Name: כימות מבוססי Cytometry זרימה ססגוניות של המיטוכונדריה, Lysosomes בתאי T (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: למד כיצד לכמת מיטוכונדריה וליזוזומים בתאי T חיים באמצעות ציטומטריית זרימה רב-צבעית. שיטה זו מאפשרת ניתוח מטבוליזם חיסוני בתערובות מורכבות של תאים שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הפיתוח של פרוטוקול זה נתמך על ידי מענקים משרד טייוואן המדע, הטכנולוגיה (רובם) NSC103-2320-B-010-002-MY2, MOST104-2628-B-010-002-MY4 מודיע Hsu. . סי-וו ווי היא נמען של מעולה התזה פרס של המכון של מיקרוביולוגיה, אימונולוגיה, האוניברסיטה הלאומית של יאנג-מינג.

העכבר רקמות הקציר ההליך המתואר כאן אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של האוניברסיטה הלאומית של יאנג-מינג.
1. הכנת לימפוציט השעיה של איברי הלימפה
<ol><li>המתת חסד העכבר על ידי שיטה שאושרו כגון CO2 שאיפת בתא אקרילי שקוף ואחריו נקע בצוואר הרחם כדי להבטיח מוות. הערה: לשמור על קצב הזרימה של CO2 עבור 20% לעקירה לדקה של התא, ומעלה לא מאשר 5 psi (פאונד לאינץ מרובע). זה לוקח 2-3 דקות בשביל עכבר איבד את ההכרה. לשמור על הזרימה2 CO לפחות עבור 1 דקות אחרי החיה הפסיק לנשום (5-7 דקות הכוללת).</li>
	<li>הנח את העכבר על גבו על לוח נקי (למשל לוח פלסטיק פוליסטירן) ולתקן את הגפיים עם קלטת. לשטוף עם 70% אתנול.</li>
	<li>הקציר הטחול, לחתוך ולפתוח את חלל הבטן במספריים ויבתר 11-ס"מ (הטחול הוא מתחת לבטן, מעל הכליה השמאלית). להסיר את הטחול עם מלקחיים ולנקות של רקמות החיבור (להשתמש במספריים במידת הצורך).</li>
	<li>הקציר בלוטת התימוס, חותכים את הסרעפת, הצלעות משני הצדדים עם לנתח מספריים. להשתמש מלקחיים להרים את החזה כדי לחשוף את כל חלל בית החזה. להפריד התימוס בקפדנות סביב רקמות עם מספריים, ולהסיר כל רקמת חיבור שיורית על מגבת נייר שנרטבו עם PBS.</li>
	<li>מכנית מביצועם הרקמות עם פומפה מזרק בקערה 6 ס מ המכיל 5 מ"ל כקרח FACS מאגר (PBS שיושלם עם 2% סרום שור עוברית (FBS) ו- 1 מ מ EDTA). להעביר את המתלים תא בודד שפופרת צנטרפוגה 15-mL; כדי לבשל 6 ס מ עם מאגר נוסף 2 מ"ל FACS ומשלבים בכביסה עם תא ההשעיה גם כן.</li>
	<li>Centrifuge התליה תא (300 x g, עבור 5 דקות ב 4 ° C) וזורקים את תגובת שיקוע. מחדש להשעות את גלולה עם 2 מ"ל של אמוניום כלוריד-אשלגן (ACK) lysing מאגר (155 מ מ NH4קלרנית, 10 מ מ KHCO3 ו- 0.1 מ מ נה2EDTA) עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר (RT) כדי lyse כדוריות דם אדומות. לנטרל את המאגר אישור על-ידי הוספת 10 מ"ל FACS מאגר התליה תא.</li>
	<li>Centrifuge התליה תא (300 x g, עבור 5 דקות ב 4 ° C) וזורקים את תגובת שיקוע. להשעות מחדש תאים ב 5 מ של בינוני RPMI מלאה (RPMI 1640 בינוני, שיושלם עם 44 מ מ NaHCO3, חומצה-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 10 מ מ 4 (HEPES), פניצילין U/mL 100, 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין, 2 מ מגלוטמין, 1 מ מ נתרן פירובט, חומצות אמינו שאינן הכרחיות MEM 1% ו-10% FBS).</li>
	<li>ההשעיה תא סינון דרך מסננת תא (נקבוביות בגודל 70 מיקרומטר) כדי להסיר תאים גושים. ספירת תאים עם hemocytometer או מונה תא אוטומטית.</li>
</ol>2. כימות של המיטוכונדריה, Lysosomes
הערה: בצע לצבוע אברון ספציפיים מכתים קודם כי התנאי מכתימים אופטימלית צבעים אלה הוא הדגירה ב 37 º C. ההכתמה סמן משטח ניתן להפחתה בגלל נוגדנים מיצוי, הפנמה בטמפרטורה הזו.
<ol><li>להוסיף 1 x 10 תאים6 למטה לסיבוב צינורות FACS, צנטריפוגה תאים (300 x g, עבור 5 דקות ב 4 ° C), למחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>לדלל את הפתרונות מלאי רגש ריכוז בעבודה הסופית (100 ננומטר MitoTracker ירוק או ירוק LysoTracker; מעתה ואילך ספציפיים המיטוכונדריה או ליזוזום לצבוע, בהתאמה) מראש ומחוממת-37 ° C ללא סרום תרבות בינוני. זהו הפתרון עובד עבור צבע ספציפיים ליזוזום או המיטוכונדריה. הערה: בדיקת ריכוזים מרובים כולל טווח ריכוזים עבודה שהוצעה על ידי היצרן (20-200 ננומטר לצבוע המיטוכונדריה ספציפי) ו- 50-75 ננומטר בשביל לצבוע ליזוזום ספציפי המשמש כאן על מנת לקבל את הטוב ביותר מכתים יעילות. לבחור אוכלוסיה תא מוכרת יש הבעה טובה של צביעת המטרה (למשל lysosomes) כפקד חיובית (למשל אדם CD14+ ומונוציטים). בחר את הריכוז בעבודה המבוססת על הפרדה טובה בין ואתאיזם מכתים, כמו גם הכדאיות תא טוב.</li>
	<li>Resuspend תאי µL 100 של ליזוזום המיטוכונדריה ספציפיים או לצבוע את הפתרון עובד, דגירה ב- 5% CO2 החממה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות או 30 דקות, בהתאמה.</li>
	<li>להוסיף 1 מ"ל של מאגר FACS קרח כדי לעצור את התגובה. גלולה תאים על ידי צנטריפוגה (300 x g, עבור 5 דקות ב 4 ° C) ולמחוק את תגובת שיקוע. התאים מוכנים כעת סמן משטח מכתים.</li>
</ol>3. משטח סמן מכתים
<ol><li>Fc לחסום קולטנים עם 100 µL של לפני, טיטרציה 2.4G2 ליפידים supernatant על הקרח עבור 10 דקות לשטוף תאים עם 1 מ"ל של מאגר FACS, צנטריפוגה (300 x g, עבור 5 דקות ב 4 ° C). למחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>דגירה התאים בשילוב לפני, טיטרציה נוגדן מצומדת זריחה µL 50 במאגר FACS בקרח במשך 20 דק. הימנע אור. הערה: להכין תאים בודדים שהוכתמו צבע זה כוללים את כל הנוגדנים פלורסנט להציג בהנוגדן שילוב תאים שטופלו רק לצבוע אברון ספציפיים להגדרת המתחים של גלאי קרינה פלואורסצנטית כל כיוונון פיצוי על זרימה cytometer. באופן דומה, להכין את פלורסצנטיות מינוס אחד (FMO) כפקדים רקע באמצעות תאים צבעונית עם כל הנוגדנים, אך ללא צביעת עם צבעי אברון ספציפיים.</li>
	<li>לשטוף את התאים על-ידי הוספת 1 מ"ל של מאגר FACS, גלולה על ידי צנטריפוגה (300 x g, עבור 5 דקות ב 4 ° C). למחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend תאי µL 300 FACS מאגר המכיל 1 µg/mL propidium יודיד (PI) ולנתח באופן מיידי את הדוגמאות על זרימה cytometer.</li>
</ol>4. המדגם אוסף זרימה Cytometer
<ol><li>הפעל את המחשב, זרימה cytometer, FACS רכישת תוכנה, אביזר התקנים אחרים בהתאם פלטפורמת מחשב. הפעל PBS עבור בסביבות 1 דקות על מנת להבטיח את זרימת קו מלא מאגר PBS, נדן. ודא שזרימת הזרם רץ בצורה חלקה.</li>
	<li>פתח ניסוי חדש ובחר cytometer פרמטרים (גלאי פלורסנט) על פי הוראות היצרן. לסנן התאים דרך מסננת תא 70-מיקרומטר ו מערבולת לפני רכישת כל דגימה כדי למנוע גושים ויצירת כפיל.</li>
	<li>להפוך חלקות נקודה של פיזור קדמי (FSC) ופיזור צד (האס), אשר מייצגים את גודל התא, צפיפות, בהתאמה. למטב את המתחים של FSC האס כדי לוודא שהתאים עניין להופיע החלקות. להפוך נקודה חלקות FSC-A לעומת FSC-W (או FSC-H) וצייר שער עבור התאים יחיד.</li>
	<li>להפוך נקודה חלקות כל פרמטר פלורסנט. להשתמש תאים וללא רבב כדי לקבוע רקע אות ושימוש בפקדים שהוכתמו צבע יחיד כדי להתאים את המתחים של כל פרמטר פלורסנט, כך שאוכלוסיות תא חיוביים ושליליים ניתן להבחנה ברורה ואת בתוך הטווח הדינמי של רכישה.</li>
	<li>לאחר כל החשמלי נקבעים, השתמש אוטומטית-פיצויים אם הוא זמין, או להתאים ידנית את הפיצוי עם וללא רבב, רווק שהוכתמו צבע שולט לתיקון העודפים ספקטרלי. להחיל את הפיצוי על דגימות.</li>
	<li>להפוך את מגרש נקודה של כל פרמטר וצייר השערים על-פי ניסיוני הסט שלך. לדוגמה, FSC-A לעומת FSC-H (או FSC-W) כדי לא לכלול doublets, ואחריו FSC-A לעומת האס-A עבור לימפוציט gating; האס-A לעומת PI (תאים חיים) ו CD4 לעומת CD8 (איור 1).</li>
	<li>לאסוף מספיק אירועים (cell סך הכל מספר) משמעות להשוואה בין אוכלוסיות. בדרך כלל, לפחות 1,000 אירועים באוכלוסייה עניין צריך להשיג20.</li>
	<li>לאחר כל הדגימות נרכשים, לייצא זרימת הנתונים כדי להיות מנותח על-ידי תוכנת ניתוח cytometry זרימה. שמור את הניסוי תבנית כדי לשמר את cytometer הגדרת פרמטרים עבור החלה על ניסויים דומים בעתיד.</li>
</ol>5. ניתוח נתונים
הערה: ישנם כלים רבים כדי לנתח נתונים cytometric זרימה, מסחרי ותוכנות חינם. רכישת התוכנה של cytometers הזרימה יכולה לעבוד גם לניתוח נתונים. כאן השתמשנו FlowJo כדוגמה.
<ol><li>להפעיל את התוכנה, גרור את הקבצים FCS לתוך סביבת העבודה. לחץ על דוגמה כדי לפתוח חלון גרפיקה. בחר פרמטרים יוצגו על ציר X ו- Y על ידי לחיצה על הצירים X ו- Y. השתמש בסרגל הכלים כדי לצייר שערים לפי סמני ביטוי באופן שונה או מוגדר פנוטיפים של אוכלוסיות תאים.</li>
	<li>הוסף שערי כל פרמטר כמוצג באיור1. גרור שערי כל דוגמאות בסביבת העבודה, כך הם מקבלים זהים gating.</li>
	<li>גרור החלקות פריסה עורך ליצירת דוחות גרפיים.</li>
	<li>הצג את עוצמת קרינה פלואורסצנטית רשע (MFI) עבור כל אוכלוסיית עניין על-ידי לחיצה על לחצן סטטיסטיקת (סיגמא) בחלון הגרפיקה ובחירה "מתכוון" ואני הפרמטר המתאים, לדוגמה, את הערוץ המשמשים לזיהוי צבע ספציפי אברון. לחץ על 'הוסף'.</li>
	<li>לחץ על הסמל עורך טבלה וגרור MFI עורך טבלה כדי ליצור דוחות סטטיסטיים. שמור כקובץ Excel, טקסט או CSV כדי לחשב דלתא MFI (ΔMFI) כמו MFI (צבע ספציפי אברון) - MFI (FMO). הערה: לא לחשב MFI בין דגימות רכשה עם cytometer שונים הגדרות (מתח, ערוצי פלורסנט או פיצויים). השוואות של ערכים נגזר ניסויים עם הגדרות שונות הינם חסרי משמעות משוחד.</li>
	<li>לייצא את כל הערכים סביבת העבודה ואת חלקות מעורך פריסה עבור ביצוע טבלאות ואיורים.</li>
</ol>

<ol><li>Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+metabolism+drives+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">T cell metabolism drives immunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).</li>
<li>Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+metabolic+reprogramming+in+proliferating+cells%3A+implications+for+T-cell-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: implications for T-cell-mediated immunity.</a> Immunology. 136 (4), 363-369 (2012).</li>
<li>Pua, H. H., Guo, J., Komatsu, M., He, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+is+essential+for+mitochondrial+clearance+in+mature+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Autophagy is essential for mitochondrial clearance in mature T lymphocytes.</a> The Journal of Immunology. 182 (7), 4046-4055 (2009).</li>
<li>Chao, T., Wang, H., Ho, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Control+and+Guidance+of+Cellular+Activities+of+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Control and Guidance of Cellular Activities of T Cells.</a> Frontiers in Immunology. 8, 473(2017).</li>
<li>Youle, R. J., Narendra, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mitophagy.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (1), 9-14 (2011).</li>
<li>Diogo, C. V., Yambire, K. F., Fernández Mosquera, L., Branco, F. T., Raimundo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+adventures+at+the+organelle+society%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial adventures at the organelle society.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 500 (1), 87-93 (2018).</li>
<li>Todkar, K., Ilamathi, H. S., Germain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+Lysosomes%3A+Discovering+Bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and Lysosomes: Discovering Bonds.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 106(2017).</li>
<li>McLelland, G. L., Soubannier, V., Chen, C. X., McBride, H. M., Fon, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkin+and+PINK1+function+in+a+vesicular+trafficking+pathway+regulating+mitochondrial+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Parkin and PINK1 function in a vesicular trafficking pathway regulating mitochondrial quality control.</a> The EMBO Journal. 33 (4), 282(2014).</li>
<li>Wrighton, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism%3A+Mitophagy+turns+beige+adipocytes+white%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolism: Mitophagy turns beige adipocytes white.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 607(2016).</li>
<li>Altshuler-Keylin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beige+Adipocyte+Maintenance+Is+Regulated+by+Autophagy-Induced+Mitochondrial+Clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Beige Adipocyte Maintenance Is Regulated by Autophagy-Induced Mitochondrial Clearance.</a> Cell Metabolism. 24 (3), 402-419 (2016).</li>
<li>Settembre, C., Fraldi, A., Medina, D. L., Ballabio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+from+the+lysosome%3A+a+control+centre+for+cellular+clearance+and+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Signals from the lysosome: a control centre for cellular clearance and energy metabolism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (5), 283-296 (2013).</li>
<li>Qu, P., Du, H., Wilkes, D. S., Yan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+roles+of+lysosomal+acid+lipase+in+T+cell+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Critical roles of lysosomal acid lipase in T cell development and function.</a> The American Journal of Pathology. 174 (3), 944-956 (2009).</li>
<li>Wei, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibrative+Nucleoside+Transporter+3+Regulates+T+Cell+Homeostasis+by+Coordinating+Lysosomal+Function+with+Nucleoside+Availability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Equilibrative Nucleoside Transporter 3 Regulates T Cell Homeostasis by Coordinating Lysosomal Function with Nucleoside Availability.</a> Cell Reports. 23 (8), 2330-2341 (2018).</li>
<li>Baixauli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Respiration+Controls+Lysosomal+Function+during+Inflammatory+T+Cell+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Respiration Controls Lysosomal Function during Inflammatory T Cell Responses.</a> Cell Metabolism. 22 (3), 485-498 (2015).</li>
<li>Piantadosi, C. A., Suliman, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+transcription+factor+A+induction+by+redox+activation+of+nuclear+respiratory+factor+1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial transcription factor A induction by redox activation of nuclear respiratory factor 1.</a> The Journal of Biological Chemistry. 281 (1), 324-333 (2006).</li>
<li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+association+of+the+proapoptotic+protein+Bim+with+Bcl-2-related+proteins+on+mitochondria+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Constitutive association of the proapoptotic protein Bim with Bcl-2-related proteins on mitochondria in T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7681-7686 (2004).</li>
<li>Ding, W. X., Yin, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy%3A+mechanisms%2C+pathophysiological+roles%2C+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mitophagy: mechanisms, pathophysiological roles, and analysis.</a> Biological Chemistry. 393 (7), 547-564 (2012).</li>
<li>van der Windt, G. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8+memory+T+cells+have+a+bioenergetic+advantage+that+underlies+their+rapid+recall+ability%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336(2013).</li>
<li>Chikte, S., Panchal, N., Warnes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Lyso+dyes%3A+A+flow+cytometric+study+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Use of Lyso dyes: A flow cytometric study of autophagy.</a> Cytometry Part A. 85 (2), 169-178 (2013).</li>
<li>Allan, A. L., Keeney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cell+analysis%3A+technical+and+statistical+considerations+for+application+to+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cell analysis: technical and statistical considerations for application to the clinic.</a> Journal of Oncology. 2010, 426218(2010).</li>
<li>Curtsinger, J. M., Lins, D. C., Johnson, C. M., Mescher, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+3+tolerant+CD8+T+cells+degranulate+in+response+to+antigen+but+lack+granzyme+B+to+mediate+cytolysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Signal 3 tolerant CD8 T cells degranulate in response to antigen but lack granzyme B to mediate cytolysis.</a> The Journal of Immunology. 175 (7), 4392-4399 (2005).</li>
<li>Wolint, P., Betts, M. R., Koup, R. A., Oxenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+cytotoxicity+but+not+degranulation+distinguishes+effector+and+memory+subsets+of+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immediate cytotoxicity but not degranulation distinguishes effector and memory subsets of CD8+ T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 199 (7), 925-936 (2004).</li>
<li>Van den Bossche, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Dysfunction+Prevents+Repolarization+of+Inflammatory+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Dysfunction Prevents Repolarization of Inflammatory Macrophages.</a> Cell Reports. 17 (3), 684-696 (2016).</li>
<li>Pearce, E. J., Everts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell metabolism.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).</li>
<li>Dugnani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+T+cell+metabolism+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Integrating T cell metabolism in cancer immunotherapy.</a> Cancer Letters. 411, 12-18 (2017).</li>
<li>Yang, Z., Matteson, E. L., Goronzy, J. J., Weyand, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+metabolism+in+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">T-cell metabolism in autoimmune disease.</a> Arthritis Research & Therapy. 17 (1), 29(2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים אין קונפליקטים של אינטרסים.

פרוטוקול זה משלב צבעים ספציפיים אברון סמן משטח מכתים לכמת את כמות המיטוכונדריה או lysosomes באוכלוסיות שונות תא T. שיטה זו פותחה כדי להתגבר על המגבלה של מספר תאים הומוגניות דרישות עבור שיטות מסורתיות, כגון מיקרוסקופ אלקטרונים וניתוח immunoblot. זה שימושי במיוחד ניתוח נדיר תא אוכלוסיות ובדיקת סוגי תאים מרובים בו-זמנית באותו זמן.
משך ההליך הטמפרטורה של דגירה הגורמים הקריטיים ביותר פרוטוקול זה בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. תיוג אברון תקין דורש טיטור מדויק של צבע ספציפי אברון. תאים צריך גם לשמור ב...

הפעלת ושגשוגם של תאי T הם שלבים קריטיים להרכבת תגובות חיסוניות מוצלחת. התפתחויות אחרונות מראים כי החומרים הסלולר קשורה באופן הדוק פיתוח והן פונקציות של תאי T. לדוגמה, תאים נאיביים T מסתמכים בעיקר על זרחון חמצוני (OXPHOS) את הביקוש אנרגיה במהלך מחזור בין איברי הלימפה משני. בעת ההפעלה, תמים T תאים עוברים דרסטית מטבולית התכנות, כולל את אינדוקציה של אירובי גליקוליזה כדי להגביר את ייצור ATP וכדי למלא את דרישות המטבולית אדירה במהלך התמיינות תאים והתפשטות. התאים מתקשה להבין. דרך לצרכים מטבוליים למות על ידי אפופטוזיס1,2. במהלך התיכנות מטבולית המיטוכונדריה לשחק תפקידים חשובים מאז הם organelles אחראי במידה רבה הייצור של ATP לאספקת אנרגיה של התא, התוכן המיטוכונדריה הסלולר תנודות במהלך מתגים מטבולית ברחבי T cell פיתוח והפעלה3. אולם, ההצטברות של המיטוכונדריה מיותר או פגום יכול לייצר עודפי ROS נזק שומנים, חלבונים ו- DNA, והוא יכול להוביל בסופו של דבר לתא המוות4
המיטוכונדריה מוגזם או נזק הנובעים שינויים מטבוליים יוסרו על ידי צורה מיוחדת של autophagy5, המכונה mitophagy. המיטוכונדריה הם עטוף autophagosomes, ואז התמזגו עם lysosomes עבור השפלה. אלה סגור תקשורת בין המיטוכונדריה, lysosomes יצרו עניין רב6,7. לדוגמה, סטרס חמצוני מעוררת את המיטוכונדריה ליצור שלפוחית נגזר המיטוכונדריה (MDVs) המיועדים כדי lysosomes על השפלה פוספטאז, tensin homolog (PTEN)-induced בשם קינאז 1 (PINK1) ואת פרקין (ליגאז אוביקוויטין E3) אופן התלויים8. גם נמצאו ש-mitophagy הזה הוא חיוני עבור adipocyte בז ללבן המעבר9,10. חשוב מכך, lysosomes אינם רק תא השפלה, אלא גם מווסת של איתות. הצטברות מוגזמת המצע עקב ליקויים האנזים מתבטא בתפקוד lysosomal באמצעות שיבוש חדירות הממברנה lysosomal ומשפיע על Ca2 + הומאוסטזיס11. פגמים פונקציונלי תא T ליפאז lysosomal חומצה (LAL)12 או המטבוליט lysosomal טרנספורטר נוקאאוט העכבר דגם13 נוסף הראה את החשיבות של lysosomes בשמירה על הומאוסטזיס תא T. המיטוכונדריה וגם lysosomes הם חלקים בלתי נפרדים של רגולציה חילוף החומרים הסלולר. לכן, מדידה של תכנים סלולריים מיטוכונדריאלי כבר חיווי חיוני כדי להעריך את מצב מטבולי ופונקציונליים של תא T.
מבחני נפוץ לכמת תוכן סלולרי מיטוכונדריאלי או lysosomal כוללים immunoblot, מיקרוסקופ אלקטרונים, immunofluorescent מכתים (אם), וניתוח PCR מיטוכונדריאלי DNA עותק מספרי14,15, 16. בעוד immunoblot יכול באופן כמותי משווים רמות החלבון בין דוגמאות שונות, אלקטרון או אם מיקרוסקופ ניתן להמחיש את מבוקשם מורפולוגי של אלה organelles17, אלה מבחני לשאת חסרונות טכניים מסוימים. לדוגמה, זה זמן רב כדי לרכוש מספר מספיק של התא תמונות בהגדלה וברזולוציה או להשוות את רמות הביטוי של חלבון על פני עשרות של דגימות, ביצוע מבחני אלה נחשבת שיטות תפוקה נמוכה. יתר על כן, מבחני אלה ניתן להחיל רק אוכלוסייה הומוגנית התא, כגון שורות תאים, אך לא דגימות רקמה המורכב של אוכלוסיות מעורבות.
. זה גם קשה להחיל את מבחני אלה אוכלוסיות נדירה, שבה הדרישה תא מינימלי של מספרים מ-106 עד 108 בלתי אפשרי לפגוש. לבסוף, התאים בדרך כלל lysed או קבוע במהלך תהליך שהופך אותם עולה בקנה אחד עם שיטות אחרות כדי לחלץ מידע נוסף. לעומת שיטות מסורתיות, cytometry זרימה מבוססי פלורסנט בעלת תפוקה גבוהה יחסית של - המידע של כל התאים בטווח מדגם המורכב אוכלוסיות מעורבות לתאים יכול להיות מנותח ואסף בו זמנית. בנוסף, אחד יכול לזהות יותר מ- 10 פרמטרים באותו התא, למיין את התאים בהתאם פנוטיפים הרצוי עבור עוד מבחני. תגובתי הגששים פלורסנט שימשו לה תווית lysosomes, המיטוכונדריה בתאים חיים, ניתן להבחין לזרום cytometry18,19. הגששים אברון ספציפיים אלה תא חדיר, יש מאפיינים הכימי פיזיקלי, אשר מאפשרות להם מרוכזים מיקומים ספציפיים subcellular או organelles. בנוחות, רגשים אלו זמינים במגוון פורמטים פלורסנט, ובכך מאפשר היישום שלהם לניתוח ססגוניות.
פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד לשלב סמן משטח מכתים עם ליזוזום-המיטוכונדריה ספציפיים או צבע כדי lysosomes תווית או במיטוכונדריה לחיות תאים. הדבר שימושי במיוחד עבור דגימות המופקים העיקרי רקמות ואיברים, אשר לעיתים קרובות מורכבים של אוכלוסיות הטרוגניות התא. החוקרים ניתן לזהות אוכלוסיות תאים עניין על-ידי ביטוי סמן משטח שלהם, במיוחד למדוד את התוכן lysosomal או מיטוכונדריאלי באמצעות צבעי אברון ספציפי בתאים אלה. . הנה, נדגים ההליך מפורט של ניתוח cytometric תזרים המעריכה את המיסה lysosomal או מיטוכונדריאלי subpopulations תא T הטחול הגדולות.

<table><tbody><tr><td>10 ס"מ מלקחיים Graefe (ישרים ומשוננים)</td><td>Dimeda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>11 ס"מ מספריים איריס (ישר עם ראשים חדים/חדים)</td><td>Dimeda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה 15 מ"ל</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 5 מ"ל</td><td>TERUMO&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי 6 ס"מ</td> <td>אלפא;-פלוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 ומיקרו; מסננת תאי ניילון m</td><td>SPL Lifesciences</td><td>93070</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום כלוריד (NH<תת>4Cl) &nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD25</td><td>Biolegend</td><td>102007</td><td>שיבוט: PC61</td></tr><tr><td>נגד עכבר CD4</td><td>Biolegend</td><td>100453</td><td>שיבוט: GK1.5</td></tr><tr><td>נגד עכבר CD44</td><td>Biolegend</td><td>103029</td><td>שיבוט: IM7</td></tr><tr><td>נגד עכבר CD62L</td><td>Biolegend</td><td>104407</td><td>שיבוט: MEL-14</td></tr><tr><td>נגד עכבר CD8</td><td>Biolegend</td><td>100713</td><td>שיבוט:53-6.7</td></tr><tr><td>אנטי עכבר TCR ובטא;</td><td>שיבוט 109233 Biolegend</td><td></td>: <td>H57-579</td></tr><tr><td>BD LSRFortessa</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td> <td>Bio basic</td><td>6381-92-6</td><td></td></tr><tr><td>FALCON 5 מ"ל צינור פוליסטירן עגול תחתון (צינור FACS)</td> <td>BD Biosciences</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>ATD161145</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo, LLC</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyethyl piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES)</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין (200 מ"מ)</td><td>Gibco</td><td>A2916801</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Green DND26</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L7526</td><td></td></tr><tr><td>MEM חומצות אמינו לא חיוניות (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker ירוק FM</td><td>תרמו פישר Scientific</td><td>M7514</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)</td><td>ג'יבקו</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן ביקרבונט (KHCO3)</td><td>J.T.baker</td><td>298-14-6</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת יודיד פרופידיום</td><td>סיגמא</td><td>25535-16-4</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 בינוני (אבקה)</td><td>גיבקו</td><td>31800089</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט (NaHCO3)</td><td>סיגמא</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט (100 מ"מ)</td><td>ג'יבקו</td><td>11360070</td><td></td></tr></tbody></table>

כימות מבוססי cytometry זרימה ססגוניות של המיטוכונדריה, lysosomes בתאי t

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

תאי T לנצל תוכניות מטבוליות שונות כדי להתאים לצרכיהם תפקודית במהלך התמיינות והתפשטות. המיטוכונדריה הם רכיבים חיוניים הסלולר אחראית לאספקת אנרגיה תא; עם זאת, המיטוכונדריה עודף גם מייצרים מינים חמצן תגובתי (ROS) שעלולה לגרום מוות של תאים. לכן, ומספר המיטוכונדריה עליך להתאימם כל הזמן להתאים את הצרכים של התאים. תקנה דינמית זו מושגת באופן חלקי באמצעות הפונקציה של lysosomes להסיר את עודף/פגום organelles ו מקרומולקולות. לפיכך, תוכן סלולרי מיטוכונדריאלי, lysosomal הם מחווני מפתח להערכת ההתאמה חילוף החומרים של התאים. עם התפתחות זונדי organelles, ליזוזום מאופיין היטב או צבע ספציפי המיטוכונדריה הפכו זמינים בפורמטים שונים כדי להדביק תווית lysosomes הסלולר ועל המיטוכונדריה. Cytometry זרימה ססגוניות הוא כלי נפוץ פרופיל תא פנוטיפים, יש לו את היכולת להיות משולב עם מבחני אחרים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כיצד לשלב צבעים ספציפיים אברון עם סמנים משטח מכתים כדי למדוד את כמות lysosomes של המיטוכונדריה באוכלוסיות שונות תא T על cytometer זרימה.

זיהוי של קבוצות משנה עיקריים T cell הטחול, בלוטת התימוס
בקצרה, המתלים תא בודד מן הטחול ואת בלוטת התימוס lysed של כדוריות דם אדומות, מודגרות עם תגובת שיקוע 2.4G2, ואחריו צבע ספציפי אברון, סמן משטח מכתים עם נוגדנים מצומדת קרינה פלואורסצנטית (טבלה 1). התקדמות התפתחותית thymocytes יכולה להיות מתוארת באמצעות נוגדנים קולטני שיתוף CD8 ו CD4. Thymocytes הכי ילדותי לא מבטא CD4 או CD8, והם נקראים כפול שלי...

מאמר זה מדגים שיטה חזקה לכמת המיטוכונדריה או lysosomes בתאים חיים. השילוב של צבעי ספציפיים ליזוזום או המיטוכונדריה עם נוגדנים fluorescently מצומדת סמני פני השטח מאפשר כימות של אלה organelles אוכלוסיות מעורבות לתאים, כמו ראשי תאים שנקטפו דגימות רקמה, באמצעות cytometry זרימה ססגוניות.

כימות מבוססי Cytometry זרימה ססגוניות של המיטוכונדריה, Lysosomes בתאי T

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

שיטה זו יכולה לעזור לנו לענות על שאלות מפתח בתחום חילוף החומרים החיסנותי. היתרון של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת כימות של מיטוכונדריה או ליזוזומים בתאים חיים בודדים, בתערובת מורכבת של סוגי תאים שונים. שיטה זו לחקר תאי T ו- B יכולה להיות מיושמת גם על סוגי תאים רבים אחרים כגון מקרופאגים, תאים דנדריטיים או תאים ראשיים שנקטפו מדגימת רקמה.ההליך יוכח על ידי צ'ין-וון וואי, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי לתייג את האורגנות לכמת, ראשית, הוסף פעם אחת עשר לתאי T של העכבר השישי לצינור פקס תחתון עגול אחד לכל סמן. ולכדור את התאים על ידי צנטריפוגה.מחומם מראש למדיום תרבות נטול סרום 37 מעלות כדי לדלל את פתרונות מלאי הבדיקה הספציפיים של organelle לריכוזי עבודה סופיים במדיום. ולהשעות מחדש את התאים ב100 microliters של צבע בדיקה לכל צינור. לאחר מכן, הדגירה את התאים באינקובטור תרבות התא לתקופת הכתמים המתאימה, לעצור את התגובה בסוף הדגירה עם מיליליטר אחד של חיץ פקס קר קרח לכל צינור.לאחר מכן, לאסוף את התאים עם צנטריפוגה אחרת ולהשעות מחדש את כדורי ב 100 microliters של pre-titrated 24G2 היברידית על הקרח. לאחר עשר דקות, הוסף מיליליטר אחד של מאגר פקס לצינור. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ולתייג את התאים עם 50 microliters של הפלואורסצנטיות מראש ציצים קוקטייל נוגדנים עניין.מוסיפים את הריכוז המתאים על פי הטבלה. ומאגר פקס במשך 20 דקות על קרח, מוגן מפני אור. בסוף הדגירה, להוסיף מיליליטר אחד של מאגר פקס לכל צינור.לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. ולהשעות מחדש את התאים ב300 microliters של מאגר פקס בתוספת מיקרוגרם אחד למיליליטר של פרופידיום יודיד. מיד לאחר הוספת הנגד הגרעיני והכרומוזום, הפעל את מחשב ניתוח ציטומטר הזרימה, ציטומטר זרימה, תוכנה לרכישת פקסים וכל התקני עזר אחרים בהתאם לפלטפורמת המכונה.הפעל PBS דרך המערכת במשך כדקה אחת כדי להבטיח שקו הזרימה יתמלא במאגר PBS ונדן. פתח ניסוי חדש והגדר את הפרמטרים של הציטרומטר בהתאם להוראות היצרן. סנן את התאים באמצעות מסננת תאים של 70 מיקרומטר.ומערבולת לפני הרכישה של כל מדגם כדי למנוע גושים היווצרות כפולה. פתח את ההגדרה פיצוי אוטומטי וצור התוויות נקודה עבור כל פרמטר פלואורסצנטי. לאחר שכל המתחים נקבעו, התאימו את הפיצוי והחלו את הפיצוי על הדגימות.צור תרשים פיזור קדמי לעומת פיזור צד ומטב את המתחים כך ותאי העניין יופיעו בתוך ההתוויה. צור פיזור קדימה לעומת תרשים גובה פיזור קדימה ושער התאים הבודדים. צור אזור פיזור קדימה לעומת חלקת אזור פיזור בצד ושער הלימפוציטים.צור אזור פיזור קדימה לעומת חלקת יודיד פרופיד ושער התאים החיים. לאחר שכל המתחים נקבעו, התאימו את הפיצוי והחלו את הפיצוי על הדגימות. לאחר מכן לטעון את הצינור מדגם הראשון, ליצור את החלקות סמן פני התא המתאים, ולאסוף לפחות 1,000 אירועים של האוכלוסייה של עניין.לאחר הפעלת כל הדגימות, יצא את נתוני הזרימה לניתוח הבא. ולשמור את הניסוי כתבנית כדי לשמר את הגדרות הציטרומטר ופרמטרים לניסויים דומים בעתיד. תכולת המיטוכונדריה של האתר הסופי היא הנמוכה ביותר בתאי T שליליים כפולים, שיא בשלב שלילי כפול 2 ו-3, וירידה קלה בשלב שלילי כפול 4.עם thymocytes חיובי כפול המדגים מספרים גבוהים יותר של מיטוכונדריה מאשר CD4 ו CD8 תירוציטים חיוביים יחיד, מה שמרמז כי התוכן המיטוכונדריאלי להשתנות במהלך הפיתוח. CD4 ו- CD8 thymocytes חיובי יחיד להפגין עוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת מיטוכונדריאלית גבוהה יותר מאשר תאים CD4 או CD8 T טחול, מה שמרמז כי תאי T נאיביים כי recirculate בסביבת הדם עשיר בחמצן יש מסה מיטוכונדרית נמוכה עוד יותר מאשר thymocytes. מעניין, הפחתה זו של תוכן המיטוכונדריאלי בולטת יותר ב- CD8 מאשר שושלת התאים CD4 T, והפעלת תא T מקטינה עוד יותר את נוכחותם של איברים אלה.תוכן ליזוזומלי נמוך יחסית, אך ניתן לגילוי, נצפה בכל אוכלוסיות התימוסיטים, עם נוכחות בולטת יותר בתימין אחד שלילי כפול. בפריפריה, מספר גבוה יחסית של ליזוזומים מזוהים בתאי T חיוביים של זיכרון ומחולל CD8. שילוב צבעים ספציפיים organelle וסמן פני השטח עם ציטומטריה זרימה היא דרך רבת עוצמה לאפיין את המצב המטבולי של תאים בתערובת מורכבת.ניתן להשתמש בצבע ספציפי נוסף של Organelle כדי לזהות רטיקולום אנדופלסמי, vacuole אוטופגי, או תא עניין תאי אחר.

multicolor-flow-cytometry-based-quantification-mitochondria-lysosomes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים טכניקה מבוססת ציטומטריית זרימה באמצעות שני פלואורוכרום לזיהוי תאי T CD4+ ו- CD8+, תאי T γδ, תאי B, תאי הרג טבעי (NK) ומונוציטים בתאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים (PBMCs). לאחר הדגירה על התאים עם נוגדנים מצומדים פלואורוכרום כנגד סמני פני השטח, תת-קבוצות התא מזוהות באמצעות אסטרטגיית גטינג ציטומטרית אופטימלית של זרימה.

בדיקת ציטומטריית זרימה לזיהוי תת-קבוצות של תאי חיסון בתאים חד-גרעיניים היקפיים בדם

סרטון זה מדגים את התיוג של תאים עצביים עם נוגדנים לקומפלקסים של שרשרת נשימה מיטוכונדריאלית, חלבון הקשור ל-DNA מיטוכונדריאלי וחלבון הממברנה החיצונית המיטוכונדריאלית, ואחריו זרימה ציטומטרית כדי לכמת את רמותיהם.

מדידת פרמטרים מיטוכונדריאלים מרובים בתאי עצב באמצעות זרימה ציטומטרית

שתואר כאן הוא שיטה לאיתור וללכמת חלבוני קרום חיצוני של המיטוכונדריה ידי immunolabeling של מיטוכונדריה מבודדת מרקמת מכרסמים וניתוח על ידי cytometry זרימה. שיטה זו ניתנת להארכה על מנת להעריך היבטים פונקציונליים של אוכלוסיות המיטוכונדריה.

Immunodetection של החלבונים בממברנה חיצוניים על ידי cytometry הזרימה של מיטוכונדריה מבודדת

הנה, cytometry זרימת multispectral הדמיה עם תכונה אנליטית שמשווה תמונות פירוט בהיר של 3 סמנים autophagy ו quantifies שיתוף שלהם לוקליזציה, יחד עם ספירת LC3 ספוט, שימש למדוד autophagy באופן אובייקטיבי, כמותי, סטטיסטית וחסכונית.

הערכת השטף autofagic ידי מדידת LC3, p62, ו LAMP1 Co-localization באמצעות multispectral הדמיה cytometry

Mitophagy, השפלה סלקטיבי של המיטוכונדריה, היה מעורב הומאוסטזיס מיטוכונדריאלי, הוא deregulated למחלות אנושיות שונות. עם זאת, שיטות נסיוניות נוח למדידת פעילות mitophagy מוגבלים מאוד. כאן, אנו מספקים וזמינותו רגיש למדידת פעילות mitophagy באמצעות cytometry זרימה.

מדידה רגיש של Mitophagy מאת Flow Cytometry באמצעות תלויי-pH הכתב פלורסנט mt-Keima

. הנה, עבור בידוד ואפיון של CD4 פרוטוקול+ T-cell קבוצות משנה של דם היקפיים אדם מתואר. לטהר CD4+ תאי-T הם נותחו על ידי cytometry זרימה כדי לקבוע את הפרופורציות של T-הזקיקים תא מסייע קבוצות משנה.

בידוד של CD4+ תאי-T וניתוח של מחזורי Helper T-הזקיקים (cTfh) קבוצות משנה תא מ באמצעות דם היקפיים של Cytometry זרימה 6-צבע

אנו מתארים שיטה עבור שימוש בזרימה רב פרמטרים cy, לנסות לזהות מיני מיטוכונדריאלי מינים חמצן (ROS) ב מורטין גזע בריא המטבית ובתאי מחולל (HSPCs) ותאי לוקמיה ממודל העכבר של לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) מונע על ידי MLL-AF9.

הזרמת כדוריות הדם של מיני חמצן מיטוכונדריאלי מורטין בגזע ובתאי מחולל ולוקמיה מונחה AF9

משאבות xenoביוטיקה פעילים מאוד בתאי גזע ומחולל קדמון (HSPCs) ולגרום שחול TMRM, קרום מיטוכונדריאלי פוטנציאל לצבוע פלורסנט. כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד במדויק פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי ב HSPCs על ידי TMRM בנוכחות Verapamil, מדכא משאבת משאבה.

שיפור הדיוק של הערכה להערכת הזרימה של הפוטנציאל לממברנה מיטוכונדריאלי בתאי המטפאות ובתאים באמצעות עיכוב של משאבות אפלוקס

כאן אנו מתארים שיטה אמינה למדוד מסה מיטוכונדריאלי פוטנציאל קרום בתאי גזע vivo המטפאות לשעבר תאים T.

מדידת מיסת מיטוכונדריאלי ופוטנציאל ממברנה בתאי גזע ותאי T-תאים על ידי זרימה Cy,

מחקר זה מדווח על גישה חדשנית למדידת פרמטרים תפקודיים מיטוכונדריאליים מרובים המבוססים על ציטומטריה של זרימה והכתמה כפולה עם שני מדווחים פלואורסצנטיים או נוגדנים כדי לזהות שינויים בנפח המיטוכונדריה, פוטנציאל קרום המיטוכונדריה, רמת מיני חמצן תגובתי, הרכב שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית ודנ"א מיטוכונדריאלי.

ניתוח ציטומטרי של זרימה של פרמטרים מיטוכונדריאליים מרובים בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי האדם ונגזרותיהם העצביות והגליליות

למד כיצד לכמת מיטוכונדריה וליזוזומים בתאי T חיים באמצעות ציטומטריית זרימה רב-צבעית. שיטה זו מאפשרת ניתוח מטבוליזם חיסוני בתערובות מורכבות של תאים שונים.

כימות מבוססי Cytometry זרימה ססגוניות של המיטוכונדריה, Lysosomes בתאי T

גלה סרטונים נוספים