריט של תא העצב המקבלות קלט סינפטי. התארכות, התכווצות או היעלמות של עמודי שדרה מתרחשים בתגובה לשינויים בתפקוד הרשת העצבית הנובעים מדפוסים ספציפיים של פעילות עצבית. תופעה זו ידועה בשם פלסטיות קליפת המוח כדי לצפות בשינויים מורפולוגיים בקוצים דנדריטיים.

בבעלי חיים חיים, לוחית הדמיה מודבקת לגולגולת של עכבר. אזור בגולגולת מדולל בניתוח ונדרשות תמונות בהגדלה נמוכה וגבוהה. לאחר מכן האזורים עוברים תמונה מחדש בנקודות זמן מאוחרות יותר.

התוצאות שהתקבלו מראות כי ניתן לדמיין בבירור את המורפולוגיה של עמוד השדרה הדנדריטי באמצעות הכנת גולגולת דקה במספר נקודות זמן. והמורפולוגיה של עמוד השדרה היא פלסטית מאוד, ומראה שינויים במבנה וגם מראה והיעלמות של קוצים דנדריטיים. היי, אני אמילי קלי במעבדה של Anaya Maka במחלקה לנוירוביולוגיה ואנטומיה באוניברסיטת רוצ'סטר.

היום נראה לך נוהל להדמיה כרונית של קליפת המוח של בקבוקון העכבר בעקבות סנפירים הנקראים הכנה. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור את תחלופת עמוד השדרה הדנדריטית. אז בואו נתחיל.

התחל את ההליך על ידי עיקור הכלים לניתוח אספטי. לאחר מכן עקר את סביבת העבודה באמצעות אתנול 70% וכסה את משטח ההפעלה בחבישה נקייה. עקוב אחר עומק ההרדמה בעכבר מורדם קוקטייל פנטניל על ידי בדיקת תגובתו לצביטה בבוהן העכבר המוצג כאן הוא עכבר טרנסגני A-G-F-P-M שבו מתבטא GFP.

בשכבה חמש תאי פרמטאל המקרינים תהליכים דנדריטיים לשכבות שטחיות. כדי לשמור על טמפרטורת גוף של 37.5 מעלות צלזיוס, הניחו את החיה על שמיכת חימום ועקבו אחריה באמצעות מדחום רקטלי מחובר. לאחר מכן מרחו משחה עיניים על העיניים כדי למנוע מהן להתייבש באמצעות מספריים.

הסר את השיער מהחלק האחורי של ראש העכבר מאחורי האוזניים לעיניים. לאחר מכן נקו את החלק העליון של ראש החיה עם מריחה של 70% אתנול, ואחריו קרצוף בטדין ותמיסת בטדין. בצע חתך LCU מאחורי האוזניים ולמעלה לאורך הצד הימני או השמאלי של קו האמצע, תלוי באיזו המיספרה תצולם לעיניים, קפל את העור מעל והרחק ממקום הניתוח.

אין להסיר את העור מכיוון שהוא ייתפר מאוחר יותר באמצעות מלקחיים עדינים. משוך בעדינות את העור כלפי מעלה והרחק מאזור העניין. בעזרת מלקחיים נקיים, יש לגרד בעדינות את הפריאוסטאום מהאזור החשוף של הגולגולת.

מרחו כמות קטנה של 10% כלוריד בהיר על הגולגולת כדי לייבש לחלוטין את קרום הפריאוסטאום ולוודא שהוא הוסר לחלוטין. חשוב שהגולגולת תהיה יבשה לחלוטין. כדי להבטיח הדבקה נכונה של הדבק, מגרדים בעדינות את קרום ה-periosteum המיובש בעזרת להב מיקרו-כירורגי.

לאחר מכן, מרחו שכבה דקה של דבק אקרילי סנו סביב חלון ההדמיה של לוחית ראש הנירוסטה והצמידו את הצלחת לגולגולת. בעזרת קצה העץ של צמר גפן, מרחו דבק על התפרים הפנימיים של חלון ההדמיה, והקפידו למלא את כל הרווחים בין לוחית ההדמיה לעקמומיות הגולגולת. הניחו טיפה של מאיץ הדבק לחלון.

ואז נגב במהירות את העודפים. הניחו לדבק להתייבש לאחר שהדבק התייבש לחלוטין. בעזרת מקדחה דנטלית המודבקת עם קוץ נירוסטה 0.7 מילימטר, התחל לדלל את הגולגולת בחלון ההדמיה.

קידוח חלופי עם מריחה מזדמנת של 0.9% מי מלח סטריליים. כדי להימנע מיצירת חום רב מדי על הגולגולת. דק חלון של ארבעה על ארבעה מילימטר על הגולגולת באמצעות משיכות קטנות על פני הגולגולת.

עם מקדחה דנטלית. בדוק את דקיקות הגולגולת בעזרת מלקחיים קהים. משטח הגולגולת ייכנס מעט בלחץ עדין.

עובי הגולגולת האופטימלי להדמיה הוא בין 10 ל-30 מיקרון. לאחר דילול הגולגולת, נקו את החלון מכל הפסולת והניחו מי מלח על הגולגולת. צלם את חלון ההדמיה באמצעות מצלמה דיגיטלית המותקנת על טווח ניתוח.

כלי הדם במוח בתצלום זה יסייעו באיתור המיקום להצבת לוחית ההדמיה עבור מפגשי ההדמיה הבאים. העבר את החיה למתקן שני הפוטונים. החיה צריכה להישאר על שמיכת החימום ויש לעקוב אחר טמפרטורת הגוף באופן רציף לאורך כל סשן ההדמיה.

מיקרוסקופ שני פוטונים עם לייזר מי טאי. נעשה שימוש במשאבת מצב מוצק של 10 וואט להספק מרבי ויחידה קונפוקלית של תצוגת זרימת אולימפוס שונה. המערכת מותאמת להדמיית רקמות עמוקות ומותקנים גלאים חיצוניים קרוב ככל האפשר למטרה כדי לאפשר זיהוי מקסימלי של פלואורסצנטיות מהמוח, הוספת טיפת מלח לחלון ההדמיה באמצעות זום דיגיטלי נמוך.

זהה אזור המכיל נוירונים עם תוויות בהירות באמצעות מצלמה דיגיטלית המקובעת למיקרוסקופ. Ips, צלם את אזור ההדמיה. זה הכרחי כדי לחזור לאותו מיקום הדמיה בנקודת זמן שלאחר מכן.

השג ערימת הגדלה נמוכה דרך כל ההיקף הנראה לעין של המוח המראה את היקף ההשלכות הדנדריטיות. זה ישמש לאיתור אזור ההדמיה בנקודות זמן עוקבות הן ככלי דם והן כדנדריטים. לשמור על המבנה שלהם בבעלי חיים צעירים ובוגרים באמצעות תוכנת הדמיה.

הגדל את ההגדלה הדיגיטלית פי שמונה, התאם את קואורדינטות ה-XY במידת הצורך, ואסוף ערימת הגדלה גבוהה, שתציג מורפולוגיה דנדריטית מפורטת כולל המיקומים והמבנה של קוצים דנדריטיים. רשום הערות מפורטות לגבי כל אוסף ערימה, כולל קואורדינטות פאן, טווח האוסף, גודל שלב Z ומספר השלבים בערימה. הערות אלה ישמשו כאשר חוזרים לדנדרי או לאקסון זה בנקודת זמן עוקבת.

לאחר ההדמיה, הסר את לוחית הראש על ידי הפרדתה בעדינות משטח הגולגולת. שימוש במלקחיים. הסר את כל שאריות הדבק ונגב את הגולגולת במי מלח סטריליים של 0.9%.

לתפור את העור מעל הגולגולת יחד באמצעות חוט תפר מספר שש. נגב את האזור עם 70% אתנול לאחר הליך ההדמיה. הניחו את החיה בכלוב נקי מתחת למנורת חום עד שהיא מתעוררת וניידת.

לאחר מכן החזירו את החיה לכלוב המקורי שלה כדי לצלם את החיה שוב במועד מאוחר יותר בין יומיים לחודשים רבים לאחר מכן, הסירו את התפרים ופתחו מחדש את העור על הראש. באמצעות שיטות אספטיות, השתמש בתמונה הדיגיטלית של כלי הדם במוח שצולמה במהלך הניתוח הראשון כדי לאתר את מיקום ההדמיה המקורי. לאחר מכן תקן מחדש את לוחית הראש כמו קודם.

השתמש בלהב מיקרו-כירורגי כדי לדלל בעדינות כל עצם שאולי צמחה מחדש בין נקודות זמן הדמיה במידת הצורך. דק בעזרת מקדחה דנטלית, נקה את חלון ההדמיה מפסולת והחל טיפה של 0.9% מי מלח סטריליים. נשא את החיה למיקרוסקופ של שני פוטונים ואתר את אזור ההדמיה המקורי באמצעות התמונה הפלואורסצנטית הדיגיטלית שצולמה במהלך הפגישה הקודמת.

הפעל את תוכנית תצוגת הזרימה. פתחו את התמונה המקורית בהגדלה נמוכה, הדביקו גיליון שקיפות על מסך המחשב ושרטטו את תבנית כלי הדם העיקריים באמצעות עט שקיפות. לאחר מכן, פתח את התמונה החיה ויישר מחדש את כלי הדם לתבנית המשורטטת על סרט השקיפות.

הסר את השקיפות כדי לדמיין מחדש את שמונה המבנים המוגדלים. פתח את הערימה הרצויה שנאספה מהפעלת ההדמיה הקודמת. שרטטו את המבנה על סרט שקיפות המוצמד למסך המחשב.

התקרב פי שמונה מהתמונה החיה ויישר את התמונה עם השקיפות. בהתאם לדיוק של יישור מיקום ההגדלה הנמוכה, ייתכן שיהיה צורך גם להתאים את זווית התמונה מעט להגדיר את קואורדינטות הפאן לפרמטרי ההדמיה של היום הראשון, כולל גודל הצעד ומספר התמונות שאוספות את ההדמיה מחדש של Zack ניתן לבצע פעמיים. יש להגביל את מספר הפעמים שהקרקפת נפתחת כדי למנוע שיבוש שלמות הגולגולת, מה שיגרום לרזולוציית הדמיה ירודה בעכברים המבטאים GFPM.

תת-קבוצה של תאי פרמטאל בשכבה חמש ותהליכים דנדריטיים תואמים הודגמו באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר שני פוטונים in vivo כאן, מוצגים דנדריטים של קליפת המוח החזותית המסומנים ב-GFP. תמונה זו היא הקרנה של תמונה בודדת המתקבלת כל חמישה מיקרון מה-PIA לעומק סופי של 175 מיקרון. האזור הקופסא מוצג בהגדלה גבוהה יותר כאן ביום האפס, ושוב ביום הרביעי כאן, הגדלה גבוהה יותר של תמונת ענף דנדריטי מיום האפס ליום הרביעי.

תמונות אלה מדגימות קוצים יציבים המסומנים על ידי ראשי החצים הלבנים שאבדו קוצים נסוגים, המסומנים על ידי ראש חץ אדום וקוצים חדשים המסומנים על ידי ראש החץ הירוק. זה עתה הראינו לכם כיצד לבצע הדמיה כרונית של שני פוטונים בקליפת המוח הראייתית של העכבר באמצעות הכנת גולגולת דקה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לנקוט בזהירות מיוחדת במהלך תהליך הדילול כדי למנוע נזק לגולגולת ולדורה הבסיסית מכיוון שהדבר יגרום לרזולוציית הדמיה ירודה ולרשום הערות מפורטות.

אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.