הרכבת המעבורות מולקולרי מופעל על ידי הפיכה מצורף Kinesins

פרוטוקול זה הוא משמעותי משום שהוא פותח את הדלת לחקירה נוספת בתכנון של מערכות ביולוגיות ננומטריות כי הם ב שיווי משקל דינמי. טכניקה זו ממלאת חלק מהפער בין מבנים מהונדסים וטבעיים משום שהיא מאפשרת לחקור את מה שאנו יכולים לקרוא לו, ריפוי עצמי' או החלפה דינמית של רכיבים מולקולריים. העצה החשובה ביותר לנסות טכניקה זו בפעם הראשונה היא לוודא כי הניסוי של ביצוע כל פרוטוקולי הבטיחות.

תחילה, הכן את פתרונות המלאי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. פיפטה 21.8 מיקרוליטר של חיץ BRB80 לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה קטן. הוסף מיקרוליטר אחד של פתרון מלאי מגנזיום כלוריד, 1 מיקרוליטר של פתרון מניית GTP, ו 1.2 microliters של פתרון המניות DMSO כדי לסיים את הכנת מאגר הצמיחה microtubule.

כדי להתחיל פילמור microtubule, להוסיף 6.25 microliters של מאגר צמיחה microtubule ישירות לתוך 20 מיקרוגרם aliquot של צינורלין ליופילי;שכותרתו להתרגש ב 647 ננומטר. וורטקס ב 40 RPS במשך 5 שניות. מצננים את האליקוט על הקרח במשך 5 דקות.

לאחר מכן, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות. כדי להתחיל ייצוב microtubule, להוסיף 5 microliters של פתרון paclitaxel aliquoted ל 490 microliters של מאגר BRB80. מערבולת הפתרון ב 30 RPS במשך 10 שניות.

לאחר 45 דקות של דגירה עבור microtubules הוא למעלה, להוסיף 5 microliters של פתרון זה BRB80, ותערובת paclitaxel, כדי ליצור את הפתרון MT100. ראשית, להוסיף 9.0 microliters של פתרון קסטין aliquoted כדי 291 microliters של מאגר BRB80. פיפטה 83 מיקרוליטרים של פתרון קנקין BRB80 לתוך צינור חדש 6 מיליליטר מיקרו צנטריפוגה.

הוסף 1 מיקרוליטר של גלוקוז D, אוקסידאז גלוקוז, קטלאז, DTT, קריאטין פוספט ופוספוקינאז. לאחר מכן, להוסיף 1 microliter של פתרון ATP המניה לפתרון תנועתיות. פליק, או מערבולת האליקוט כדי להפיץ הומוגנית את הכימיקלים.

לאחר מכן, להוסיף 1 microliter של פתרון kinesin מוכן לפתרון תנועתיות, כך הריכוז הסופי הוא 20 nanomolar. הוסף 10 מיקרוליטרים של פתרון MT100 לפתרון תנועתיות. עבור תאי זרימה, השתמש הן בכיסוי גדול והן בכיסוי קטן.

שוטפים את כל הכיסויים פעמיים עם אתנול ופעמיים עם מים אולטרה-חמים. Sonicate את הכיסויים שטף במים אולטרה חום במשך 5 דקות. לאחר מכן, לייבש את הכיסויים בתנור בטמפרטורה שבין 50 ל 75 מעלות צלזיוס.

השתמשו במנקה UV-ozone לטיפול בצד אחד של כל כיסוי במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר ובתנאים אטמוספריים רגילים. באמצעות פינצטה, להפוך כל כיסוי ולהשתמש UV-אוזון לטיפול בצד מטופל גם כן. Sonicate את כיסויים מטופלים במים אולטרה חום במשך 5 דקות.

לאחר מכן, לייבש אותם בתנור בטמפרטורה בין 50 ל 75 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, דון ציוד מגן כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לטבול כל כיסוי בתמיסת מלח במשך 15 שניות.

לשטוף את הכיסויים פעמיים בטולואן ושלוש פעמים במתנול. השתמש בחנקן בלחץ כדי לייבש את כיסויי. לאחר כיסויים יבשים, לחתוך חתיכת קלטת דו צדדית כי הוא 2 ס"מ על ידי 2.5 ס"מ.

חותכים את החתיכה הזאת לחצי אנכית לשתי רצועות 1 ס"מ על ידי 2.5 ס"מ. שים את כיסוי גדול על מגב משימה עדין ותדביק את רצועות הסרט אליו, אורך חכם לאורך הקצוות כדי ליצור 1 ס"מ על ידי 2.5 סנטימטר שטח בין חתיכות של קלטת. תקע את הכיסוי הקטן על גבי רצועות הקלטת כדי לסיים את הרכבת תא הזרימה.

ראשית, הזרם כ-20 מיקרוליטרים של פתרון PEG-PPG-PEG לתא הזרימה שהורכב. תן לפתרון לספוג על פני השטח במשך 5 דקות, ולאחר מכן, להחליף פתרון זה עם 20 microliters של מאגר BRB80 שלוש פעמים על ידי זרימת המאגר פנימה זרימה 20 microliters של פתרון תנועתיות לתוך תא הזרימה.

לאחר מכן, לאטום את הקצוות של תא הזרימה עם גריז כדי למנוע אידוי אם הניסוי המתוכנן הוא יותר משעה. בצע את ההדמיה באמצעות מיקרוסקופיה פנימית כוללת מסוג אובייקטיבי. מניחים טיפה של שמן טבילה על המטרה.

לאחר מכן, מקם את תא הזרימה על פלטפורמת המיקרוסקופ. ולהביא את המטרה עד שיש מגע בין השמן על המטרה לבין תא הזרימה. השתמש במערכת הכיסוי המשולבת של המיקרוסקופ כדי לחסום את כל אור הלייזר מלברוח.

לאחר מכן, הפעל את הלייזר והתמקד במשטח התחתון של תא הזרימה באמצעות לייזר 642 ננומטר כדי לדמיין את המיקרוטובולים, ולייזר 488 ננומטר כדי לדמיין את מנועי הקינסין GFP. הקלט את התמונות או הסרטונים המעניינים. ניתן להקליט תמונות כל עוד יש תנועתיות בתא הזרימה.

במחקר זה מוצגת מערכת ננומטרית פעילה, המרכיבה בעצמה אבני בניין מחייבות חלשות לבניית מסלול משלה. באמצעות מיקרוסקופ tirf, microtubules גלישה הם בנפרד בתמונה מן מנועי kinesin. Microtubules נראים על גירוי עם לייזר 647 ננומטר.

ואת קינסין GFP נראים כאשר נרגשים עם לייזר 488 ננומטר. הזמן שבין העירור לאור האדום והירוק היה פחות משנייה אחת. כפי שניתן לראות, microtubules גלישה לצבור מנועי kinesin מן הפתרון ולהפקיד אותם על פני השטח.

מנועי הקינסין נשארים בעקבות המיקרוטובולים לתקופה קצרה לפני שהם חוזרים לפתרון. חשוב מאוד לקבל את הריכוז הנכון של reagents ב antifade של פתרון תנועתיות, אחרת, הלבנת תמונה יגרום הניסוי להיכשל. טכניקה זו סוללת את הדרך לשימוש יעיל יותר במנועי חלבון במערכות מהנדסים ננומטריות.

כך, מאפשר תכנון וחקר של ננו-מבנים מורכבים יותר.