טולדין כחול מכתים סעיפים שרף-מוטבע להערכת המורפולוגיה במערכת העצבים ההיקפית
3 ביולי 2018
כאן אנו מציגים פרוטוקול להמחיש ומבנים של העצבים ההיקפיים על ידי קבלת מכתימה את סעיפים 1-2 מיקרומטר עם טולדין כחול
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומים של פגיעה והתחדשות עצבית היקפית כגון מהי המורפומטריה של עצב היקפי, כמה אקסונים קיימים, מהו מצב המיאלינציה והאם קיימת רקמה פיברוטית? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של תכונות עצביות. התחל בהנחת חולדה מורדמת במצב שכיבה על גבי מחצלת דיסקציה.
הנח חרוט אף כדי לשמור על הרדמה עם 1-2% איזופלורן. כדי להבטיח עומק הרדמה נאות, בדוק את בעלי החיים לנסיגת דוושה ורפלקסים פלפברליים של כפות הרגליים האחוריות. לאחר השגת עומק הרדמה מתאים, יש לגלח את שיער הגפיים האחוריות ולעקר את האזורים המגולחים באתנול 70%.
משש את עצם הירך כדי לזהות את המיקום הנכון לחתך. עצם הירך ממוקמת ממש קרוב לקטע הנגיש ביותר של העצב הסיאטי. לאחר ביצוע חתך של שניים עד שלושה סנטימטרים בעור לאורך הגפה האחורית מהברך ועד לטרוכנטר הגדול יותר, אתר את המישור בין שריר הזרוע הדו-ראשי לשריר הגלוטאוס מקסימוס.
לאחר מכן השתמש במספריים מיקרו-דיסקציה כדי להפריד את הפאשיה הבסיסית ולחשוף שניים עד שלושה סנטימטרים מהעצב הסיאטי הבסיסי. השתמש במחזיר כדי להרחיב את הפער בין שני השרירים. בעזרת מלקחיים עדינים וקשתית המספריים מפרידים בזהירות את העצב מרקמת החיבור שמסביב, תוך הקפדה יתרה לא לדחוס או לחתוך את העצב.
לאחר מכן, כסו את העצב החשוף עם הקיבוע של טראמפ והניחו לשבת במשך 10 דקות. במידת הצורך, הניחו גזה מתחת לרגל האחורית כדי לשפר את הזווית כך שניתן יהיה להוסיף יותר קיבוע לחלל. הסר את הקיבוע לאחר 10 דקות וחזור על שלב זה פעמיים נוספות.
תחת מיקרוסקופ החיתוך חתכו את העצב הסיאטי משני הצדדים באמצעות מספריים לדיסקציה עדינה, והקפידו לא למתוח או לצבוט את העצב. הכניסו מיד את חלקי העצבים לצינורות של 15 מ"ל המכילים את הפיקסטיב של טראמפ וקבעו בארבע מעלות צלזיוס למשך שבוע, והחליפו את הקיבוע כל 48 שעות. לאחר הקיבוע, הסר בזהירות את כל השומן ורקמות החיבור שנותרו מהעצב, והשתמש באזמל חד כדי לחתוך את העצב למקטעים באורך של כחמישה מילימטרים.
ניתן להפריד מקטעי עצב לצינורות מסומנים שונים. טבלו מקטעי עצב בטטרוקסיד 2% אוסמיום טרי שהוכן למשך שעתיים. בעזרת ערכת הטמעת אפוקסי, הכינו את תערובת ההטבעה הסופית.
מערבבים את מדיום הטמעת האפוקסי עם תמיסת DDSA ומערבבים את מדיום הטמעת האפוקסי עם תמיסת NMA. מערבבים את שתי התמיסות למשך 20 דקות לפחות בעזרת מערבל מגנטי. מיד לפני השימוש, שלב את המאיץ DPM לפתרון B ולאחר מכן שלב אותו עם פתרון A כך שהפרופורציה הסופית של המאיץ תהיה בין נקודה אחת חמש ל-2% מהנפח הכולל.
העבירו את מקטעי העצב לנקודה אחת של צינורות של חמישה מיליליטר ולאחר שטיפה עם PBS, התחילו את תהליך ההתייבשות על ידי החלפת ה-PBS בריכוזים הולכים וגדלים של אצטון ומים מזוקקים למשך 10 דקות כל אחד ואז ב-100% אצטון שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחד. שלב קריטי אחד הוא התייבשות הרקמות. מים ושרף לא יתקשרו, כך שכל מים שנותרו ברקמה לא יחדרו על ידי השרף וישאירו חורים בקטע נטולי איכויות היסטולוגיות.
לחדירת שרף, הנח תחילה את מקטעי העצב בתערובת אחד לאחד של תערובת הטבעה ו-100% אצטון למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, העבירו את הקטעים לתערובת של שניים לאחד של תערובת הטמעה ו-100% אצטון למשך 30 דקות. הניחו את הפרדות העצבים בתבניות הטבעה מגומי סיליקון והוסיפו בעדינות את השרף על גבי העצבים, הקפידו לכסות את כל קטע העצבים תוך הימנעות מבועות אוויר.
השאירו את השרף להתפלמר בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הנח גוש שרף עם עצב מוטבע לתוך מחזיק האולטרה-מיקרוטום כשהצד הטרפזי פונה כלפי מעלה. תוך כדי צפייה דרך האולטרה-מיקרוטום, השתמש בלהב חד פיפיות כדי לקצץ עודפי שרף המקיף את רקמת העצב.
אל תחדור למשטח האורך של קטע העצב הניתן לזיהוי על ידי הצביעה הכהה שלו על ידי אוסמיום טטרוקסיד. בעזרת סכין זכוכית רגילה על האולטרה-מיקרוטום צרו חתכים מרובים כדי לחשוף משטח חתך אחיד של העצב. לאחר שזה נעשה, עבור לסכין זכוכית כשהסירה מלאה במים מזוקקים בטמפרטורת החדר והתאם את האולטרה-מיקרוטום למיקרון אחד עד שניים כדי לחתוך חלקים דקים.
השתמש בלולאת מתכת כדי להעביר חלקים דקים צפים מסירת סכין הזכוכית לטיפת מים נטולי יונים על מגלשת זכוכית. שלב קריטי נוסף הוא במהלך העברת קטע דק מסכין הזכוכית לשקופית. חלקים דקים אלה שבירים מאוד ועלולים להישבר או להתקפל.
לאחר החיתוך, יבש את החלקים בשקופיות על ידי העברת מגלשה מעל להבה מספר פעמים, והקפד לא לחמם יתר על המידה את החלקים. ניתן לאחסן שקופיות בטמפרטורת החדר למשך מספר ימים אם לא מכתימים מיד בכחול טולואידין. כדי להכתים את קטעי העצב, השתמשו בפיפטה מפלסטיק או במיקרו-פיפטר כדי להוסיף טיפה של תמיסת טולואידין כחולה בחלק העליון של חלקי העצב.
לאחר 20 עד 30 שניות, שטפו את כל עודפי התמיסה הכחולה של טולואידין על ידי טבילה עדינה של השקופיות בצנצנת מים נטולי יונים, וחזרו על הפעולה שלוש עד ארבע פעמים עד שהחלקים נקיים. יבש את השקופיות לפחות 15 דקות בחום של 60 מעלות צלזיוס או לילה בטמפרטורת החדר. לאחר הייבוש יש להוסיף אמצעי הרכבה רגיל ולכסות את החלקים בכיסוי.
לבסוף, בדוק את החלקים המותקנים תחת מיקרוסקופ אור. עדשת טבילה בשמן 100X מומלצת לתמונות מפורטות לחישוב יחסי g. קטעי עצב סיאטי משובצים במדיום שרף ומוכתמים בכחול טולואידין הראו תמונות ברורות עם רזולוציה אופטימלית בהגדלת ההגדלה מ-10X ל-20X, 40X ו-60X.
שיטה זו שומרת על מבנה העצב ומאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה ובהגדלה גבוהה המאפשרת מדידה של מספר פרמטרים כגון יחס g, שהוא היחס בין קוטר האקסון, המצוין על ידי החץ המסומן B, לקוטר הסיבים הכולל, המסומן A. מגוון גורמים יכולים להוביל לקטעי עצב היקפיים פחות מאופטימליים, כולל נוכחות של סדקים בקטע עקב טיפול לא נכון בעצב. חורים יכולים להתרחש גם בקטע בגלל התייבשות לא מספקת. שגיאה אפשרית נוספת בהליך היא קיפול החלקים, אותו ניתן לתקן באמצעות לולאות חיסון להעברת חתכים למגלשת הזכוכית.
בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כמו כימות אקסונים כדי לענות על שאלות נוספות כמו מהי מידת ההתחדשות בעצב רגנרטיבי? לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד להשיג מקטע עצב היקפי של מיקרון אחד עד שניים כדי להעריך מורפומטריה עצבית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול להדמיה של מבנים עדינים בעצבים פריפריים באמצעות צביעת חתכים בעובי 1-2 µm ב-toluidine blue. מטרתו היא לבחון היבטים קריטיים של פגיעה והתחדשות של עצבים פריפריים, תוך מתן תובנות לגבי מורפומטריה, ספירת אקסונים, מיאלינציה ונוכחות של רקמה פיברוטית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- התחדשות
- היסטולוגיה
רקע
- פגיעות בעצבים פריפריאליים מציבות אתגרים משמעותיים בתהליכי ההחלמה וההתחדשות.
- הבנת המאפיינים המבניים חיונית לטיפול בפגיעות עצבים.
- דימות ברזולוציה גבוהה יכול לחשוף מידע מכריע על האנטומיה של העצב.
- מחקר זה מספק שיטה להדמיה יעילה של מבני עצבים.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול לוויזואליזציה מפורטת של עצבים פריפריאליים.
- הסבת הבחינה של מבנה ותפקוד העצב לאחר פגיעה.
- מתן אפשרות למחקר על מנגנוני התחדשות ותיקון של עצבים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שיטה זו יעשה שימוש בצביעה היסטולוגית ובדימוי מיקרוסקופי.
- המודל הביולוגי כולל את העצב הסיאטיק מחתולים תחת הרדמה.
- שלבי המפתח כוללים דיסקציה של העצב, קיבוע, הטמעה וצביעה ב-toluidine blue.
- תהליכים קריטיים מבטיחים התייבשות של הרקמה וחיתוך נתחים תקין לצורך דימוי.
- הנתחים נבחנים תחת מיקרוסקופ לצורך ניתוח מורפולוגי מפורט.
תוצאות עיקריות
- התקבלו תמונות חדות וברורות של חתכי עצב הסיאטיק (sciatic nerve).
- השיטה מאפשרת מדידה יעילה של פרמטרים כגון g-ratios.
- דימיון ברזולוציה גבוהה חושף פרטים מבניים חיוניים לאחר הצביעה.
- ויזואליזציה מוצלחת תומכת במחקרים שוטפים בנושא התחדשות עצבית.
מסקנות
- המחקר מדגים שיטה מהימנה להערכת מבני עצבים פריפריאליים.
- פרוטוקול זה משפר את ההבנה של תהליכי פגיעה והתחדשות של עצבים.
- הממצאים מדגישים את חשיבותן של טכניקות דימות במחקרים בתחום מדעי העצבים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
מורפומטריה של עצבים פריפריים היא נקודת סוף קריטית במודלים פרה-קליניים של נוירופתיה והתחדשות, שבהם הערכה כמותית של צפיפות האקסונים והמיאלינציה מסייעת בתיקוף המטרה ובצמצום סיכונים מכניסטיים. צביעת טולואידין כחול של חיתוכים הטבולים בשרף מאפשרת דימיון בעלות רזולוציה גבוהה וניתן לשחזור, התומך בהחלטות go/no-go מבוססות נתונים בשלבי הגילוי המוקדמים. גישה היסטוכימית זו מגשרת בין סריקה פנוטיפית לבין פיתוח ביומרקרים תרגומיים, על ידי אספקת מדדים מבניים כמותיים הרלוונטיים לשלמות האקסונים ולתיקונום.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי כימות מספר האקסונים ומצב המיאלין במודלים של פגיעה.
- ערך תפעולי: מספק מדדים מורפומטריים סטנדרטיים להבהרת מסלולים ולהערכת מעורבות מטרות.
- ערך אסטרטגי: תומך בביטחון חיזוי בזיהוי מועמדים מובילים באמצעות הערכה אובייקטיבית של מבנה העצב.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר ספירות כמותיות של אקסונים ומדידות g-ratio לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- ערך תפעולי: מספק הכנה הדירה של חתכים דקים עבור תהליכי עבודה של הדמיה בעלת תוכן גבוה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר סריקה ניתנת להרחבה של תרכובות המשפיעות על התחדשות או ניוון של עצבים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקל על מידול מערכות רלוונטיות למחלה על ידי שימור המורפולוגיה של העצב ברמה האולטרה-מבנית.
- ערך תפעולי: מבטיח המשכיות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות חיתוך וצביעה עקביים.
- ערך אסטרטגי: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון באמצעות ביומרקרים מורפומטריים של רגנרציה.
שילוב של תהליכי עבודה וקווי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מאימות המטרה דרך זיהוי מובילים ועד ליעילות פרה-קלינית, כאשר מורפומטריה של העצב משמשת כמדד תפקודי לאפנון המסלול.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על ידי מתן אפשרות להדמיה של צפיפות אקסונית ושל תקינות המיאלין במודלים של נגעים.
- סריקה: מספק סדרות של חתכים המוכנים לבדיקה עם פלטים כמותיים להערכת השפעת תרכובות.
- אנליטיקה: מספק מדידות של g-ratio וספירת אקסונים המאפשרות ניתוח השוואתי בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרצף פרה-קליני באמצעות סממנים מבניים התואמים למנגנוני תיקון עצבים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה היסטולוגית לשימוש חוזר להערכת עצבים פריפריאליים במגוון מודלים של מחלות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת העמימות בהערכה מבנית של העצב.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים של קיבוע, הטמעה וחיתוך.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים מוקדמת של מטרות נוירולוגיות על בסיס תוצאות מורפומטריות.
- השפעה על פורטפוליו: מספק מידע לתעדוף מותאם סיכון באמצעות כימות אובייקטיבי של שימור אקסוני ומיאלינציה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות היסטולוגיות, כולל קיבוע רקמות וחיתוך באולטרה-מיקרוטום.
- תלוי בציוד כגון ערכות שיקוץ באפוקסי, אולטרה-מיקרוטומים ומיקרוסקופיה של אור עם יכולת טבילה בשמן.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של זמני ההתייבשות והצביעה כדי למנוע ארטיפקטים בחיתוכים.
- כולל שיקולי התאמה כאשר מיישמים על סוגי עצבים מעבר לעצב הסיאטיק, כגון שינויים בקוטר או בעובי המיאלין.
- כולל מגבלות מעשיות כגון שבירות של החיתוכים במהלך ההעברה, אותן ניתן להפחית על ידי טיפול אופטימלי באמצעות לולאות הזרקה.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:04
Title
0:36
Surgery and In Vivo Nerve Fixation
2:32
Osmium Tetroxide Treatment and Resin Embedding
4:38
Sectioning by Ultramicrotome
5:58
Toluidine Blue Staining
6:47
Results: Transverse Section Images of a Rat Sciatic Nerve Stained with Toluidine Blue
7:48
Conclusion
