כימות מבוססי Cytometry זרימה ססגוניות של המיטוכונדריה, Lysosomes בתאי T

שיטה זו יכולה לעזור לנו לענות על שאלות מפתח בתחום חילוף החומרים החיסנותי. היתרון של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת כימות של מיטוכונדריה או ליזוזומים בתאים חיים בודדים, בתערובת מורכבת של סוגי תאים שונים. שיטה זו לחקר תאי T ו- B יכולה להיות מיושמת גם על סוגי תאים רבים אחרים כגון מקרופאגים, תאים דנדריטיים או תאים ראשיים שנקטפו מדגימת רקמה.

ההליך יוכח על ידי צ'ין-וון וואי, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי לתייג את האורגנות לכמת, ראשית, הוסף פעם אחת עשר לתאי T של העכבר השישי לצינור פקס תחתון עגול אחד לכל סמן. ולכדור את התאים על ידי צנטריפוגה.

מחומם מראש למדיום תרבות נטול סרום 37 מעלות כדי לדלל את פתרונות מלאי הבדיקה הספציפיים של organelle לריכוזי עבודה סופיים במדיום. ולהשעות מחדש את התאים ב100 microliters של צבע בדיקה לכל צינור. לאחר מכן, הדגירה את התאים באינקובטור תרבות התא לתקופת הכתמים המתאימה, לעצור את התגובה בסוף הדגירה עם מיליליטר אחד של חיץ פקס קר קרח לכל צינור.

לאחר מכן, לאסוף את התאים עם צנטריפוגה אחרת ולהשעות מחדש את כדורי ב 100 microliters של pre-titrated 24G2 היברידית על הקרח. לאחר עשר דקות, הוסף מיליליטר אחד של מאגר פקס לצינור. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ולתייג את התאים עם 50 microliters של הפלואורסצנטיות מראש ציצים קוקטייל נוגדנים עניין.

מוסיפים את הריכוז המתאים על פי הטבלה. ומאגר פקס במשך 20 דקות על קרח, מוגן מפני אור. בסוף הדגירה, להוסיף מיליליטר אחד של מאגר פקס לכל צינור.

לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. ולהשעות מחדש את התאים ב300 microliters של מאגר פקס בתוספת מיקרוגרם אחד למיליליטר של פרופידיום יודיד. מיד לאחר הוספת הנגד הגרעיני והכרומוזום, הפעל את מחשב ניתוח ציטומטר הזרימה, ציטומטר זרימה, תוכנה לרכישת פקסים וכל התקני עזר אחרים בהתאם לפלטפורמת המכונה.

הפעל PBS דרך המערכת במשך כדקה אחת כדי להבטיח שקו הזרימה יתמלא במאגר PBS ונדן. פתח ניסוי חדש והגדר את הפרמטרים של הציטרומטר בהתאם להוראות היצרן. סנן את התאים באמצעות מסננת תאים של 70 מיקרומטר.

ומערבולת לפני הרכישה של כל מדגם כדי למנוע גושים היווצרות כפולה. פתח את ההגדרה פיצוי אוטומטי וצור התוויות נקודה עבור כל פרמטר פלואורסצנטי. לאחר שכל המתחים נקבעו, התאימו את הפיצוי והחלו את הפיצוי על הדגימות.

צור תרשים פיזור קדמי לעומת פיזור צד ומטב את המתחים כך ותאי העניין יופיעו בתוך ההתוויה. צור פיזור קדימה לעומת תרשים גובה פיזור קדימה ושער התאים הבודדים. צור אזור פיזור קדימה לעומת חלקת אזור פיזור בצד ושער הלימפוציטים.

צור אזור פיזור קדימה לעומת חלקת יודיד פרופיד ושער התאים החיים. לאחר שכל המתחים נקבעו, התאימו את הפיצוי והחלו את הפיצוי על הדגימות. לאחר מכן לטעון את הצינור מדגם הראשון, ליצור את החלקות סמן פני התא המתאים, ולאסוף לפחות 1,000 אירועים של האוכלוסייה של עניין.

לאחר הפעלת כל הדגימות, יצא את נתוני הזרימה לניתוח הבא. ולשמור את הניסוי כתבנית כדי לשמר את הגדרות הציטרומטר ופרמטרים לניסויים דומים בעתיד. תכולת המיטוכונדריה של האתר הסופי היא הנמוכה ביותר בתאי T שליליים כפולים, שיא בשלב שלילי כפול 2 ו-3, וירידה קלה בשלב שלילי כפול 4.

עם thymocytes חיובי כפול המדגים מספרים גבוהים יותר של מיטוכונדריה מאשר CD4 ו CD8 תירוציטים חיוביים יחיד, מה שמרמז כי התוכן המיטוכונדריאלי להשתנות במהלך הפיתוח. CD4 ו- CD8 thymocytes חיובי יחיד להפגין עוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת מיטוכונדריאלית גבוהה יותר מאשר תאים CD4 או CD8 T טחול, מה שמרמז כי תאי T נאיביים כי recirculate בסביבת הדם עשיר בחמצן יש מסה מיטוכונדרית נמוכה עוד יותר מאשר thymocytes. מעניין, הפחתה זו של תוכן המיטוכונדריאלי בולטת יותר ב- CD8 מאשר שושלת התאים CD4 T, והפעלת תא T מקטינה עוד יותר את נוכחותם של איברים אלה.

תוכן ליזוזומלי נמוך יחסית, אך ניתן לגילוי, נצפה בכל אוכלוסיות התימוסיטים, עם נוכחות בולטת יותר בתימין אחד שלילי כפול. בפריפריה, מספר גבוה יחסית של ליזוזומים מזוהים בתאי T חיוביים של זיכרון ומחולל CD8. שילוב צבעים ספציפיים organelle וסמן פני השטח עם ציטומטריה זרימה היא דרך רבת עוצמה לאפיין את המצב המטבולי של תאים בתערובת מורכבת.

ניתן להשתמש בצבע ספציפי נוסף של Organelle כדי לזהות רטיקולום אנדופלסמי, vacuole אוטופגי, או תא עניין תאי אחר.