Name: אינטראקציה תא הדמיה ב רירית והכו אותי במהלך זיהום בנגיף שפעת באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים Intravital (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: חקור דינמיקת תאי חיסון ברירית הנשימה במהלך זיהום שפעת באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים. פרוטוקול זה מאפשר צפייה בזמן אמת באינטראקציות בין תאי דנדריטיים לנייטרופילים בעכברים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הקרן הלאומית השוויצרית (SNF) (176124, 145038 ו 148183), אירופה הנציבות מארי קירי אפשרות המענק (612742), את SystemsX.ch עבור מענק D.U.P. (2013/124).

<ol><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li>
<li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+magic%3A+multiphoton+microscopy+in+the+biosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li>
<li>Fein, M. R., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caught+in+the+act%3A+revealing+the+metastatic+process+by+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Caught in the act: revealing the metastatic process by live imaging.</a> Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 580-593 (2013).</li>
<li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li>
<li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choreography+of+cell+motility+and+interaction+dynamics+imaged+by+two-photon+microscopy+in+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs.</a> Annual review of immunology. 26, 585-626 (2008).</li>
<li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Decade+of+Imaging+Cellular+Motility+and+Interaction+Dynamics+in+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System.</a> Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).</li>
<li>Coombes, J. L., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+host-pathogen+interactions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo.</a> Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).</li>
<li>Pulendran, B., Maddur, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+Immune+Sensing+and+Response+to+Influenza%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Journal%22%5BJournal%5D)">Innate Immune Sensing and Response to Influenza.</a> Life Science Journal. 6 (4), 23-71 (2014).</li>
<li>Lim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+trails+guide+influenza-+specific+CD8+%2B+T+cells+in+the+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophil trails guide influenza- specific CD8 + T cells in the airways.</a> Science. 349 (6252), (2015).</li>
<li>Kim, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+tracheal+epithelial+cells+in+mice+during+airway+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. 47 (6), 864-868 (2012).</li>
<li>Kretschmer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+multiphoton+microscopy+for+visualization+of+tissue+morphology+and+cellular+dynamics+in+murine+and+human+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+investigation%3B+a+journal+of+technical+methods+and+pathology%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence multiphoton microscopy for visualization of tissue morphology and cellular dynamics in murine and human airways.</a> Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 96 (8), 918-931 (2016).</li>
<li>Veres, T. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intubation-free+in+vivo+imaging+of+the+tracheal+mucosa+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy.</a> Scientific Reports. 7 (1), 694(2017).</li>
<li>Looney, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nature. 8 (1), 91-96 (2011).</li>
<li>Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+the+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of the Lung.</a> Current Protocols in Cytometry. 60 (1), (2012).</li>
<li>Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+the+murine+pulmonary+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation.</a> Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).</li>
<li>Fiole, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+intravital+imaging+of+lungs+during+anthrax+infection+reveals+long-lasting+macrophage-dendritic+cell+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts.</a> Infection and immunity. 82 (2), 864-872 (2014).</li>
<li>Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+in+historic+and+contemporary+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy in historic and contemporary immunology.</a> Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).</li>
<li>Lambrecht, B. N., Hammad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+Dendritic+Cells+in+Respiratory+Viral+Infection+and+Asthma%3A+From+Protection+to+Immunopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lung Dendritic Cells in Respiratory Viral Infection and Asthma: From Protection to Immunopathology.</a> Annual Review of Immunology. 30 (1), 243-270 (2012).</li>
<li>Camp, J. V., Jonsson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+neutrophils+in+viral+respiratory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A role for neutrophils in viral respiratory disease.</a> Frontiers in Immunology. 8, (2017).</li>
<li>van Gisbergen, K. P. J. M., Sanchez-Hernandez, M., Geijtenbeek, T. B. H., van Kooyk, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+mediate+immune+modulation+of+dendritic+cells+through+glycosylation-dependent+interactions+between+Mac-1+and+DC-SIGN%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Neutrophils mediate immune modulation of dendritic cells through glycosylation-dependent interactions between Mac-1 and DC-SIGN.</a> The Journal of experimental medicine. 201 (8), 1281-1292 (2005).</li>
<li>Gonzalez, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+of+influenza+by+medullary+dendritic+cells+via+SIGN-R1+is+essential+for+humoral+immunity+in+draining+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Capture of influenza by medullary dendritic cells via SIGN-R1 is essential for humoral immunity in draining lymph nodes.</a> Nature Immunology. 11 (5), 427-434 (2010).</li>
<li>Lindquist, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+dendritic+cell+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Visualizing dendritic cell networks in vivo.</a> Nature immunology. 5 (12), 1243-1250 (2004).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+V%CE%B39V%CE%B42-T+cells+efficiently+kill+influenza+virus-infected+lung+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human Vγ9Vδ2-T cells efficiently kill influenza virus-infected lung alveolar epithelial cells.</a> Cellular and Molecular Immunology. 10 (2), 159-164 (2013).</li>
<li>Tran Cao, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+transgenic+cyan+fluorescent+protein+%28CFP%29-expressing+nude+mouse+for+%26%2334%3Btechnicolor%26%2334%3B+cancer+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Development of the transgenic cyan fluorescent protein (CFP)-expressing nude mouse for &#34;technicolor&#34; cancer imaging.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 107 (2), 328-334 (2009).</li>
<li>Jaber, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose+regimens%2C+variability%2C+and+complications+associated+with+using+repeat-bolus+dosing+to+extend+a+surgical+plane+of+anesthesia+in+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science+JAALAS%22%5BJournal%5D)">Dose regimens, variability, and complications associated with using repeat-bolus dosing to extend a surgical plane of anesthesia in laboratory mice.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 53 (6), 684-691 (2014).</li>
<li>Pizzagalli, D. U., et al. Leukocyte Tracking Database, a collection of immune cell tracks from intravital 2-photon microscopy videos. Scientific Data. , In press (2018).</li>
<li>Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. <a target="_blank" href="https://ieeexplore.ieee.org/document/5872394/">Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit.</a> 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).</li>
<li>Beltman, J. B., Marée, A. F. M., De Boer, R. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19834485">Analysing immune cell migration.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (11), 789-798 (2009).</li>
<li>Keller, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility%2C+cell+shape%2C+and+locomotion+of+neutrophil+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+motility%22%5BJournal%5D)">Motility, cell shape, and locomotion of neutrophil granulocytes.</a> Cell motility. 3 (1), 47-60 (1983).</li>
<li>Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15357943">Intravital Microscopy.</a> Immunity. 21 (3), 315-329 (2004).</li>
<li>Lambert Emo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Influenza+Infection+of+the+Trachea+Reveals+Dynamic+Regulation+of+CD8%2B+T+Cell+Motility+by+Antigen%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Influenza Infection of the Trachea Reveals Dynamic Regulation of CD8+ T Cell Motility by Antigen.</a> PLOS Pathogens. 12 (9), e1005881(2016).</li>
<li>Kjos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+fluorescent+Streptococcus+pneumoniae+for+live-cell+imaging+of+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bacteriology%22%5BJournal%5D)">Bright fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions.</a> Journal of bacteriology. 197 (5), 807-818 (2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

עבודה זו מציגה פרוטוקול מפורט לדור של תמונות 4D מציג את ההעברה של נויטרופילים הועבר adoptively והאינטראקציה שלהם עם DC במהלך זיהום שפעת לקנה העכבר. המודל שתואר 2, P-IVM יהיו רלוונטיים בחקר דינמיקה תא החיסון במהלך זיהום דרכי הנשימה.
לאחרונה, מספר מודלים בהתבסס על הפריט החזותי של דינמיקה תא את דרכי הנשימה היו מפותחות9,10,11,12,13...

מיקרוסקופ שני הפוטונים intravital (P 2-IVM) היא טכניקה יעילה בזמן אמת הדמיה של אינטראקציות לתא כפי שהן מופיעות בתוך הסביבה הטבעית שלהם1. אחד היתרונות העיקריים של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת חקר תהליכים תאיים בעומק הדגימה גדולה יותר (500 מיקרומטר עד 1 מ מ) לעומת מסורתיות אחרות הדמיה טכניקות2. במקביל, השימוש של שני פוטונים אנרגיה נמוכה שנוצר על ידי לייזר שני הפוטונים ממזער את צילום-הנזק לרקמות הקשורות בדרך כלל תהליך רכישת תמונה2. במהלך העשור האחרון, P 2-IVM הוחל ללמוד סוגים שונים של תאים תאים אינטראקציות מספר דיסציפלינות3,4,5. מחקרים אלו היו רלבנטיות במיוחד לחקור תאים חיסוניים, המאופיינים דינמיות גבוהה שלהם ואת היווצרות הקשר בולטת בעקבות את האותות שנוצר על ידי תאים אחרים ועל הסביבה. 2, P-IVM הוחל גם ללמוד את האינטראקציות בין פתוגניות וכן שורה6. ואכן, בעבר הוכח כי כמה פתוגנים ניתן לשנות את סוג ואת משך הקשר בין תאים חיסוניים, פוגעות, כתוצאה מכך, את התגובה החיסונית7.
רירית דרכי הנשימה הוא האתר הראשון שבו היא התגובה החיסונית נגד פתוגנים מוטס שנוצר8. לכן, אין ויוו ניתוח של פתוגן-פונדקאי אינטראקציות בתוך הרקמה הזו הוא קריטי להבין אתחול של מנגנוני ההגנה מארח במהלך זיהום. עם זאת, P 2-IVM של דרכי הנשימה הוא מאתגר בעיקר בשל הממצאים המיוצר על ידי מחזור נשימה של החיה, אשר פוגעת התהליך של ייבוא תמונות. לאחרונה, מודלים כירורגיים שונים תוארו עבור הדמיה מאתר את קנה הנשימה9,10,11,12 ו הריאות13,14,15, 16. P 2 בקנה הנשימה-IVM דגמים מייצגים של הגדרת מצוינת להמחיש את השלב הראשוני של התגובה החיסונית את דרכי הנשימה העליונות, ואילו הריאה-alveoli 2, P-IVM מודלים מתאימים יותר ללמוד לשלב מאוחר של זיהומים. הדגמים ריאות מפותחות להציג מגבלה הקשורים עם הנוכחות של alveoli מלא אוויר, אשר מגבילים את חדירת הלייזר אופטי, להפוך את שכבת הרירית של דרכי הנשימה intrapulmonary נגיש עבור ויוו הדמיה17 . לעומת זאת, המבנה של קנה הנשימה, שהוקמה על ידי האפיתל רציפה, מקלה על ייבוא תמונות.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול הכולל תיאור מפורט של כל השלבים הדרושים לביצוע שפעת זיהום, הכנה כירורגי של בעלי החיים, P 2-IVM של חוליות הצוואר. בנוסף, אנו מתארים את מלכודת ניסיוני ספציפי עבור הפריט החזותי של נויטרופילים, תאים דנדריטים (DC), שני סוגי תאים חיסוניים לשחק תפקיד חשוב בתור מגשרות של מנגנון ההגנה נגד שפעת וירוס18,19 . לבסוף, אנו מתארים הליך ניתוח אינטראקציות נויטרופילים-DC. אנשי קשר אלה הוכחו לווסת DC הפעלה, ובהמשך, להשפיע על תגובות מערכת החיסון נגד פתוגנים20.

<table><tbody><tr><td>Gigasept instru AF</td><td>Sch&uuml; לקה & עכברי Mayr GmbH</td><td></td><td>4% תמיסה</td></tr><tr><td>CD11c-YFP</td> מעבדות <td>ג'קסון</td><td>008829</td><td>עכברים גודלו בבית</td></tr><tr><td>עכברי CK6-ECFP</td> מעבדות <td>ג'קסון</td><td>004218</td><td>עכברים גודלו בבית</td></tr><tr><td>1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline שונה ללא סידן כוריד ומגנזיום כלוריד</td><td>סיגמא</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>10x תמיסת מלח פוספט בופר של Dulbecco שונה ללא סידן כוריד ומגנזיום כלוריד</td><td>סיגמא</td><td>D1408-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Percoll PLUS</td><td>Sigma</td><td>E0414-1L</td><td>חנות ב 4& מעלות; C</td></tr><tr><td>Ketamin Labatec Labatec</td><td>Pharma</td><td>7680632310024</td><td>חנות ב-RT, חנות ב-4 מעלות; C בתמיסה של תערובת ket/xyl</td></tr><tr><td>Rompun 2% (Xylazin)</td><td>Bayer</td><td>6293841.00.00</td><td>חנות ב-RT, חנות ב-4 מעלות; C בתמיסה של תערובת ket/xyl</td></tr><tr><td>26 גרם 1 מ"ל Sub-Q BD פלסטיפק</td><td>BD פלסטיפק</td><td>305501</td><td></td></tr><tr><td>30 גרם, 0.3 מ"ל BD מזרקי אינסולין מיקרו-עדינים</td><td>BD</td><td>324826</td><td></td></tr><tr><td>פלקון 40 ומיקרו; m מסננת תאים</td><td>קורנינג</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>2 מ"ל מזרקים</td><td>BD פלסטיפק</td><td>300185</td><td></td></tr><tr><td>מיקרולנס 3x 18 גרם מחטים</td><td>BD</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>Introcan Safety 20 גרם (קטטר)</td><td>בראון</td><td>4251652.01</td><td></td></tr><tr><td>6 באר אשכול תרבית תאים</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>RPMI בינוני 1640 + HEPES (1x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>42401-018</td><td>חנות ב-4&deg; C</td></tr><tr><td>Liberase TL מחקר דרגת מחקר</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td>חנות ב -20 מעלות; תערובת C / קולגנאז (I ו- II)</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>אמרסקו (VWR)</td> <td>0649-50KU</td><td>חנות ב -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>CellTrace כתם סגול</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C34557</td><td>חנות ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>חנות ב -20 מעלות; C</td></tr><tr><td>PE-10 מיקרו צינורות רפואיים</td><td>2 מכשירים ביולוגיים SNC</td><td>#BB31695-PE/1</td><td></td></tr><tr><td>סרט פלסטיק כירורגי</td><td>M פלסט</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צמיגות</td><td>Bausch & חנות Lomb</td><td></td><td>ב RT</td></tr><tr><td>פלסטלינה</td><td>Ohropax</td><td></td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית סובלנות גבוהה 15 מ"מ עגול</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0733</td><td></td></tr><tr><td>מערכת הרדמה ניידת לבעלי חיים SomnoSuite</td><td>Kent Scientific</td><td>SS-01</td><td></td></tr><tr><td>Nuvo Lite mark 5</td><td>GCE medline</td><td>14111211</td><td></td></tr><tr><td>MiniTag (ספסל הרדמה וחימום גזי)</td> <td>Tem Sega</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SURGICAL BOARD</td><td>אוניברסיטת ברן</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrimScope II מיקרוסקופ דו-פוטוני</td><td>LaVision Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Vision Ti:Sa לייזרים</td><td>קוהרנטיים בע"מ.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25X NA 1.05 מטרת טבילה במים</td><td>אולימפוס</td><td>XLPLN25XWMP2</td><td></td></tr><tr><td>הקובייה & תא הדגירה ובקר הטמפרטורה</td> שירותי <td></td><td></td><td>הדמיית חיים</td></tr><tr><td>Imaris 9.1.0</td><td>תוכנת הדמיה</td><td>Bitplane</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 7</td><td>GraphPad</td><td></td><td>תוכנה סטטיסטית</td></tr></tbody></table>

אינטראקציה תא הדמיה ב רירית והכו אותי במהלך זיהום בנגיף שפעת באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים intravital

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

הניתוח של תאים תאים או תא-פתוגן אינטראקציה ויוו היא כלי חשוב כדי להבין את הדינמיקה של התגובה החיסונית לזיהום. מיקרוסקופ שני הפוטונים intravital (P 2-IVM) מאפשרת התבוננות תא אינטראקציות רקמות עמוק בבעלי החיים, תוך צמצום של photobleaching שנוצרו במהלך ייבוא תמונות. עד כה, תוארו מודלים שונים 2, P-IVM איברים הלימפה והלימפה. עם זאת, הדמיה של איברי הנשימה נשאר אתגר עקב התנועה הקשורים מחזור נשימה של החיה.
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להמחיש ויוו תא החיסון אינטראקציות לקנה של עכברים נגועים בנגיף שפעת באמצעות 2, P-IVM. למטרה זו, פיתחנו פלטפורמה הדמיה מותאם אישית, שכללה צנרור של חוליות הצוואר, ואחריו רכישת תמונות דינמיות של נויטרופילים, תאים דנדריטים (DC) של האפיתל הרירית והחשיפה כירורגי. בנוסף, אנחנו מפורט הצעדים הדרושים לביצוע שפעת תוך-אפי זיהום זרימת cytometric וניתוח של תאים חיסוניים לקנה. לבסוף, ניתחנו נויטרופילים, תנועתיות DC וכן האינטראקציות שלהם במהלך הסרט. פרוטוקול זה מאפשר לדור של תמונות 4D יציב ובהיר הצורך להערכה של תא-תא אינטראקציות לקנה.

בעבודה זו, אנו המתואר פרוטוקול מפורט ללמוד ויוו תנועתיות ואינטראקציות בין נויטרופילים DC במהלך זיהום שפעת בקנה הנשימה מאתר (איור 3 א). למטרה זו, בודדנו CFP+ נויטרופילים (92% טוהר; איור 3B) מ- CK6-ECFP עכברים, ואנו adoptively אותם לתוך עכבר CD11c-YFP נגוע שפעת. לאחר מכן, ביצענו 2, P-IVM של חוליות הצוואר-יום 3 חוקר פרטי בשלב זה הזמן הבחנו גיוס ברורה של נויטרופילים באזור הנגוע, כפי שמוצג על ידי ניתוח תזרים cytome...

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול לבצע שני הפוטונים intravital הדמיה ותא ניתוח אינטראקציות בין רירית והכו אותי מאתר לאחר ההדבקה בנגיף שפעת. פרוטוקול זה יהיה רלוונטי עבור החוקרים ללמוד את הדינמיקה תא החיסון במהלך זיהומים בדרכי הנשימה.

אינטראקציה תא הדמיה ב רירית והכו אותי במהלך זיהום בנגיף שפעת באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים Intravital

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בחקר התגובות החיסוניות לפתוגנים הנישאים באוויר לגבי הדינמיקה של האינטראקציות של תאי החיסון במהלך זיהומים בדרכי הנשימה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לקבל תמונות 4D בהירות ויציבות של אפיתל קנה הנשימה לאורך הניתוח הפשוט. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי האינטראקציות בין הנויטרופילים לתאים הליטיים במהלך זיהום בשפעת, ניתן ליישם אותה גם לחקר תאים חיסוניים שונים או פתוגנים הנישאים באוויר.בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו לשמור על ניתוח דלקתי יציב ומינימלי. יתר על כן, ניתוח תמונה יכול להיות מסובך בגלל נוכחות של מומי לב. לזיהום בשפעת תוך-אף, הניחו עכבר CD11c-YFP מורדם בן שישה עד שמונה שבועות במצב שכיבה, ואשרו טשטוש עמוק על ידי חוסר תגובה לצביטה בבוהן.הנח את הפיפטה קרוב לנחיר השמאלי, הוציא טיפות קטנות לחלל האף בהפרש של כ-20 שניות, עד שהעכבר שאף את כל נפח 15 המיקרוליטר של חיסון PR8. לאחר שתיים עד חמש דקות, העבירו 15 מיקרוליטר של נגיף לנחיר הימני באותו אופן. לאחר שכל החיסון נמסר יש לוודא שהעכבר נושם כרגיל, ולהניח את החיה בכלוב שלה בדקוביטוס לרוחב עם מעקב עד להחלמה מלאה.שלושה ימים לאחר ההדבקה, הסר את עצם הירך ואת השוקה מעכבר המבטא CFP טרנסגני, ונקה בעדינות את העצמות בעזרת מלקחיים. חותכים את אפיפיזה העצם ומשתמשים במזרק של מיליליטר אחד המצויד במחט בגודל 26 כדי לשטוף את מח העצם מכל עצם עם PBS קר סטרילי לתוך צינור של 50 מיליליטר על קרח. לאחר שכל מח העצם נקצר, שאפו את המח דרך קצה המחט מספר פעמים וסננו את תרחיף התאים המנותק דרך מסננת של 40 מיקרומטר.אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה, והשהה מחדש את הגלולה בשני מיליליטר PBS קר. לאחר מכן, שכבו בזהירות שני מיליליטר מכל אחד משלושת שיפועי פרקול בצינור של 15 מיליליטר מהמרוכז ביותר לפחות מרוכז. לאחר מכן הוסף בזהירות שני מיליליטר של תרחיף תאי מח עצם על שכבת השיפוע העליונה להפרדת שיפוע צפיפות צנטריפוגלית.בתום הצנטריפוגה, הסר בזהירות את הרצועה מממשק השיפוע של 64 ו-72% ושטוף את הנויטרופילים ב-PBS קר. לאחר מכן יש להשעות מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר PBS טרי על קרח לספירה, ולהשעות מחדש את התאים ב-5 פעמים 10 עד 6 תאים לכל 100 מיקרוליטר של ריכוז PBS להזרקה תוך ורידית לבעלי החיים המחוסנים CD11c-YFP. 12 שעות לאחר ההעברה לאימוץ, הניחו את בעל החיים המורדם על לוח כירורגי מותאם אישית על משטח מחומם של 37 מעלות צלזיוס, והסירו את השיער מצוואר העכבר על ידי גילוח וקרם אפילציה.הנח את העכבר מעל עמדת העכבר מפלסטיק כשהראש מחוץ למיקום בזווית המאפשרת אינטובציה של קנה הנשימה, ואבטח את הגפיים הקדמיות, הכפות והזנב באמצעות סרט כירורגי. מרחו משחה על העיניים וחטאו את העור החשוף. לאחר מכן, בצע חתך של סנטימטר אחד לאורך הציר המדיאלי של הצוואר בין החזה העליון לקו העובר בנקודה התחתונה של הלסת התחתונה, והזיז לרוחב את כתמי העור ובלוטות הרוק כדי לדמיין את קנה הנשימה.השתמש במלקחיים כדי לנתח בזהירות את קנה הנשימה, להחדיר את העכבר עם קטטר ולהתחיל מיד את האוורור המלאכותי. השתמש בוו כירורגי המחובר למוט על לוח הניתוח כדי לקבע את גובה הצנתר וכיוונו, וחשוף את קנה הנשימה עד הסנטר. הקיפו את קנה הנשימה בג'לי נפט והרטיבו את קנה הנשימה בכמה טיפות PBS חם.לאחר מכן הדביקו כיסוי על מחזיק מתכת, והברג את המחזיק למתרגם XYZ כדי לאפשר להניח את הכיסוי על גבי התכשיר הכירורגי. זה מאוד קריטי לחשוף ולהאריך כראוי את קנה הנשימה, וללחוץ עליו קלות עם הכיסוי, כדי לשמור על הרקמה יציבה מספיק זמן להדמיה. להדמיית זמן-lapse in vivo, הנח את לוח הניתוח בתוך תא הדגירה של 37 מעלות צלזיוס של המיקרוסקופ הדו-פוטוני, והוסף טיפת מים לכיסוי.לאחר ריכוז ההתקנה והתמקדות ברקמת קנה הנשימה, הגדר את תדר הסריקה ל-800 הרץ עם 520 על 520 פיקסלים, שדה ראייה של 440 על 440 מיקרומטר וממוצע קו של אחד. הגדר את לייזרי ספיר הטיטניום לאורך הגל ואחוז ההספק המתאימים בהתאם לפלואורופורי העירור, והגדר את מצב הרכישה התלת-ממדי והזמן-lapse עם עירור בו זמנית. לאחר מכן הגדירו טווח של 50 מיקרומטר לאורך ציר ה-z בגודל צעד של שלושה מיקרומטרים, והקליטו תמונות כל 30 שניות למשך 30 דקות.בעקבות מערך ניסיוני זה, ניתן ללכוד תמונות 4D יציבות באתרן בתוך קנה הנשימה הנגוע לאורך תקופת מעקב של 30 דקות. ניתוח התמונות ה-4D מגלה הבדלים משמעותיים בין תאים דנדריטיים לתנועת נויטרופילים מגויסים עם מהירות גבוהה משמעותית שהודגמה על ידי האחרון. המורפולוגיה המורכבת של התאים הדנדריטיים גורמת לטעויות תכופות במעקב אחר התאים, מה שבתורו מייצר מסלולים עם משך מופחת ושונות מוגברת בהתנהגות הכיוונית הנמדדת.לכן, נוצר מדד חזק למדידת הכיווניות על ידי התחשבות במשך המסלול, וחשף הבדל משמעותי בכיווניות של נויטרופילים בהשוואה לתאים דנדריטיים. בנוסף, חישוב המרחק בין הנויטרופילים לתאים הדנדריטיים מאפשר זיהוי וניתוח המגעים שלהם לאורך זמן, כאשר חלק מהנויטרופילים בניסוי מייצג זה יוצרים מגעים קצרים מרובים עם תאים דנדריטיים וחלקם אינם יוצרים מגע עם תאים דנדריטיים במהלך תקופת ההדמיה. יתרה מכך, חקר המגמה הממוצעת של המרחק בין נויטרופילים לתאים דנדריטיים לאורך זמן מאפשר לחקור את המיקום הכללי של התאים, בעוד שחקירת המגמה בתאים ספציפיים מאפשרת לאפיין את ההתנהגות של כל תא בודד.בהכרת הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו זרימה ציטומטרית של קנה הנשימה כדי להעריך את הכימות והאפיון של גיוס תאים חיסוניים שונים בקנה הנשימה הנגוע. אל תשכח שעבודה עם כל זן של נגיף השפעת, גם אם מותאם לעכבר, עלולה להיות מסוכנת, ולכן כל הליך צריך להתבצע בתנאים של רמת בטיחות ביולוגית שנייה.

imaging-cell-interaction-tracheal-mucosa-during-influenza-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

במקביל זיהום בנגיף שפעת היא אחד הגורמים המעורבים אינדוקציה של המחלה pneumococcal פולשנית במהלך...

באמצעות הדמיה Bioluminescent לחקור סינרגיזם בין Streptococcus pneumoniae ו שפעת וירוס עכברים תינוקות

אנו מראים, כיצד להשתמש 2-פוטון מיקרוסקופית לצורך השגחה של הדינמיקה של גרנולוציטים נויטרופילים בריאות נגוע בזמן שהם phagocytose פתוגנים או לייצר מלכודות תאי נויטרופילים (סלים).

תצפית ישירה של phagocytosis ו-NET היווצרות ידי נויטרופילים בריאות נגועים באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

פיתחנו במעבדה רומן כלים ופרוטוקולים לרכישת הדמיה intravital של התימוס. הטכניקה שלנו אמור לעזור בזיהוי של "נישות" בתוך התימוס שבו התפתחות תא T מתרחשת.

הדמיה Intravital של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

Source: Wang, M., et al, Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates intranasal infection of a mouse with a pathogenic influenza virus to establish a respiratory tract infection. The procedure outlines the administration of the virus into the nasal cavity. The virus enters host cells, replicates, and activates the immune system.

Intranasal Infection of a Mouse with a Pathogenic Influenza Virus

מודלים מערכתיים ומקומיים של זיהום דג זברה לנגיף שפעת אנושי A. באמצעות מודל זיהום מערכתי, ניתן להשתמש בדג הזברה לבדיקת תרופות אנטי-ויראליות. באמצעות מודל זיהום מקומי, ניתן להשתמש בדג הזברה כדי לאפיין את תגובות תאי החיסון של המארח.

באמצעות מודלי דג זברה של נגיף שפעת A האדם למסך תרופות אנטי ולאפיין מארח תגובות תא חיסון

פרוטוקול שהוצג כאן מאפשרת אפיון ריאות ביות של לימפוציטים אנושיים הראשי תחת תנאים דלקתיים ויוו. יכול להיות עם תמונה, לכמת על-ידי קרינה פלואורסצנטית אור גיליונות מיקרוסקופיה של רקמת הריאה כימית שנוקה ריאתי חדירה של תאים חיסוניים האנושי הועבר adoptively במודל של עכברים של דלקת אלרגית.

הדמיה של לימפוציטים אנושיים יונת ריאות ב ניסיוני במודל Vivo של דלקת אלרגית בהתבסס על מיקרוסקופ אור גיליונות מתקדמות

אנו מתארים שיטה כדי להמחיש gfp γδ iels התווית באמצעות הדמיה intravital של המעי הדק מורטין על ידי מיקרוסקופית הפוכה דיסק מיקרוסקופ קונפוקלית. טכניקה זו מאפשרת מעקב של תאים חיים בתוך רירית עד 4 h והוא יכול לשמש כדי לחקור מגוון של אינטראקציות מעיים החיסונית-אפיתל.

אינטרטל הדמיה של לימפוציטים תוך-אפיתל במעי קטן מוריין

ניתן להשתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-ורידית כדי לחקור אינטראקציות לויקוציטים-אנדותל וזלוף נימי בזמן אמת. פרוטוקול זה מתאר שיטות לדמות ולכמת פרמטרים אלה במיקרו-סירקולציה ריאתית באמצעות מערכת הדמיית ריאות המיוצבת בריק.

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-ורידית של מיקרו-סירקולציה ריאתית בפגיעה חריפה ניסיונית של הריאות באמצעות מערכת הדמיה מיוצבת ואקום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדמיה תוך-חיונית של הריאה השמאלית של העכבר המושתל באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים. זה מהווה כלי רב ערך לחקר דינמיקה תאית ואינטראקציות בזמן אמת לאחר השתלת ריאות מורין.

מיקרוסקופ תוך-ויטלי דו-פוטוני של ריאת העכבר המושתל

פרוטוקול זה מספק הוראות למתן תוך-אף של IAV וניתוח במורד הזרם של נזק לריאות עכברים ושינויים שעתוק נלווים לסוגי תאי ריאה.

מידול תיקון דיספלסטי ותפקודי של מכתשית ריאות לאחר זיהום בשפעת

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להדמיה תוך-חיונית של Mycobacterium tuberculosis המאושר על ידי BSL-2 מוחלש. מאמץ בריאה העכברית באמצעות חלון ריאה קבוע. גישה זו מאפשרת ניתוח אורך ברזולוציה תאית אחת של אינטראקציות מוקדמות בין מארח לפתוגן, כולל מיקום חיידקים, דינמיקת כלי דם וספיגת מקרופאגים באותה מיקרוסביבה ריאתית.

הדמיה תוך-חיונית של מיקובקטריום טוברקולוזיס אוקסוטרופי מוחלש בריאות עכברי במהלך זיהום תוך-כלי מוקדם

חקור דינמיקת תאי חיסון ברירית הנשימה במהלך זיהום שפעת באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים. פרוטוקול זה מאפשר צפייה בזמן אמת באינטראקציות בין תאי דנדריטיים לנייטרופילים בעכברים.

אינטראקציה תא הדמיה ב רירית והכו אותי במהלך זיהום בנגיף שפעת באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים Intravital

גלה סרטונים נוספים