Name: Co-immunoprecipitation Assay ללמוד אינטראקציות פונקציונלי בין קולטנים ואנזימים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: חקור אינטראקציות בין קולטנים לאנזימים באמצעות שיטת co-immunoprecipitation עם בדיקת פעילות אנזימטית על החומר. השיטה מאפשרת לבחון במקביל גיוס אנזימים ופעילותם בתאי HEK293-T.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הפרויקט מומן על ידי מענקים NIH 1R01AI125640-01 ושל קרן מחקר ראומטולוגיה.

1. תרביות תאים תאים
<ol><li>זרע תאים 293T HEK 10 ס מ 12 לוחות (5 x 106 תאים לכל צלחת) יום לפני תרביות תאים (איור 1). לבצע ספירת תאים באמצעות hemocytometer. לשימוש בכל צלחת, 10 מ של DMEM בתוספת 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין. דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2.</li>
	<li>ברגע שהתאים 80-90% confluent, transfect 5 צלחות HEK 293T באמצעות ריאגנט ליפיד המבוסס על תרביות תאים עם אחד פלסמידים הבאים: וקטור לבטא SHP2, וקטור PD-1-GFP-ביטוי [גירסה מסוג בר (WT) של PD-1], גירסה מוטציה-עתים (Y223F ) של וקטור PD-1-GFP-לבטא, מוטציה-ITSM גירסה (Y248F) של וקטור PD-1-GFP-לבטא (איור 1). הערה: שתי צלחות להיות transfected עם וקטור WT PD-1-GFP-לבטא. לוח נוסף אחד ישמש פקד תאים שאינם transfected (איור 1).</li>
	<li>לבצע תרביות של תאים לפי הפרוטוקול של היצרן עבור תאים חסיד צלחות 10 ס מ. הערה: בגירסאות מוטציה של PD-1, טירוזין (Y) בכל מוטיב הוחלף על ידי פנילאלנין (נ) זה לא יכול להיות phosphorylated.</li>
	<li>Transfect ערכה זהה שניה של חמישה לוחות, לוח נוסף אחד משמש פקד ללא transfected לשקילת כמות חלבון ביטוי [קלט; ידוע גם lysate התא כולו (WCL)] לפני immunoprecipitation (איור 1).</li>
	<li>דגירה התאים transfected 48 שעות ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 מגשים תרביות רקמה. הערה: כדי להבטיח שאת תקנים בהצלחה אירעה, לבחון את התאים עבור הביטוי GFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.</li>
</ol>2. קידום זרחון בתאים Transfected
<ol><li>בעקבות דגירה, להכין טרי pervanadate על ידי ערבוב 50 µL של נתרן-orthovanadate (במלאי 100 מ מ) עם 50 µL של 30% H2O2. הערה: צריך לשנות התערובת לתוך צבע צהבהב. Pervanadate הוא מעכב פוספטאז תא חדיר המקדם זרחון טירוזין שאריות13. זה assay, הוא משמש כדי לגרום robustly זרחון של זנבות PD-1.</li>
	<li>כדי phosphorylate את גרסאות מתויג PD-1, מסיר את המדיה מתאי PD-1-GFP-transfected ולהוסיף 10 מ"ל של DMEM רגיל (ללא סרום או אנטיביוטיקה) יחד עם 10 µL של pervanadate (שלב 2.1) כל צלחת 10 ס מ (וכתוצאה שמונה צלחות לבטא גרסאות שונות של PD-1) (איור 1). מקם את הצלחות בטמפרטורת החדר בחושך למשך 15 דקות. הערה: SHP2 transfected התאים (שתי צלחות; איור 1) שני לוחות בקרה שאינם transfected שאינם מטופלים עם pervanadate, מאז הצלחות האלה ישמש מקור האנזים SHP2 פעיל.</li>
	<li>לשטוף את התאים עם 5 מ של PBS קר כקרח 1 x. חזור על שלב זה פעמיים.</li>
</ol>3. Immunoprecipitation
הערה: השלבים הבאים יש לבצעו על קרח או ב- 4 מעלות צלזיוס.
<ol><li>תוספת למאגר פירוק (50 מ מ טריס-HCl ב pH 7.2, 250 מ מ NaCl, 0.1% NP-40, 2 מ מ EDTA, 10% גליצרול) עם מעכבי פרוטאז (להמיס 1 טבלית 10 מ"ל של פירוק מאגר) ועם orthovanadate נתרן 1 מ מ. להוסיף 500 µL של המאגר הקר פירוק תאים, להסיר ולאסוף את התאים מן הלוחות מיידי באמצעות המגרד של התא. הערה: חשוב להוסיף את orthovanadate נתרן רק למאגר פירוק שישמש עבור לוחות PD-1-GFP-transfected, מאז הצלחות SHP2 transfected ואת לוחות בקרה שאינם transfected חייב לשמור על פעילות פוספטאז.</li>
	<li>להעביר את lysates לתוך צינורות קר 1.5 mL ולסובב אותם ב 0.005 x g, 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.</li>
	<li>איסוף גרעינים פוסט supernatant (מערכת העצבים ההיקפית) lysates, ספין למטה lysates 10 דקות ב x 10,000 g ב 4 ° C ולהעביר את supernatants לתוך צינורות חדשים. להתעלם בגדר. אחסן את supernatants של הסט השני של שש צלחות (איור 1) על הקרח לניתוח WCL בשלב מאוחר יותר.</li>
	<li>
הכנה של חרוזים אנטי-GFP immunoprecipitation של PD-1-GFP מן lysates PD-1-GFP-transfected הראשונים להגדיר (ארבעה לוחות) (איור 1).
	<ol>
<li>כדי למנוע שיקוע של החרוזים, לנער בעדינות את הבקבוק עם החרוזים לפני הפתיחה. הסר µL 40 של חרוזים אנטי-GFP slurry לפי כל תנאי.</li>
		<li>ספין-x 500 g למשך 3 דקות ב 4 ° C ולהסיר את תגובת שיקוע לשטוף את החרוזים. הערה: חשוב למזער את הקשר בין טיפים פלסטיק פיפטה חרוזים agarose למניעת אובדן. מומלץ לחתוך את הקצה של טיפ µL 200 לפני העברת את החרוזים צינור אחר.</li>
		<li>Resuspend את החרוזים ב- 80 µL פירוק מאגר (לכל דגימה).</li>
	</ol>
</li>
	<li>הוסף את שטף החרוזים ישירות לתא lysate (מערכת העצבים ההיקפית) מתאי PD-1-GFP-לבטא הסט הראשון (ארבעה לוחות) (שלב 3.3). סובב ב x 0.005 גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C immunoprecipitate ה-GFP מתויג חלבונים.</li>
	<li>לשטוף את החרוזים עם 1 מ"ל של פירוק קר מאגר (ללא orthovanadate) 3 פעמים. Centrifuge את הצינור ב x 2,500 g 10 s. הערה: בעת הוספת המאגר פירוק החרוזים, הוסף אותו ישירות על גבי החרוזים מבלי לגעת בהם עם העצות. יש צורך פיפטה למעלה ולמטה במהלך שוטף.</li>
	<li>במידה שווה לחלק את lysate של SHP2 הפעיל מהסט הראשון (לוח אחד; שלב 3.3) ולהוסיף אותו שלושה צינורות של חרוזים PD-1-GFP-המכיל שטף (את WT PD-1-GFP, שתי מוטציות שונות phosphdeficient, Y223F ו- Y248F). להוסיף שליש אחד של אמצעי האחסון של lysate של תאים שאינם transfected הצינור השני של חרוזים WT PD-1-GFP. להתעלם הנותרים של שני שלישים.</li>
	<li>דגירה החרוזים במשך 4 שעות ב 4 ° C עם סיבוב עדין (0.005 x g).</li>
	<li>לשטוף את החרוזים פעמיים עם 1 מ"ל של פירוק קר מאגר (ללא pervanadate או orthovanadate), כפי שדווח בשלב 3.6.</li>
	<li>מוסיפים 80 µL מאגר פירוק (ללא pervanadate או orthovanadate) לכל דגימה שהייתך הנפח הכולל של כל שפופרת 100 µL (20 µL של חרוזים) ו- 80 µL מאגר פירוק. לערבב בעדינות, להעביר 50 µL מהצינור כל שני צינורות mL 1.5 טריים. הערה: לאחר שלב זה, יהיו שני צינורות ממולא בתערובת המכילה חרוזים ומאגר פירוק: שפופרת אחת תשמש עבור בדיקות של SHP2 co-immunoprecipitated על ידי סופג המערבי, ואת השני ישמש עבור פעילות פוספטאז וזמינותו.</li>
</ol>4. פוספטאז פעילות Assay
<ol><li>לשטוף את החרוזים פעם אחת עם מאגר שטיפת פוספטאז (30 מ מ Hepes pH 7.4 ו- 120 מ"מ NaCl). הסר את תגובת שיקוע לחלוטין.</li>
	<li>להוסיף 100 µL assay מאגר (30 מ מ Hepes ב- pH 7.4, 120 מ"מ NaCl, 5 מ מ DTT, 10 מ מ p-nitrophenylphosphate) החרוזים, דגירה ב 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות תחת עצבנות עדין. הערה: זמן הדגירה עלול להשתנות, אלא להמתין עד המאגר לצהוב על dephosphorylation.</li>
	<li>לסיום התגובה, להוסיף 50 µL של 1 M NaOH כאשר המאגר לצהוב.</li>
	<li>ספין למטה ב 2,500 x g עבור 10 s והעברת 50 µL של תגובת שיקוע על שתי בארות (כפילות עם µL 50 לכל טוב) של חצי-אזור בצלחת 96-ובכן. לקרוא את ספיגת-405 ננומטר.</li>
	<li>לבטא את התוצאות כמו צפיפות אופטית היחסי (OD) על פני גירסת פראי-סוג הבקרה PD-1-GFP.</li>
</ol>5. SHP2 תספיג ניתוח
<ol><li>ספין למטה החרוזים ולהסיר את תגובת שיקוע.</li>
	<li>הוסף 20 µL מאגר x Laemmli 2 (ראה טבלת חומרים) חרוזים, לרתיחה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.</li>
	<li>למדוד את ריכוז חלבון הקלט פקדים (סט שני) באמצעות BCA קיט (ראה טבלת חומרים). µL 30 המדגם מדולל ביותר להעביר צינור חדש. לדלל את שאר הפקדים קלט עם פירוק מאגר לריכוז אותו כמו הדגימה מדולל ביותר ולאחר להעביר 30 µL של כל אחד מהם צינור חדש. הערה: לאחר שלב זה, יהיו 4 צינורות עם 30 µL כל אחד, בריכוזים חלבון דומה, המייצג את הקלט שולטת lysates.</li>
	<li>להוסיף נפחים שווים של מאגר x Laemmli 2 ה lysates ל לרתיחה ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דק ספין למטה את החרוזים ולטעון את תגובת שיקוע על 4 – 20% ג'ל המבוסס על טריס מרחביות-דף (ראה טבלת חומרים) המערבי כתם ניתוח. בנוסף, טען 50 µL מ כל דגימה של הסט השני.</li>
	<li>המשך ניתוח תספיג לפי הפרוטוקול שתואר קודם לכן12.</li>
</ol>

<ol><li>Montor, W. R., Salas, A., Melo, F. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+tyrosine+kinases+and+downstream+pathways+as+druggable+targets+for+cancer+treatment%3A+the+current+arsenal+of+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Receptor tyrosine kinases and downstream pathways as druggable targets for cancer treatment: the current arsenal of inhibitors.</a> Molecular Cancer. 17 (1), (2018).</li>
<li>Ngoenkam, J., Schamel, W. W., Pongcharoen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selected+signalling+proteins+recruited+to+the+T-cell+receptor-CD3+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Selected signalling proteins recruited to the T-cell receptor-CD3 complex.</a> Immunology. 153 (1), 42-50 (2018).</li>
<li>Azoulay-Alfaguter, I., Strazza, M., Pedoeem, A., Mor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coreceptor+programmed+death+1+inhibits+T-cell+adhesion+by+regulating+Rap1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">The coreceptor programmed death 1 inhibits T-cell adhesion by regulating Rap1.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 135 (2), 564-567 (2015).</li>
<li>Chemnitz, J. M., Parry, R. V., Nichols, K. E., June, C. H., Riley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHP-1+and+SHP-2+associate+with+immunoreceptor+tyrosine-based+switch+motif+of+programmed+death+1+upon+primary+human+T+cell+stimulation%2C+but+only+receptor+ligation+prevents+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">SHP-1 and SHP-2 associate with immunoreceptor tyrosine-based switch motif of programmed death 1 upon primary human T cell stimulation, but only receptor ligation prevents T cell activation.</a> The Journal of Immunology. 173 (2), 945-954 (2004).</li>
<li>Patsoukis, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+effects+of+PD-1+on+Akt+and+Ras+pathways+regulate+molecular+components+of+the+cell+cycle+and+inhibit+T+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Selective effects of PD-1 on Akt and Ras pathways regulate molecular components of the cell cycle and inhibit T cell proliferation.</a> Science Signaling. 5 (230), 46(2012).</li>
<li>Pentcheva-Hoang, T., Chen, L., Pardoll, D. M., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+death-1+concentration+at+the+immunological+synapse+is+determined+by+ligand+affinity+and+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Programmed death-1 concentration at the immunological synapse is determined by ligand affinity and availability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (45), (2007).</li>
<li>Yokosuka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+1+forms+negative+costimulatory+microclusters+that+directly+inhibit+T+cell+receptor+signaling+by+recruiting+phosphatase+SHP2%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death 1 forms negative costimulatory microclusters that directly inhibit T cell receptor signaling by recruiting phosphatase SHP2.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1201-1217 (2012).</li>
<li>Hui, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+costimulatory+receptor+CD28+is+a+primary+target+for+PD-1-mediated+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition.</a> Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).</li>
<li>Sheppard, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+inhibits+T-cell+receptor+induced+phosphorylation+of+the+ZAP70%2FCD3zeta+signalosome+and+downstream+signaling+to+PKCtheta%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">PD-1 inhibits T-cell receptor induced phosphorylation of the ZAP70/CD3zeta signalosome and downstream signaling to PKCtheta.</a> FEBS Letters. 574 (1-3), 37-41 (2004).</li>
<li>Okazaki, T., Maeda, A., Nishimura, H., Kurosaki, T., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+immunoreceptor+inhibits+B+cell+receptor-mediated+signaling+by+recruiting+src+homology+2-domain-containing+tyrosine+phosphatase+2+to+phosphotyrosine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">PD-1 immunoreceptor inhibits B cell receptor-mediated signaling by recruiting src homology 2-domain-containing tyrosine phosphatase 2 to phosphotyrosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (24), 13866-13871 (2001).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonism+between+binding+site+affinity+and+conformational+dynamics+tunes+alternative+cis-interactions+within+Shp2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Antagonism between binding site affinity and conformational dynamics tunes alternative cis-interactions within Shp2.</a> Nature Communications. 4, 2037(2013).</li>
<li>Peled, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+mass+spectrometry+analysis+of+PD-1+uncovers+SAP+as+a+new+checkpoint+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Affinity purification mass spectrometry analysis of PD-1 uncovers SAP as a new checkpoint inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), E468-E477 (2018).</li>
<li>Jang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+tyrosine+phosphatase+inhibitor%2C+pervanadate%2C+inhibits+angiotensin+II-Induced+beta-arrestin+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+and+Cells%22%5BJournal%5D)">A protein tyrosine phosphatase inhibitor, pervanadate, inhibits angiotensin II-Induced beta-arrestin cleavage.</a> Molecules and Cells. 28 (1), 25-30 (2009).</li>
<li>Pluskey, S., Wandless, T. J., Walsh, C. T., Shoelson, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+stimulation+of+SH-PTP2+phosphatase+activity+by+simultaneous+occupancy+of+both+SH2+domains%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Potent stimulation of SH-PTP2 phosphatase activity by simultaneous occupancy of both SH2 domains.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (7), 2897-2900 (1995).</li>
<li>McAvoy, T., Nairn, A. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20890902">Serine/threonine protein phosphatase assays.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 18, Unit18 18 (2010).</li>
<li>Shlapatska, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD150+association+with+either+the+SH2-containing+inositol+phosphatase+or+the+SH2-containing+protein+tyrosine+phosphatase+is+regulated+by+the+adaptor+protein+SH2D1A%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD150 association with either the SH2-containing inositol phosphatase or the SH2-containing protein tyrosine phosphatase is regulated by the adaptor protein SH2D1A.</a> The Journal of Immunology. 166 (9), 5480-5487 (2001).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

קולטן-אנזים אינטראקציות מכריעים עבור מערכת אזעקה תאיים. אנזימים רבים גייסו לקולטנים באמצעות תחומים SH2 מחייב את tyrosines phosphorylated המעטרים זנבות של קולטני אותו. עם זאת, אנזימים מקופלים לעתים קרובות לתוך הייצורים החיים לא פעיל סגור, ודורש הפעלה לשינוי הסתגלותי11 זה יכול להיות מתווכת על-ידי מחשבים אחרות של הקולטן באותו. וזמינותו המתוארים כאן אמצעים האינטראקציות בין רצפטורים, אנזימים, כמו גם הפעילות הנגרמת על ידי אינטראקציות אלה.
השתמשנו assay ערכי צבע מוחלטים מנצל p...

קולטנים קטליטי קולטן טירוזין kinases חלבונים transmembrane שבו איגוד של ליגנד חוץ-תאית גורמת פעילות אנזימטי הצד תאיים1בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. קולטנים מסוימים בעלי קולטן והן פונקציות אנזימטיות, בעוד אחרים לגייס אנזימים מסוימים כגון kinases ו- phosphatases כדי cytoplasmic הזנבות שלהם. גיוס של אנזים הזנב הקולטן ואת הפעולה קטליטי עוקבות של האנזים הזה הם שני תהליכים נפרדים שמווסתים לא תמיד על-ידי אותו חלבון תחומים2. למרבה הצער, אין כלים ספציפיים כדי להעריך את האינטראקציה ואת פעילות אנזימטי בו זמנית. וזמינותו פונקציונלי co-immunoprecipitation המתוארים כאן היא שיטה שימושית לנתח הגיוס של אנזים ועד הזנב של קולטן מהפעלה שלה. זה וזמינותו מנצל immunoprecipitation של קולטני שתייגת על ידי חרוזים מצופים נוגדן. לאחר מכן, מבוצעות assay אנזימטי פעילות והן תספיג ניתוח על חרוזים. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לחשוף אילו תחומים חלבון הכרחיות עבור אינטראקציות בין קולטנים ואנזימים (מוערך על ידי ניתוח תספיג), אילו תחומים הם חובה הפעלה מלאה של האנזימים (נמדדת בחרוז assay אנזימטי פעילות). היא משמעותית לפתח כלי לימוד הפונקציות נפרדים של אנזימים הקשורים קולטן בשל מעורבותם בפתוגנזה של מחלות אנושיות. יתר על כן, עוד יותר להבין את מנגנוני הפעולה של חלבונים אלו עשוי לסייע בעיצוב של הרומן התערבויות טיפוליות.
מוות מתוכנת-1 (PD-1) הוא קולטן המעכבת על פני השטח של תאי T והוא נדרש עבור הגבלת תגובות תא T מוגזמת. בשנים האחרונות, היו מעורבים נוגדנים anti-PD-1 בטיפול של ממאירות מספר1,2. PD-1 מצדו ומרסן פונקציות תא T רבים, לרבות הפצה, הדבקה הפרשת ציטוקינים מספר3,4,5. PD-1 הוא מקומי כדי הסינפסה חיסוניות, הממשק בין תאי T אנטיגן תאים6, איפה זה colocalizes עם תא T-קולטן (TCR)7. לאחר מכן, טירוזין phosphatase SHP2 [Src הומולוגיה 2 (SH2) תחום המכיל טירוזין phosphatase 2] הוא גויס אל זנב cytoplasmic PD-1, המוביל dephosphorylation של שאריות טירוזין מפתח בתוך TCR את מורכבות, המשויך צינתור איתות מולקולות3,4,5,8,9. זנב cytoplasmic PD-1 מכיל שני מוטיבים טירוזין immunoreceptor המבוסס על טירוזין מעכבות מוטיב (עתים), מבוסס-switch מוטיב (ITSM) של טירוזין immunoreceptor10. שני מוטיבים הם phosphorylated על PD-1 מצדו9,10. מוטגנזה מכוונת מחקרים גילו לתפקיד הראשי עבור ITSM גיוס, בניגוד עתים, שתפקידו PD-1 איתות ומתפקדים לא ברור SHP24.
SHP2 מאמצת או מסוגרת (מקופל), עכבות קונפורמציה או פתוח (מורחב), פעיל קונפורמציה11. לא הובהר כבר התרומה של כל תחום הזנב של PD-1 SHP2 מחייב או הפעלה. כדי לענות על שאלה זו, פיתחנו וזמינותו המאפשרת בדיקה מקבילה של הגיוס של SHP2 אל זנב PD-1 ושלה פעילות12. אנחנו מועסקים co-immunoprecipitation ואת וזמינותו פעילות בחרוז פוספטאז לבחון את האינטראקציה ואת פעילות אנזימטי במקביל. שימוש assay הזה, אנו מראים כי ITSM של PD-1 מספיקה לגייס SHP2 אל זנב PD-1, בעוד עתים של PD-1 יש צורך להרחיב ולהפעיל את האנזים באופן מלא.
ישנם רצפטורים רבים שיש להם מספר תחומים סמוכים באזור הזנבות cytoplasmic שלהם. וזמינותו פונקציונלי co-immunoprecipitation יכול לחשוף את התפקיד של תחומים ספציפיים הנחוצים עבור גיוס חלבון או הפעלת אנזימטיות.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td>פוספט חוצץ</td></tr><tr><td>מלח מיקרוצנטריפוגה</td><td>Eppendorf</td><td>5424-R</td><td>1.5 מ"ל</td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (0.25%) פנול אדום</td><td>Gibco</td><td>25200114</td><td></td></tr><tr><td>מומת בחום FBS</td><td>Denville</td><td>FB5001-H</td><td>סרום בקר עוברי</td></tr><tr><td>פניצילין / סטרפטומיצין</td><td>פישר</td><td>BP295950</td><td></td></tr><tr><td>DMEM גלוקוז גבוה ללא L-גלוטמין</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>SuperFect Transfection Reagent</td><td>Qiagen</td><td>301305</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SHP2</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-280</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; GFP-agarose</td><td>MBL</td><td>D153-8</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-GFP</td><td>Roche</td><td>118144600</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-אקטין</td><td>סנטה קרוז</td><td>SC-1616</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293 תאים</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>אורתוואנדאט</td><td>סיגמא</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>H<תת>2O2</td><td>Sigma</td><td>216763</td><td>30%</td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז</td><td>רוש</td><td>11836170001</td> ללא <td>EDTA</td></tr><tr><td>Tris-Glycine SDS מאגר דגימה (2x)</td> <td>Invitrogen</td><td>LC2676</td><td>מאגר Laemmli שונה</td></tr><tr><td>4-20% Tris-Glycine מיני ג'ל</td><td>Invitrogen</td><td>XP04205BOX</td><td></td></tr><tr><td>ממברנות ניטרוצלולוזה 15 בארות</td><td>ג'נרל אלקטריק</td><td>10600004</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>נתרן כלוריד</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>N-2-הידרוקסיאתיל פיפרזין-N-2-אתאן חומצה סולפונית</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>D1532</td><td>Dithiothreitol</td></tr><tr><td>pNPP</td><td>Sigma</td><td>20-106</td><td>p-Nitrophenyl Phosphate</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td>נתרן הידרוקסיד</td></tr><tr><td>BCA</td><td>Fisher</td><td>23225</td><td>Bi Cinchoninic Acid</td></tr></tbody></table>

co-immunoprecipitation assay ללמוד אינטראקציות פונקציונלי בין קולטנים ואנזימים

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

אנזימים הקשורים קולטן הם המתווכים העיקריים של הפעלה סלולרית. אנזימים אלה מוסדרים, לפחות בחלקו, על ידי אינטראקציות גופניות עם זנבות cytoplasmic של קולטני. האינטראקציות לעיתים קרובות להתרחש דרך חלבון ספציפי תחומים, לגרום ההפעלה של האנזימים. ישנן מספר שיטות ללמוד אינטראקציות בין חלבונים. בעוד co-immunoprecipitation משמש בדרך כלל כדי ללמוד תחומים הנדרשים עבור אינטראקציות חלבון-חלבון, ישנם מבחני אין מסמך זה התרומה של תחומים ספציפיים לפעילות של אנזימים מגויסים באותו זמן. בהתאם לכך, השיטה המתוארת כאן משלב co-immunoprecipitation וזמינותו פעילות אנזימטי על חרוזי להערכה סימולטני של אינטראקציות בין חלבונים והפעלה אנזימטי המשויך. המטרה של פרוטוקול זה היא לזהות את התחומים הם קריטיים עבור אינטראקציות גופניות בין חלבון לבין האנזים על התחומים שאינם חובה להפעלה מלאה של האנזים. הוכח את החשיבות של זה וזמינותו, בתור קולטן מסוים חלבון תחומים לתרום הכריכה של האנזים ועד הזנב cytoplasmic של הקולטן, בעוד תחומים אחרים נדרשים להסדיר את הפונקציה של אותו אנזים.

בעוד התרומה של ITSM PD-1 עד SHP2 האיגוד נוצר, התפקיד של עתים PD-1 הוא פחות ברור. מכיוון SHP2 יש שני תחומים SH2 שאינם יכולים לאגד שני phosphotyrosines רציפים ב- PD-1 (אחד טירוזין ב ITSM) ובחודש עתים, שיערנו כי ITSM של PD-1 עוגנים SHP2 ל- PD-1, בעוד עתים של PD-1 מקלה על פעילות SHP2 על-ידי ייצוב שלה פתח את המדינה הסתגלותי11,14. כדי לבדוק את זה, פיתחנו co-immunoprecipitation בשילוב עם assay אנזימטי פעילות להערכה מקבילים של קולטן-אנזים...

כאן, אנו מציגים עבור co-immunoprecipitation ואת וזמינותו של פעילות אנזימטי על חרוזי ללמוד בו זמנית את התרומה של חלבון ספציפי דומיינים של קולטני ממברנה פלזמה אנזים הגיוס והן פעילות אנזים פרוטוקול.

Co-immunoprecipitation Assay ללמוד אינטראקציות פונקציונלי בין קולטנים ואנזימים

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום איתות התאים כגון החשיבות של תחומי חלבון שונים באינטראקציה של אנזים קולטן והפעלה אנזימטית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת בדיקה במקביל של אינטראקציות אנזים קולטן ואת ההשלכות התפקודיות של אינטראקציה זו על פעילות האנזים. עבור כל צלחת, השתמש ב- 10 מיליליטר של DMEM בתוספת 10%FBS ו- 1%פניצילין וסטרפטומיצין.יום לפני ההטמקה, זרע כליה עוברית אנושית 293-T תאים לתוך 12 10 ס"מ צלחות באמצעות hemocytometer לספור את התאים. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% C02. לאחר התאים הם 80 עד 90%confluent, להשתמש סוכן transfection מבוסס השומנים כדי לשנות חמש מהצלחות.בצע את ההטרדה בהתאם להוראות היצרן לתאי הדבקה בצלחות של 10 ס"מ. לאחר מכן תטמיעו סט שני זהה של חמש צלחות יחד עם צלחת נוספת אחת המשמשת כבקרה לא תדרוך למדידת כמות החלבון המובעת לפני האימונופרציפציה. אין לארוב את הלוחות המרובים באינקובטור של תרבות רקמות ב-37 מעלות צלזיוס ב-5%CO2 למשך 48 שעות.השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לבחון את התאים לביטוי GFP ולהבטיח שההעתקה התרחשה בהצלחה. יש לערבב 15 מיקרוליטרים של נתרן אורטובנדט 100 מילימולרית עם 50 מיקרוליטרים של 30% מי חמצן להכנת תערובת פרוונדאט טרייה. כדי לפזר את הגרסאות המתויגות של PD-1, הסר את המדיה מהתאים המפוסלת PD-1-GFP.הוסף 10 מיליליטר של DMEM רגיל 10 microliters של pervanadate לכל צלחת. דגירה בחושך בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות. לאחר מכן, לשטוף את התאים שלוש פעמים PBS קר כקרח באמצעות חמישה מיליליטר של PBS לכל לשטוף.בעת ביצוע immunoprecipitation, כל השלבים צריכים להתבצע על קרח או בארבע מעלות צלזיוס. להשלים את חיץ תמיסת עם מעכבי פרוטאז על ידי המסת טבליה אחת של המעכבים ב 10 מיליליטר של חיץ. כמו כן להוסיף מילימולר אחד של נתרן אורתוובנה למאגר שישמש על PD-1-GFP-transffected צלחות.הוסף 500 מיקרוליטרים של מאגר תזה קר כקרח לתאים, הקפד להוסיף את מאגר התזה המכיל את אורתובנדט נתרן רק את הצלחות המכילות תאים מנוצי PD-1-GFP. השתמש מגרד תא כדי להסיר באופן מיידי ולאסוף את התאים מן הלוחות. מעבירים את הליטים לצינורות קרים באורך 1.5 מיליליטר ומסובבים אותם בכבידה של פי 0.005 וב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.כדי לאסוף את העל-טבעי שלאחר הגרעינים מהליזטים, סובב אותם כלפי מטה בכבידה של פי 10,000 וארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מעבירים את העל-טבעיים לצינורות חדשים וזורקים את גלולת הכדור. אחסן את העל-טבעיים עבור הסט השני של שש צלחות על קרח לניתוח WCL מאוחר יותר.כדי להתחיל להכין חבילות נגד GFP, לנער בעדינות את הבקבוק המכיל את חרוזים לפני הפתיחה כדי למנוע התיישבות. הסר 40 microliters של גם נגד GFP חרוזים מן תרחיף לכל תנאי. צנטריפוגה בכבידה של פי 500 וארבע מעלות צלזיוס לשלוש דקות.הסר את supernatant לשטוף את חרוזים, הקפד למזער את המגע בין פיפטה וחרוזים כדי למנוע אובדן. תן שימוש חוזר ב-80 מיקרוליטרים של מאגר תיזה לדגימה. מוסיפים את חרוזים שטופים ישירות לתא lysate מן PD-1-GFP-ביטוי תאים של הסט הראשון של ארבע צלחות.סובבו במהירות של פי 0.005 למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להפוך את החלבונים המתויגים ב-GFP לחיסון. לשטוף את חרוזים שלוש פעמים באמצעות מיליליטר אחד של חיץ תזה קרה שאינו מכיל orthovanadate עבור כל לשטוף. ואז צנטריפוגה ב 2, 500 פעמים כבידה במשך 10 שניות.מחלקים את ה-lysate של SHP2 הפעיל מהסט הראשון של הלוחות לשלוש מנות שוות ומוסיפים חלק לכל אחד משלושת הצינורות המכילים את חרוזי PD-1-GFP השטופים. הוסף 1/3 מנפח ה-lysate מהתאים שאינם נטראנספקטיים לצינור השני של גם פרעוזי PD-1-GFP מסוג פראי. השלך את 2/3 הנותרים.הדגירה את חרוזים במשך ארבע שעות בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב עדין ב 0.005 פעמים כוח הכבידה. לאחר מכן, לשטוף את חרוזים פעמיים באמצעות מיליליטר אחד של חיץ תזה קרה עבור כל לשטוף. הוסף 80 microliters של מאגר תזה לכל מדגם, להבטיח כי נפח הכולל בכל צינור הוא 100 microliters.בעזרת קצה פיפטה חתוך, פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי לערבב. ואז להעביר 50 microliters מכל צינור לשני, טרי, 1.5 צינורות מיליליטר. לשטוף את חרוזים פעם אחת עם חיץ לשטוף פוספטזה.ואז להסיר את העל טבעי לחלוטין. מוסיפים 100 מיקרוליטרים של חיץ בדיקה אל חרוזים ודגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות תחת תסיסה עדינה. כאשר החיץ הופך צהוב, לסיים את התגובה על ידי הוספת 50 microliters של פתרון טוחן אחד של נתרן הידרוקסיד.צנטריפוגה ב 2, 500 פעמים כבידה במשך 10 שניות. לאחר מכן, מעבירים את העל-טבעי לשתי בארות של חצי אזור בצלחת של 96 בארות. קרא את הספיגים ב 405 ננומטר ולהביע את התוצאות כמו צפיפות אופטית יחסית על גרסת סוג הבר שליטה של PD-1-GFP.ראשית לסובב את חרוזים ב 2, 000 פעמים כבידה וארבע מעלות צלזיוס במשך 30 שניות ולהסיר את העל טבעי. מוסיפים 20 מיקרוליטרים של חיץ לאמלי פעמיים ומרתיחים ב-95 מעלות במשך חמש דקות. באמצעות ערכת BCA, למדוד את ריכוז החלבון של פקדי הקלט.העבר 30 מיקרוליטרים של המדגם המדולל ביותר לצינור חדש. השתמש במאגר תזה כדי לדלל את שאר פקדי הקלט לאותו ריכוז כמו המדגם המדולל ביותר. לאחר מכן העבר 30 מיקרוליטרים של כל אחד מפקדי הקלט המדוללים לצינור חדש.מוסיפים כמויות שוות של מאגר לאמלי פעמיים לlysates ומרתיחים אותם 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן, לסובב את חרוזים ב 2, 000 פעמים כבידה וארבע מעלות צלזיוס במשך 30 שניות לפני ביצוע ניתוח כתם מערבי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. במחקר זה, משולבת שיתוף immunoprecipitation והערכה פעילות אנזימטית מפותחת להערכה מקבילה של אינטראקציות אנזים קולטן והפעלה.שלא במפתיע, SHP2 לא הצליחה להיקשר ל-PD-1 כאשר ITSM עבר מוטציה. למרבה הפלא, הגרסה המוטנטית של איגוד SHP2 מעוכב ITIM רק במידה מוגבלת. עם זאת, בדיקת הפעילות SHP2-phosphatase מגלה כי ITIM ו- ITSM חיוניים באותה מידה לפעילות האנזימטית.פעולה זו חושפת מודל הפעלה דו-שלבי שבו SHP2 מקופל לקונפורמציה אוטומטית בתנאי מנוחה. עם הפעלת PD-1, SHP2 מגויס ל- ITSM הזרחני. עם זאת, ITIM חייב גם להיות זרחן לפרוש SHP2 לתוך הקונפורמציה הפעילה שלה.לאחר התפתחותה, טכניקה זו יכולה לסלול את הדרך לחוקרים בתחום איתות התאים לחקור את הפונקציה של תחומי חלבון באינטראקציות קולטן-אנזים.

co-immunoprecipitation-assay-for-studying-functional-interactions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים קומפלקסים של חלבונים בעלי זירוז חיסוני משותף על קרום PVDF לצורך ניתוח אינטראקציה בין חלבון לחלבון. החלבונים המופחתים מקומפלקסים טופלו בטריפסין כדי לבקע את החלבונים הבודדים בפפטידים הקטנים יותר, ולאחר מכן, שאר הפפטידים הופקו מקרום PVDF. הפפטיד הנמשך שמקורו בשני החלבונים בקומפלקס יובש והושעה מחדש בריכוז נמוך של חומצה פורמית לניתוח נוסף.

עיכול חלבונים על הממברנה להכנת חלבונים בעלי קו-אימונוזיקציה למחקרי אינטראקציה

בסרטון זה, אנו מדגימים טכניקה לביצוע משקעים חיסוניים משותפים של חלבוני PD-1 מסוג פרא המתויגים כ-GFP ומוטציה PD-1 באמצעות חרוזים המצופים בנוגדנים נגד GFP. חלבוני PD-1-GFP הקשורים לחרוזים מודגרים עם חלבוני SHP2 המקיימים אינטראקציה עם PD-1, ומאפשרים זיהוי מוטיבים מבניים ספציפיים ב-PD-1 הממלאים תפקיד קריטי באינטראקציה עם SHP2.

בדיקת משקעים חיסוניים לחקר אינטראקציות קולטני אנזימים בתאים נגועים

אוליגומריזציה של קולטן הריאנודין, תעלת יונים הומו-טטרמרי המתווכת שחרור Ca2+ ממאגרים תוך-תאיים, היא קריטית להתכווצות שרירי השלד והלב. כאן, אנו מציגים שיטות משלימות in vivo ו-in vitro לאיתור אסוציאציה עצמית של חלבון וקביעת סטוכיומטריה של הומו-אוליגומר.

גישות גנטיות ביוכימיים עבור<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; הערכת oligomerization חלבון: מקרה המבחן קולטן Ryanodine

הקמנו שיטה לטיהור של חלבונים אינטראקציה coregulatory באמצעות מערכת LC-MS / MS.

חלבון הכנת שיטה לזיהוי התפוקה הגבוהה של חלבוני אינטראקציה עם גורם-שותף גרעיני באמצעות LC-MS / MS ניתוח

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור טכניקת העיכול על הקרום להכנת דגימות עבור ספקטרומטר מסה. טכניקה זו מקלה על ניתוח נוח של אינטראקציות חלבון-חלבון.

הערכה של אינטראקציות חלבונים-חלבונים באמצעות טכניקת העיכול האנטי-ממברנה

כמותית מולטיפלקס Immunoprecipitation (QMI) משתמשת cy, לנסות לגילוי רגיש של הבדלים בשפע של אינטראקציות חלבונים בחלבון ממוקדות בין שתי דגימות. QMI ניתן לבצע באמצעות כמות קטנה של ביומטריה, אינו דורש תגים מהונדסים גנטית, והוא יכול להיות מותאם עבור כל רשת בעבר הגדרת חלבון אינטראקציה.

קוונפיקציה של אינטראקציה חלבון ברשת דינמיקה באמצעות ריבוב ושות-Immunoprecipitation

מתוארים היא זרימת עבודה פרוטאומניקה לזיהוי שותפים אינטראקציה חלבונים מתוך שבר גרעיני subcellular באמצעות העשרת זיקה חיסונית של חלבון נתון של ריבית ותוויות המסה חינם התווית. זרימת העבודה כוללת שבירה תת-תאית, immunoprecipitation, סינון הכנה לדוגמה, ניקוי לא מקוון, ספקטרומטר מסה וצינור ביואינפורמטיקה במורד הזרם.

Immunoprecipitation ללא תווית של זרימת עבודה בהיקפים גדולים של החברה ליצירת פרופיל רב-ממדי של Interactome גרעינית

אינטראקציות חלבון-חלבון חשובות להבהרת תפקודם של חלבוני המטרה, וקו-אימונומשקעים (co-IP) יכולים לאשר בקלות PPIs. הדבקנו באופן זמני פלסמיד המקודד חלבון מתויג אפיטופ לתאי HEK-293 ופיתחנו שיטת משקעים חיסוניים כדי לאשר בקלות את הקישור של שני חלבוני מטרה.

משקעים חיסוניים עם ג'ל זיקה נגד תג אפיטופ לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

פרוטוקול זה מספק הוראות לבחירת המשובטים תאים קו פליטת אור סידן assay כדי לנתח את מבנה פעילות יחסי נוירופפטידים arthropod מסונתז על GPCRs מאותו מקור שלהם. Assay זה יכול לשמש עבור deorphanization קולטן מבנה פעילות מחקרים היחסים לעיצוב אנלוגי פפטיד סינתטי / סמים להוביל לגילוי.

פליטת אור סידן Assay עבור ניתוח פונקציונלי של יתוש ( Aedes aegypti) ו טיק ( Rhipicephalus microplus) G-חלבון בשילוב רצפטורים

שיטת אבולוציה מכוונת רומן ספציפית לתחום הנדסת thermostability פותחה וכתוצאה מכך תוקפת לאנזימי bacteriolytic. לאחר סיבוב אחד בלבד של mutagenesis האקראי, אנזים bacteriolytic התפתח, PlyC 29C3, מוצג יותר מכפולה מפעילות שיורית בהשוואה לחלבון פרא מהסוג לאחר דגירת טמפרטורה גבוהה.

שיטת הקרנה חדשה לאבולוציה המכוונת של אנזימי Bacteriolytic Thermostable

חקור אינטראקציות בין קולטנים לאנזימים באמצעות שיטת co-immunoprecipitation עם בדיקת פעילות אנזימטית על החומר. השיטה מאפשרת לבחון במקביל גיוס אנזימים ופעילותם בתאי HEK293-T.

Co-immunoprecipitation Assay ללמוד אינטראקציות פונקציונלי בין קולטנים ואנזימים

גלה סרטונים נוספים