כימות מבוססי Cytometry זרימה ססגוניות של המיטוכונדריה, Lysosomes בתאי T
9 בינואר 2019
מאמר זה מדגים שיטה חזקה לכמת המיטוכונדריה או lysosomes בתאים חיים. השילוב של צבעי ספציפיים ליזוזום או המיטוכונדריה עם נוגדנים fluorescently מצומדת סמני פני השטח מאפשר כימות של אלה organelles אוכלוסיות מעורבות לתאים, כמו ראשי תאים שנקטפו דגימות רקמה, באמצעות cytometry זרימה ססגוניות.
שיטה זו יכולה לעזור לנו לענות על שאלות מפתח בתחום חילוף החומרים החיסנותי. היתרון של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת כימות של מיטוכונדריה או ליזוזומים בתאים חיים בודדים, בתערובת מורכבת של סוגי תאים שונים. שיטה זו לחקר תאי T ו- B יכולה להיות מיושמת גם על סוגי תאים רבים אחרים כגון מקרופאגים, תאים דנדריטיים או תאים ראשיים שנקטפו מדגימת רקמה.
ההליך יוכח על ידי צ'ין-וון וואי, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי לתייג את האורגנות לכמת, ראשית, הוסף פעם אחת עשר לתאי T של העכבר השישי לצינור פקס תחתון עגול אחד לכל סמן. ולכדור את התאים על ידי צנטריפוגה.
מחומם מראש למדיום תרבות נטול סרום 37 מעלות כדי לדלל את פתרונות מלאי הבדיקה הספציפיים של organelle לריכוזי עבודה סופיים במדיום. ולהשעות מחדש את התאים ב100 microliters של צבע בדיקה לכל צינור. לאחר מכן, הדגירה את התאים באינקובטור תרבות התא לתקופת הכתמים המתאימה, לעצור את התגובה בסוף הדגירה עם מיליליטר אחד של חיץ פקס קר קרח לכל צינור.
לאחר מכן, לאסוף את התאים עם צנטריפוגה אחרת ולהשעות מחדש את כדורי ב 100 microliters של pre-titrated 24G2 היברידית על הקרח. לאחר עשר דקות, הוסף מיליליטר אחד של מאגר פקס לצינור. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ולתייג את התאים עם 50 microliters של הפלואורסצנטיות מראש ציצים קוקטייל נוגדנים עניין.
מוסיפים את הריכוז המתאים על פי הטבלה. ומאגר פקס במשך 20 דקות על קרח, מוגן מפני אור. בסוף הדגירה, להוסיף מיליליטר אחד של מאגר פקס לכל צינור.
לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. ולהשעות מחדש את התאים ב300 microliters של מאגר פקס בתוספת מיקרוגרם אחד למיליליטר של פרופידיום יודיד. מיד לאחר הוספת הנגד הגרעיני והכרומוזום, הפעל את מחשב ניתוח ציטומטר הזרימה, ציטומטר זרימה, תוכנה לרכישת פקסים וכל התקני עזר אחרים בהתאם לפלטפורמת המכונה.
הפעל PBS דרך המערכת במשך כדקה אחת כדי להבטיח שקו הזרימה יתמלא במאגר PBS ונדן. פתח ניסוי חדש והגדר את הפרמטרים של הציטרומטר בהתאם להוראות היצרן. סנן את התאים באמצעות מסננת תאים של 70 מיקרומטר.
ומערבולת לפני הרכישה של כל מדגם כדי למנוע גושים היווצרות כפולה. פתח את ההגדרה פיצוי אוטומטי וצור התוויות נקודה עבור כל פרמטר פלואורסצנטי. לאחר שכל המתחים נקבעו, התאימו את הפיצוי והחלו את הפיצוי על הדגימות.
צור תרשים פיזור קדמי לעומת פיזור צד ומטב את המתחים כך ותאי העניין יופיעו בתוך ההתוויה. צור פיזור קדימה לעומת תרשים גובה פיזור קדימה ושער התאים הבודדים. צור אזור פיזור קדימה לעומת חלקת אזור פיזור בצד ושער הלימפוציטים.
צור אזור פיזור קדימה לעומת חלקת יודיד פרופיד ושער התאים החיים. לאחר שכל המתחים נקבעו, התאימו את הפיצוי והחלו את הפיצוי על הדגימות. לאחר מכן לטעון את הצינור מדגם הראשון, ליצור את החלקות סמן פני התא המתאים, ולאסוף לפחות 1,000 אירועים של האוכלוסייה של עניין.
לאחר הפעלת כל הדגימות, יצא את נתוני הזרימה לניתוח הבא. ולשמור את הניסוי כתבנית כדי לשמר את הגדרות הציטרומטר ופרמטרים לניסויים דומים בעתיד. תכולת המיטוכונדריה של האתר הסופי היא הנמוכה ביותר בתאי T שליליים כפולים, שיא בשלב שלילי כפול 2 ו-3, וירידה קלה בשלב שלילי כפול 4.
עם thymocytes חיובי כפול המדגים מספרים גבוהים יותר של מיטוכונדריה מאשר CD4 ו CD8 תירוציטים חיוביים יחיד, מה שמרמז כי התוכן המיטוכונדריאלי להשתנות במהלך הפיתוח. CD4 ו- CD8 thymocytes חיובי יחיד להפגין עוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת מיטוכונדריאלית גבוהה יותר מאשר תאים CD4 או CD8 T טחול, מה שמרמז כי תאי T נאיביים כי recirculate בסביבת הדם עשיר בחמצן יש מסה מיטוכונדרית נמוכה עוד יותר מאשר thymocytes. מעניין, הפחתה זו של תוכן המיטוכונדריאלי בולטת יותר ב- CD8 מאשר שושלת התאים CD4 T, והפעלת תא T מקטינה עוד יותר את נוכחותם של איברים אלה.
תוכן ליזוזומלי נמוך יחסית, אך ניתן לגילוי, נצפה בכל אוכלוסיות התימוסיטים, עם נוכחות בולטת יותר בתימין אחד שלילי כפול. בפריפריה, מספר גבוה יחסית של ליזוזומים מזוהים בתאי T חיוביים של זיכרון ומחולל CD8. שילוב צבעים ספציפיים organelle וסמן פני השטח עם ציטומטריה זרימה היא דרך רבת עוצמה לאפיין את המצב המטבולי של תאים בתערובת מורכבת.
ניתן להשתמש בצבע ספציפי נוסף של Organelle כדי לזהות רטיקולום אנדופלסמי, vacuole אוטופגי, או תא עניין תאי אחר.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה
מאמר זה ממחיש שיטה רבת עוצמה לכימות של מיטוכונדריה או ליזוזומים בתאים חיים. הטכניקה מאפשרת את הכימות של אברונים אלו בתאים חיים בודדים בתוך תערובות מורכבות של סוגי תאים שונים.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- אימונולוגיה
- מטבוליזם
רקע
- כימות של אברונים הוא קריטי להבנת הפונקציות התאיות.
- שיטה זו יכולה להיות מיושמת על סוגי תאים שונים, כולל תאי T ותאי B.
- היא משתמשת בצבעים ספציפיים לליזוזומים או למיטוכונדריה בשילוב עם נוגדנים מצומדים לפלואורסציה.
- ציטומטריה של זרימה משמשת לניתוח.
מטרת המחקר
- לספק שיטה לכימות אברונים באוכלוסיות תאים מעורבות.
- לשפר את ההבנה של אימונו-מטבוליזם.
- להדגים את היישום של הטכניקה הזו בתאים ראשוניים מדגימות רקמות.
שיטות ששימשו
- הכנה של תאי T של עכבר בצינור פקס עם תחתית עגולה.
- צנטריפוגציה לכידוד התאים.
- סימון אברונים עם צבעים ספציפיים.
- ניתוח באמצעות ציטומטריה של זרימה רב-צבעונית.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת כימות מדויק של מיטוכונדריה וליזוזומים.
- היא יעילה בהבחנה בין סוגי תאים שונים.
- הוכחה יישומיותה לתאים ראשוניים שונים.
- מקלה על מחקר באימונו-מטבוליזם.
מסקנות
- טכניקה זו היא כלי חשוב לחקר האברונים התאיים.
- היא מספקת תובנות לגבי המצב המטבולי של התאים.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב לתחומים אחרים של ביולוגיה של התא.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Quantifying mitochondrial and lysosomal dynamics in T cells provides critical insights into immuno-metabolic reprogramming during immune responses. This method enables high-resolution, single-cell analysis of organelle content within heterogeneous populations, supporting target validation and mechanistic de-risking in immunotherapy development. By linking organelle metrics to functional states, it enhances predictive confidence in lead identification and preclinical model selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking mitochondrial and lysosomal flux to T cell differentiation and activation states.
- Operational Value: Enables functional target validation through quantitative organelle readouts that reflect metabolic fitness.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying metabolic vulnerabilities in pathogenic T cell subsets.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for compound screening by establishing baseline organelle metrics in primary T cells.
- Reproducibility: Standardizes organelle quantification via flow cytometry, enabling consistent readouts across screening campaigns.
- Scalability: Supports multiplexed analysis of organelle content alongside surface markers for high-content phenotypic screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects mitochondrial and lysosomal dynamics to T cell-mediated pathologies in autoimmune and cancer models.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase metabolic profiling with preclinical validation of immunomodulatory candidates.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by correlating organelle shifts with functional outcomes in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization, enabling metabolic phenotyping as a filter for immunomodulatory activity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying organelle responses to genetic or pharmacological perturbations in T cells.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs for lysosomal and mitochondrial content that are compatible with flow cytometry-based screening platforms.
- Analytics: Generates mean fluorescence intensity and percentage-positive metrics that allow comparison of metabolic states across experimental conditions.
- Translational Research: Connects organelle metrics to preclinical continuity by tracking metabolic adaptation in disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable flow cytometry panel for immunometabolic profiling across multiple projects and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in T cell metabolic regulation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through standardized dye protocols and compensation controls.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying metabolically compromised or hyperactive T cell states early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on their impact on mitochondrial and lysosomal homeostasis.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry panel design and organelle-specific dye titration.
- Dependent on access to flow cytometers with sufficient fluorescence channels for multiplexed organelle and surface marker detection.
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols and gating strategies for consistent data interpretation.
- Involves adaptation considerations when applying the method to non-lymphoid primary cells or tissue-derived samples.
- Limited by the availability and specificity of organelle dyes, which may require validation in new model systems.
