אינטראקציה תא הדמיה ב רירית והכו אותי במהלך זיהום בנגיף שפעת באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים Intravital

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בחקר התגובות החיסוניות לפתוגנים הנישאים באוויר לגבי הדינמיקה של האינטראקציות של תאי החיסון במהלך זיהומים בדרכי הנשימה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לקבל תמונות 4D בהירות ויציבות של אפיתל קנה הנשימה לאורך הניתוח הפשוט. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי האינטראקציות בין הנויטרופילים לתאים הליטיים במהלך זיהום בשפעת, ניתן ליישם אותה גם לחקר תאים חיסוניים שונים או פתוגנים הנישאים באוויר.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו לשמור על ניתוח דלקתי יציב ומינימלי. יתר על כן, ניתוח תמונה יכול להיות מסובך בגלל נוכחות של מומי לב. לזיהום בשפעת תוך-אף, הניחו עכבר CD11c-YFP מורדם בן שישה עד שמונה שבועות במצב שכיבה, ואשרו טשטוש עמוק על ידי חוסר תגובה לצביטה בבוהן.

הנח את הפיפטה קרוב לנחיר השמאלי, הוציא טיפות קטנות לחלל האף בהפרש של כ-20 שניות, עד שהעכבר שאף את כל נפח 15 המיקרוליטר של חיסון PR8. לאחר שתיים עד חמש דקות, העבירו 15 מיקרוליטר של נגיף לנחיר הימני באותו אופן. לאחר שכל החיסון נמסר יש לוודא שהעכבר נושם כרגיל, ולהניח את החיה בכלוב שלה בדקוביטוס לרוחב עם מעקב עד להחלמה מלאה.

שלושה ימים לאחר ההדבקה, הסר את עצם הירך ואת השוקה מעכבר המבטא CFP טרנסגני, ונקה בעדינות את העצמות בעזרת מלקחיים. חותכים את אפיפיזה העצם ומשתמשים במזרק של מיליליטר אחד המצויד במחט בגודל 26 כדי לשטוף את מח העצם מכל עצם עם PBS קר סטרילי לתוך צינור של 50 מיליליטר על קרח. לאחר שכל מח העצם נקצר, שאפו את המח דרך קצה המחט מספר פעמים וסננו את תרחיף התאים המנותק דרך מסננת של 40 מיקרומטר.

אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה, והשהה מחדש את הגלולה בשני מיליליטר PBS קר. לאחר מכן, שכבו בזהירות שני מיליליטר מכל אחד משלושת שיפועי פרקול בצינור של 15 מיליליטר מהמרוכז ביותר לפחות מרוכז. לאחר מכן הוסף בזהירות שני מיליליטר של תרחיף תאי מח עצם על שכבת השיפוע העליונה להפרדת שיפוע צפיפות צנטריפוגלית.

בתום הצנטריפוגה, הסר בזהירות את הרצועה מממשק השיפוע של 64 ו-72% ושטוף את הנויטרופילים ב-PBS קר. לאחר מכן יש להשעות מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר PBS טרי על קרח לספירה, ולהשעות מחדש את התאים ב-5 פעמים 10 עד 6 תאים לכל 100 מיקרוליטר של ריכוז PBS להזרקה תוך ורידית לבעלי החיים המחוסנים CD11c-YFP. 12 שעות לאחר ההעברה לאימוץ, הניחו את בעל החיים המורדם על לוח כירורגי מותאם אישית על משטח מחומם של 37 מעלות צלזיוס, והסירו את השיער מצוואר העכבר על ידי גילוח וקרם אפילציה.

הנח את העכבר מעל עמדת העכבר מפלסטיק כשהראש מחוץ למיקום בזווית המאפשרת אינטובציה של קנה הנשימה, ואבטח את הגפיים הקדמיות, הכפות והזנב באמצעות סרט כירורגי. מרחו משחה על העיניים וחטאו את העור החשוף. לאחר מכן, בצע חתך של סנטימטר אחד לאורך הציר המדיאלי של הצוואר בין החזה העליון לקו העובר בנקודה התחתונה של הלסת התחתונה, והזיז לרוחב את כתמי העור ובלוטות הרוק כדי לדמיין את קנה הנשימה.

השתמש במלקחיים כדי לנתח בזהירות את קנה הנשימה, להחדיר את העכבר עם קטטר ולהתחיל מיד את האוורור המלאכותי. השתמש בוו כירורגי המחובר למוט על לוח הניתוח כדי לקבע את גובה הצנתר וכיוונו, וחשוף את קנה הנשימה עד הסנטר. הקיפו את קנה הנשימה בג'לי נפט והרטיבו את קנה הנשימה בכמה טיפות PBS חם.

לאחר מכן הדביקו כיסוי על מחזיק מתכת, והברג את המחזיק למתרגם XYZ כדי לאפשר להניח את הכיסוי על גבי התכשיר הכירורגי. זה מאוד קריטי לחשוף ולהאריך כראוי את קנה הנשימה, וללחוץ עליו קלות עם הכיסוי, כדי לשמור על הרקמה יציבה מספיק זמן להדמיה. להדמיית זמן-lapse in vivo, הנח את לוח הניתוח בתוך תא הדגירה של 37 מעלות צלזיוס של המיקרוסקופ הדו-פוטוני, והוסף טיפת מים לכיסוי.

לאחר ריכוז ההתקנה והתמקדות ברקמת קנה הנשימה, הגדר את תדר הסריקה ל-800 הרץ עם 520 על 520 פיקסלים, שדה ראייה של 440 על 440 מיקרומטר וממוצע קו של אחד. הגדר את לייזרי ספיר הטיטניום לאורך הגל ואחוז ההספק המתאימים בהתאם לפלואורופורי העירור, והגדר את מצב הרכישה התלת-ממדי והזמן-lapse עם עירור בו זמנית. לאחר מכן הגדירו טווח של 50 מיקרומטר לאורך ציר ה-z בגודל צעד של שלושה מיקרומטרים, והקליטו תמונות כל 30 שניות למשך 30 דקות.

בעקבות מערך ניסיוני זה, ניתן ללכוד תמונות 4D יציבות באתרן בתוך קנה הנשימה הנגוע לאורך תקופת מעקב של 30 דקות. ניתוח התמונות ה-4D מגלה הבדלים משמעותיים בין תאים דנדריטיים לתנועת נויטרופילים מגויסים עם מהירות גבוהה משמעותית שהודגמה על ידי האחרון. המורפולוגיה המורכבת של התאים הדנדריטיים גורמת לטעויות תכופות במעקב אחר התאים, מה שבתורו מייצר מסלולים עם משך מופחת ושונות מוגברת בהתנהגות הכיוונית הנמדדת.

לכן, נוצר מדד חזק למדידת הכיווניות על ידי התחשבות במשך המסלול, וחשף הבדל משמעותי בכיווניות של נויטרופילים בהשוואה לתאים דנדריטיים. בנוסף, חישוב המרחק בין הנויטרופילים לתאים הדנדריטיים מאפשר זיהוי וניתוח המגעים שלהם לאורך זמן, כאשר חלק מהנויטרופילים בניסוי מייצג זה יוצרים מגעים קצרים מרובים עם תאים דנדריטיים וחלקם אינם יוצרים מגע עם תאים דנדריטיים במהלך תקופת ההדמיה. יתרה מכך, חקר המגמה הממוצעת של המרחק בין נויטרופילים לתאים דנדריטיים לאורך זמן מאפשר לחקור את המיקום הכללי של התאים, בעוד שחקירת המגמה בתאים ספציפיים מאפשרת לאפיין את ההתנהגות של כל תא בודד.

בהכרת הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו זרימה ציטומטרית של קנה הנשימה כדי להעריך את הכימות והאפיון של גיוס תאים חיסוניים שונים בקנה הנשימה הנגוע. אל תשכח שעבודה עם כל זן של נגיף השפעת, גם אם מותאם לעכבר, עלולה להיות מסוכנת, ולכן כל הליך צריך להתבצע בתנאים של רמת בטיחות ביולוגית שנייה.