טולדין כחול מכתים סעיפים שרף-מוטבע להערכת המורפולוגיה במערכת העצבים ההיקפית

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומים של פגיעה והתחדשות עצבית היקפית כגון מהי המורפומטריה של עצב היקפי, כמה אקסונים קיימים, מהו מצב המיאלינציה והאם קיימת רקמה פיברוטית? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של תכונות עצביות. התחל בהנחת חולדה מורדמת במצב שכיבה על גבי מחצלת דיסקציה.

הנח חרוט אף כדי לשמור על הרדמה עם 1-2% איזופלורן. כדי להבטיח עומק הרדמה נאות, בדוק את בעלי החיים לנסיגת דוושה ורפלקסים פלפברליים של כפות הרגליים האחוריות. לאחר השגת עומק הרדמה מתאים, יש לגלח את שיער הגפיים האחוריות ולעקר את האזורים המגולחים באתנול 70%.

משש את עצם הירך כדי לזהות את המיקום הנכון לחתך. עצם הירך ממוקמת ממש קרוב לקטע הנגיש ביותר של העצב הסיאטי. לאחר ביצוע חתך של שניים עד שלושה סנטימטרים בעור לאורך הגפה האחורית מהברך ועד לטרוכנטר הגדול יותר, אתר את המישור בין שריר הזרוע הדו-ראשי לשריר הגלוטאוס מקסימוס.

לאחר מכן השתמש במספריים מיקרו-דיסקציה כדי להפריד את הפאשיה הבסיסית ולחשוף שניים עד שלושה סנטימטרים מהעצב הסיאטי הבסיסי. השתמש במחזיר כדי להרחיב את הפער בין שני השרירים. בעזרת מלקחיים עדינים וקשתית המספריים מפרידים בזהירות את העצב מרקמת החיבור שמסביב, תוך הקפדה יתרה לא לדחוס או לחתוך את העצב.

לאחר מכן, כסו את העצב החשוף עם הקיבוע של טראמפ והניחו לשבת במשך 10 דקות. במידת הצורך, הניחו גזה מתחת לרגל האחורית כדי לשפר את הזווית כך שניתן יהיה להוסיף יותר קיבוע לחלל. הסר את הקיבוע לאחר 10 דקות וחזור על שלב זה פעמיים נוספות.

תחת מיקרוסקופ החיתוך חתכו את העצב הסיאטי משני הצדדים באמצעות מספריים לדיסקציה עדינה, והקפידו לא למתוח או לצבוט את העצב. הכניסו מיד את חלקי העצבים לצינורות של 15 מ"ל המכילים את הפיקסטיב של טראמפ וקבעו בארבע מעלות צלזיוס למשך שבוע, והחליפו את הקיבוע כל 48 שעות. לאחר הקיבוע, הסר בזהירות את כל השומן ורקמות החיבור שנותרו מהעצב, והשתמש באזמל חד כדי לחתוך את העצב למקטעים באורך של כחמישה מילימטרים.

ניתן להפריד מקטעי עצב לצינורות מסומנים שונים. טבלו מקטעי עצב בטטרוקסיד 2% אוסמיום טרי שהוכן למשך שעתיים. בעזרת ערכת הטמעת אפוקסי, הכינו את תערובת ההטבעה הסופית.

מערבבים את מדיום הטמעת האפוקסי עם תמיסת DDSA ומערבבים את מדיום הטמעת האפוקסי עם תמיסת NMA. מערבבים את שתי התמיסות למשך 20 דקות לפחות בעזרת מערבל מגנטי. מיד לפני השימוש, שלב את המאיץ DPM לפתרון B ולאחר מכן שלב אותו עם פתרון A כך שהפרופורציה הסופית של המאיץ תהיה בין נקודה אחת חמש ל-2% מהנפח הכולל.

העבירו את מקטעי העצב לנקודה אחת של צינורות של חמישה מיליליטר ולאחר שטיפה עם PBS, התחילו את תהליך ההתייבשות על ידי החלפת ה-PBS בריכוזים הולכים וגדלים של אצטון ומים מזוקקים למשך 10 דקות כל אחד ואז ב-100% אצטון שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחד. שלב קריטי אחד הוא התייבשות הרקמות. מים ושרף לא יתקשרו, כך שכל מים שנותרו ברקמה לא יחדרו על ידי השרף וישאירו חורים בקטע נטולי איכויות היסטולוגיות.

לחדירת שרף, הנח תחילה את מקטעי העצב בתערובת אחד לאחד של תערובת הטבעה ו-100% אצטון למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, העבירו את הקטעים לתערובת של שניים לאחד של תערובת הטמעה ו-100% אצטון למשך 30 דקות. הניחו את הפרדות העצבים בתבניות הטבעה מגומי סיליקון והוסיפו בעדינות את השרף על גבי העצבים, הקפידו לכסות את כל קטע העצבים תוך הימנעות מבועות אוויר.

השאירו את השרף להתפלמר בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הנח גוש שרף עם עצב מוטבע לתוך מחזיק האולטרה-מיקרוטום כשהצד הטרפזי פונה כלפי מעלה. תוך כדי צפייה דרך האולטרה-מיקרוטום, השתמש בלהב חד פיפיות כדי לקצץ עודפי שרף המקיף את רקמת העצב.

אל תחדור למשטח האורך של קטע העצב הניתן לזיהוי על ידי הצביעה הכהה שלו על ידי אוסמיום טטרוקסיד. בעזרת סכין זכוכית רגילה על האולטרה-מיקרוטום צרו חתכים מרובים כדי לחשוף משטח חתך אחיד של העצב. לאחר שזה נעשה, עבור לסכין זכוכית כשהסירה מלאה במים מזוקקים בטמפרטורת החדר והתאם את האולטרה-מיקרוטום למיקרון אחד עד שניים כדי לחתוך חלקים דקים.

השתמש בלולאת מתכת כדי להעביר חלקים דקים צפים מסירת סכין הזכוכית לטיפת מים נטולי יונים על מגלשת זכוכית. שלב קריטי נוסף הוא במהלך העברת קטע דק מסכין הזכוכית לשקופית. חלקים דקים אלה שבירים מאוד ועלולים להישבר או להתקפל.

לאחר החיתוך, יבש את החלקים בשקופיות על ידי העברת מגלשה מעל להבה מספר פעמים, והקפד לא לחמם יתר על המידה את החלקים. ניתן לאחסן שקופיות בטמפרטורת החדר למשך מספר ימים אם לא מכתימים מיד בכחול טולואידין. כדי להכתים את קטעי העצב, השתמשו בפיפטה מפלסטיק או במיקרו-פיפטר כדי להוסיף טיפה של תמיסת טולואידין כחולה בחלק העליון של חלקי העצב.

לאחר 20 עד 30 שניות, שטפו את כל עודפי התמיסה הכחולה של טולואידין על ידי טבילה עדינה של השקופיות בצנצנת מים נטולי יונים, וחזרו על הפעולה שלוש עד ארבע פעמים עד שהחלקים נקיים. יבש את השקופיות לפחות 15 דקות בחום של 60 מעלות צלזיוס או לילה בטמפרטורת החדר. לאחר הייבוש יש להוסיף אמצעי הרכבה רגיל ולכסות את החלקים בכיסוי.

לבסוף, בדוק את החלקים המותקנים תחת מיקרוסקופ אור. עדשת טבילה בשמן 100X מומלצת לתמונות מפורטות לחישוב יחסי g. קטעי עצב סיאטי משובצים במדיום שרף ומוכתמים בכחול טולואידין הראו תמונות ברורות עם רזולוציה אופטימלית בהגדלת ההגדלה מ-10X ל-20X, 40X ו-60X.

שיטה זו שומרת על מבנה העצב ומאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה ובהגדלה גבוהה המאפשרת מדידה של מספר פרמטרים כגון יחס g, שהוא היחס בין קוטר האקסון, המצוין על ידי החץ המסומן B, לקוטר הסיבים הכולל, המסומן A. מגוון גורמים יכולים להוביל לקטעי עצב היקפיים פחות מאופטימליים, כולל נוכחות של סדקים בקטע עקב טיפול לא נכון בעצב. חורים יכולים להתרחש גם בקטע בגלל התייבשות לא מספקת. שגיאה אפשרית נוספת בהליך היא קיפול החלקים, אותו ניתן לתקן באמצעות לולאות חיסון להעברת חתכים למגלשת הזכוכית.

בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כמו כימות אקסונים כדי לענות על שאלות נוספות כמו מהי מידת ההתחדשות בעצב רגנרטיבי? לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד להשיג מקטע עצב היקפי של מיקרון אחד עד שניים כדי להעריך מורפומטריה עצבית.