Name: ליפידומיקה ותעתיק במחלות נוירולוגיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: למד פרוטוקול מודולרי לליפידומיקה ותעתיק של רקמות ופלזמה במודלים של מחלות נוירולוגיות בעכברים. השיטה מאפשרת ניתוח בו-זמני של ליפידים ו-RNA באיכות גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מקדישים מאמר זה לד"ר ארמלינדה לומאצו. במהלך סיום כתב היד נפטרה ד"ר ארמלינדה לומזו. היא התגלמות התשוקה למדע ומעורבות לא אנוכית בעבודת צוות כדי להגשים מטרה מחקרית משמעותית. היא תמיד חלמה לתרום באופן משמעותי לרווחתם הגדולה יותר של בני האדם. טבעה טוב הלב מעולם לא נפגע על ידי הדרכים המאומצות של המדע והחיים. היא תישאר רבת ערך, ולנצח, בליבנו.
ג'וליה מ. פוסט מומנה על ידי תוכנית פוקוס למדעי המוח התרגומיים (FTN) במרכז הרפואי האוניברסיטאי של אוניברסיטת יוהנס גוטנברג מיינץ, וכיום ממומנת על ידי פרויקט היציאה SPP-2225 ל- LB. ראיסה לרנר מומן חלקית על ידי פרויקט DZHK 81X2600250 למתקן הליבה של LB ו- Lipidomics. מימון חלקי למחקרים אלה ניתן על ידי מתקן הליבה ליפידומיקס, המכון לכימיה פיזיולוגית, וקרנות תוך-גולגולתיות (ל- LB) מהמרכז הרפואי האוניברסיטאי של אוניברסיטת יוהנס גוטנברג מיינץ.

<ol><li>Aronica, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammatory+targets+and+treatments+for+epilepsy+validated+in+experimental+models%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammatory targets and treatments for epilepsy validated in experimental models.</a> Epilepsia. 58, 27-38 (2017).</li>
<li>Lerner, R., Post, J., Loch, S., Lutz, B., Bindila, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+brain+and+peripheral+plasticity+of+the+lipidome+in+acute+kainic+acid-induced+epileptic+seizures+in+mice+via+quantitative+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+and+Cell+Biology+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Targeting brain and peripheral plasticity of the lipidome in acute kainic acid-induced epileptic seizures in mice via quantitative mass spectrometry.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (2), 255-267 (2017).</li>
<li>Schuhmann, K., Almeida, R., Baumert, M., Herzog, R., Bornstein, S. R., Shevchenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+lipidomics+on+a+LTQ+Orbitrap+mass+spectrometer+by+successive+switching+between+acquisition+polarity+modes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes.</a> Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).</li>
<li>Puppolo, M., Varma, D., Jansen, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+analytical+methods+for+eicosanoids+in+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%3A+Analytical+Technologies+in+the+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">A review of analytical methods for eicosanoids in brain tissue.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 964, 50-64 (2014).</li>
<li>Blewett, A. J., Varma, D., Gilles, T., Libonati, J. R., Jansen, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+high-performance+liquid+chromatography-electrospray+mass+spectrometry+method+for+the+simultaneous+determination+of+23+eicosanoids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a high-performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry method for the simultaneous determination of 23 eicosanoids.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 46 (4), 653-662 (2008).</li>
<li>Lerner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+lipidomic+and+transcriptomic+profiling+in+mouse+brain+punches+of+acute+epileptic+seizure+model+compared+to+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls.</a> Journal of Lipid Research. 59, 283-297 (2017).</li>
<li>Lerner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+lipidomic+and+transcriptomic+profiling+in+mouse+brain+punches+of+acute+epileptic+seizure+model+compared+to+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls.</a> Journal of Lipid Research. , 1-48 (2018).</li>
<li>Lévesque, M., Avoli, M., Bernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+temporal+lobe+epilepsy+following+systemic+chemoconvulsant+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 260, (2016).</li>
<li>Eyo, U. B., Murugan, M., Wu, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia-Neuron+Communication+in+Epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia-Neuron Communication in Epilepsy.</a> Glia. 65 (1), 5-18 (2017).</li>
<li>Zhu, J., Zheng, X. Y., Zhang, H. L., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kainic+acid-induced+neurodegenerative+model%3A+Potentials+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Kainic acid-induced neurodegenerative model: Potentials and limitations.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 457079(2011).</li>
<li>Park, S. H., Sim, Y. B., Kim, C. H., Lee, J. K., Lee, J. H., Suh, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+%CE%B1-CGRP+in+the+regulation+of+neurotoxic+responses+induced+by+kainic+acid+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Role of α-CGRP in the regulation of neurotoxic responses induced by kainic acid in mice.</a> Peptides. 44, 158-162 (2013).</li>
<li>Lerner, R., Cuadrado, D. P., Post, J. M., Lutz, B., Bindila, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+lipidomic+and+transcriptional+changes+of+prophylactic+PEA+administration+in+control+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Broad lipidomic and transcriptional changes of prophylactic PEA administration in control mice.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 527(2019).</li>
<li>Post, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiepileptogenic+Effect+of+Subchronic+Palmitoylethanolamide+Treatment+in+a+Mouse+Model+of+Acute+Epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Antiepileptogenic Effect of Subchronic Palmitoylethanolamide Treatment in a Mouse Model of Acute Epilepsy.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, (2018).</li>
<li>Schauwecker, P. E., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+determinants+of+susceptibility+to+excitotoxic+cell+death%3A+Implications+for+gene+targeting+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genetic determinants of susceptibility to excitotoxic cell death: Implications for gene targeting approaches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (8), 4103-4108 (2002).</li>
<li>Monory, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Endocannabinoid+System+Controls+Key+Epileptogenic+Circuits+in+the+Hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Endocannabinoid System Controls Key Epileptogenic Circuits in the Hippocampus.</a> Neuron. 51 (4), 455-466 (2006).</li>
<li>Konsman, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%5BTitle%5D)+AND+%22Psychoneuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">The mouse Brain in Stereotaxic Coordinates.</a> Psychoneuroendocrinology. 28 (6), (2003).</li>
<li>Spijker, S. Dissection of Rondent Brain Regions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpijker%2C+S+%22Neuroproteomics%22">Neuroproteomics</a>. Li, K. W. 57, 13-27 (2011).</li>
<li>Gross, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+lipidomics+through+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+and+Cell+Biology+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">The evolution of lipidomics through space and time.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (8), 731-739 (2017).</li>
<li>Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+advances+in+shotgun+lipidomics+for+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine.</a> Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).</li>
<li>Abbott, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+high-throughput+lipid+extraction+method+for+the+analysis+of+human+brain+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">An improved high-throughput lipid extraction method for the analysis of human brain lipids.</a> Lipids. 48 (3), 307-318 (2013).</li>
<li>Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+extraction+by+methyl-tert-butyl+ether+for+high-throughput+lipidomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics.</a> Journal of Lipid Research. 49 (5), 1137-1146 (2008).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.

המתודולוגיה הנוירוליפידומית והתעתיקית המתוארת כאן היא אמצעי מעשי לחקור כל מחלה או התפתחות בריאה ברזולוציה מרחבית גבוהה ונמוכה במוח ובאיברים היקפיים. בשל דגימת פלזמה אופטימלית וטיפול בהליכים, ניתוח ליפידומי פלזמה יכול להתבצע גם מאותם בעלי חיים שהוקרבו עבור ליפידומיקה רקמות תמלול, ובכך לשפר את האמינות של רקמות דם מולקולרי קורלציה וגילוי סמנים ביולוגיים. מתן קבוצה רחבה של נתונים על ידי יישום של אחד משלושת הפרוטוקולים או שילובים שלהם, הוא בעל ערך לחקור לא רק מחלה נוירולוגית בתוך הקשר (ניסוי מודל בעלי חיים) אלא גם על פני ובין...

ההתפתחויות האחרונות בתפקוד של שומנים ותפקידם בהופעה והתקדמות של מחלות נוירולוגיות לפתוח מקומות מחקר ופיתוח חדשים של מטרות טיפוליות חדשות הבהרה מנגנון המחלה1. הבדלים מתועדים בהרכב השומנים באזורים שונים במוח, המודגשים על ידי טכניקות הדמיה מולקולרית מודרניות כגון הדמיית ספקטרומטריית מסה ופרופיל ספקטרומטריית מסה מתקדם, מסיט את הפרדיגמה של חקירת שומנים בדם מכל המוח לכיוון אזורי מוח שונים ודיסקרטיים מבחינה תפקודית. העובדה כי הרכב השומנים משתנה באזורים שונים במוח מעוררת תפיסה חדשה של רגישות השומנים הממברנה ואת איתות השומנים במורד הזרם בתגובה עלבון מוחי או גירויים על פני אזורי המוח ברור מבחינה תפקודית. לפיכך, פרוטוקולי השומנים דורשים פיתוחים חדשים כדי להתמודד עם האתגר של כמויות רקמות נמוכות עבור זיהוי וכימות ברזולוציה מרחבית גבוהה יותר, ובמקביל, ניתוח של רכיבי שומנים מרובים של קרום התא ומסלולי איתות. כמו כן, קביעת אנזימים, ליגנדים שומנים בדם, וקולטנים המעורבים בוויסות רמות ותפקודם היא בעלת חשיבות עליונה כדי להבהיר את מסלולי האיתות המושפעים במחלה נוירולוגית ולהנחות חקירות מכאניסטיות חדשות בהקשר פתופיזיולוגי.
בנוסף לרזולוציה המרחבית המוגברת במוח, ישנם שני קשיים עיקריים המאתגרים את התפתחותן של גישות נוירוליפידומיות חדשות. ראשית, מולקולות איתות השומנים הם בדרך כלל של שפע נמוך מאוד לעומת שומנים המרכיבים את הממברנה. שנית, השומנים מציגים הטרוגניות מבנית גבוהה, קשה לנתח באמצעות גישה אנליטית אחת. לפיכך, שיטות מיצוי ואנליטיות מותאמות לקטגוריות שומנים שונים ומבוצעות בדרך כלל בדגימות רקמות נפרדות2. שיטות ליפידומיות של רובה ציד3 הם כלים מצוינים לחשוף במהירות פרופיל רחב של שומנים ממברנה, בעוד רגישות מוגברת וסלקטיביות הניתנות על ידי גילוי ממוקד ושיטות ספקטרומטריות מסה כימות הם מהוונים לחקירה של שומנים איתותים בשפע נמוך כולל: i) שומנים דלקתיים ii) שומנים מעורבים אפנון של פעילות עצבית, כגון אנדוקנבינואידים (eCBs), שומנים הקשורים חומצות אמינו, שומנים הקשורים, וכו.4,5. כדי להקיף שינויים בשומנים הן בקרום התא והן ברמת האיתות המתרחשים באזורי המוח של מודלים של מחלות נוירולוגיות, בדרך כלל מיצוי השומנים וניתוח מתבצעים בדגימות רקמות נפרדות, המתקבלות מקבוצות בעלי חיים נפרדות או מחצי הכדור השונים, או על ידי ניתוח אזור רקמה גדול יותר לחתיכות מרובות. כאשר רמות mRNA של קולטני אנזימים הם גם עניין, החקירה שלהם בדרך כלל דורשת רכישה של דגימת רקמה ברורה. לדוגמה, החקירה של שומנים ממברנה, קנבינואידים אנדוגני, ו- mRNA ידרוש שלוש דגימות רקמות שונות, (למשל, שתי דגימות עבור שתי שיטות מיצוי שומנים - שומנים ממברנה ואיתות שומנים - ושתי שיטות ניתוח שומנים לאחר מכן - ודגימה אחת לניתוח mRNA). חקירה של שומנים דלקתיים וקנבינואידים אנדוגני דורשים שתי דגימות רקמות נפרדות, שיטות מיצוי, ושיטות ניתוח, בהתאמה. דוגמה נוספת היא חקירת mRNA ושל כל קטגוריית שומנים בדם בדגימת אגרוף למוח או מיקרודיסקציה לייזר אשר כתוצאה מכך דורש שתי בעלי חיים נפרדים כדי להשיג שתי דגימות לכל המוח (תת)אזור. מידה משמעותית של שונות ו/או רבייה לקויה של התוצאות מתרחשת לעתים קרובות במקרים כאלה, שמקורם שונות ביולוגית ו/או הטרוגניות רקמות. בהנחיית מגבלות מעשיות אלה של ניתוח רב-מולקולרי, המתרחשות במיוחד ברזולוציה מרחבית גבוהה במוח, פרוטוקול נוירוליפידומיקה בן שלושה מודולים תוכנן בהיקף: 1) דו-אופן וניתוח משותף על ידי LC / MRM של שומנים דלקתיים (למשל, איקוסנואידים (eiCs)) ושומנים המעורבים אפנון של פעילות עצבית, כגון eCBs2; 2) חילוץ משותף של פוספוליפידים (PLs) ו- eCBs עם LC / MRM רב-תכליתי עוקב וניתוח סריקת אובדן מבשר / נייטרלי2; ו 3) מיצוי כפול של ממברנה (פוספו)שומנים ו- eCBs, כמו גם mRNA, עם ניתוח LC / MRM ו- qPCR או RNA רצף הבאים6. בהתאם לשאלה הביולוגית שיש לטפל בה במחלה נוירולוגית ובאזור המוח העניין, ניתן ליישם שילוב של הפרוטוקול הראשון והשני, או הפרוטוקול הראשון והשלישי, על אותה דגימת רקמות עבור רקמות במשקל של כ -4 מ"ג. הפרוטוקולים הראשון והשלישי ניתן ליישם באופן עצמאי עבור רקמות סביב 2 מ"ג. הפרוטוקול השני יכול להיות מיושם עבור רקמות במשקל קטן כמו 0.5 מ"ג. ללא קשר למודול הפרוטוקול הנוירוליפידומי שנבחר, דגימת הרקמות ועיבוד טרום אנליטי, בידוד המוח וחיתוך האזור, כמו גם ההליך להקרבת המודל החייתי מתוקננים וזהים לכל שלושת המודולים של הפרוטוקול. בחקירה שלנו של מחלות נוירולוגיות, איברים היקפיים הרלוונטיים לתוצאות הפתולוגיות של המחלה נאספים תמיד גם ונותחים באמצעות פרוטוקולים מודולריים אלה. בנוסף, הדם נדגם באופן קבוע עבור ליפידומיקה פלזמה לשמש ככלי קריאה של מחלות נוירולוגיות עם מבט על יישומים תרגומיים פוטנציאליים. פרוטוקול השומנים המודולריים המוצגים כאן הוא רב-תכליתי מאוד: ניתן לשינוי קנה מידה לכמויות רקמות גדולות יותר וישים בקלות כמעט לכל סוג רקמה ומחלה. ליישום הפרוטוקול המודולרי (איור 1) במחלות נוירולוגיות, כל מודל מכרסמים מתוקנן של התפרצות והתקדמות של הפרעות נוירולוגיות, כגון פגיעה מוחית טראומטית, מחלת פרקינסון, מחלת אלצהיימר או אפילפסיה הם מקובלים.
פרוטוקולים אלה יושמו בהרחבה כדי לחקור שינויים בליפידום הרקמה ו/או transcriptome בשלב החריף של אפילפסיה בחומצה קיינית (KA)-induced מודל העכבר של אפילפסיה2,7, מודל בשימוש נרחב במחקרים פרה-קליניים בשל הדמיון לאפילפסיה האונה הטמפורלית האנושית (TLE)8,9,10,111. באמצעות פרוטוקולים אלה, הפוטנציאל הטיפולי של תרופות כגון Palmitoylethanolamide (PEA)12,13 הוערך באותו מודל עכבר של אפילפסיה. המחקר זיהה שינויים בשומנים וב-mRNA ברזולוציה מרחבית גבוהה ונמוכה במוח ובפריפריה, בנקודת הזמן של עוצמות התקפים חריפות מקסימליות (ב-60 דקות אינדוקציה פוסט-איזיותרת), ובטיפול תת-קרקעי וחריף עם PEA בארבע נקודות זמן שונות (20, 60, 120 ו-180 דקות) לאחר אינדוקציה של התקף KA, חלון זמן המכסה את השלב החריף של אפילפסיה. פלזמה, מוחות ואיברים היקפיים של עכברים לא מטופלים המוזרקים ל-KA, עכברים חריפים ומטופלים בתת-גולגולת PEA, כמו גם עכברי בקרה לרכב ו-PEA-Vehicle, נאספו בכל נקודת זמן 12,13, ונחקרו בניתוח מולקולרי זה. הנתונים המולקולריים היו בקורלציה עם פנוטיפים התנהגותיים שהושגו על ידי ניקוד התקפים, כמו גם עם נתונים שמקורם אימונוהיסטוכימיה על תהליכים ניווניות, על מנת לפענח את ההתקדמות של שלב האפילפסיה החריפה ואת הפוטנציאל של PEA להקל עליו.

<table><tbody><tr><td>12(S)-HETE</td><td>Biomol</td><td>Cay10007248-25</td><td>ליפיד Std</td></tr><tr><td>12(S)-HETE-d8</td><td>Biomol</td><td>Cay334570-25</td><td>ליפיד Std</td></tr><tr><td>1200 סדרת LC מערכת</td><td>Agilent</td><td></td><td>Instrumentation/LCMS</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td>Instrumentation/qPCR</td></tr><tr><td>5(S)-HETE-d8</td><td>Biomol</td><td>Cay 334230</td><td>Lipid Std</td></tr><tr><td>ABI 7300 מחזורי PCR בזמן אמת</td> מכשור <td>ביו-סיסטמס</td><td></td> יישומי <td>/ qPCR</td></tr><tr><td>אצטוניטריל LC-MS Chroma Solv</td><td>Honeywell</td><td>9814920</td><td>ממס / צינורות</td></tr><tr><td>אפנדורף ענבר ענבר</td><td>Eppendorf Eppendorf</td><td></td><td>Sample Prep.</td></tr><tr><td>אנליסט 1.6.2 תוכנה</td><td>AB SCIEX, דרמשטדט</td><td></td><td>תוכנה</td></tr><tr><td>איזון אנליטי</td><td>מטלר טולדו</td><td></td><td>מכשור/הכנה לדוגמא.</td></tr><tr><td>Arachidonic Acid-d8 MS Standard</td><td>Biomol</td><td>Cay-10007277</td><td>Lipid Std</td></tr><tr><td>Bessmann Tissue Pulverizer</td><td>Spectrum Laboratories, Inc. (ברדה, הולנד)</td><td></td><td>מכשור/הכנת דגימה.</td></tr><tr><td>Bino</td><td>Zeiss</td><td></td><td>מיקרוסקופיה</td></tr><tr><td>שסועה Caspase 3 נוגדן</td><td>Cellsignaling</td><td>9661S</td><td>מיקרוסקופיה</td></tr><tr><td>קריוסטט, Leica CM3050 S</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>מכשור/הכנת דגימה.</td></tr><tr><td>CTC HTC PAL דגימה אוטומטית</td><td>CTC Analytics AG</td><td></td><td>מכשור/LCMS</td></tr><tr><td>דומונט מלקחיים מעוקלים דומוקסל #7</td><td>FST</td><td>11271-30</td><td>כלים כירורגיים</td></tr><tr><td>מלקחיים דומונט קצה סופר עדין #5SF (x2)</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td>כלים כירורגיים</td></tr><tr><td>EDTA 1000 A R&ouml; hrchen</td><td>Kabe Labortechnik</td><td>078001</td><td>הכנה לדוגמא.</td></tr><tr><td>EP-1 EconoPump</td><td>BioRAD</td><td>700BR07757</td><td>מכשור/הכנת דגימה.</td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים מראה גימור</td><td>FST</td><td>11412-11</td><td>כלים כירורגיים</td></tr><tr><td>מספריים עדינים איריס ישר חד</td><td>FST</td><td>14094-11</td><td>כלים כירורגיים</td></tr> מספריים <tr><td>עדינים טונגסטן קרביד ישר</td><td>FST</td><td>14568-09</td><td>כלים כירורגיים</td></tr><tr><td>איריס מרית</td><td>FST</td><td>10094-13</td><td>כלים כירורגיים</td></tr><tr><td>חומצה קאינית</td><td>Abcam</td><td>ab120100</td><td>תרופה אפילפטית</td></tr><tr><td>תוכנת תצוגת ליפידים</td><td>AB SCIEX, תוכנת דרמשטדט</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LPC 17:0</td><td>Avanis Polaris</td><td>855676P</td><td>ליפיד Std</td></tr><tr><td>LPC 18:0</td><td>Avanis Polaris</td><td>855775P</td><td>ליפיד Std</td></tr><tr><td>Luna 2,5&micro; m C18(2)- HAST 100A LC עמודה</td><td>Phenomenex</td><td>00D-4446-B0</td><td>מכשור/</td></tr><tr><td>מנורת מגדלת</td> LCMS <td>Maul GmbH</td><td></td><td>מכשור/הכנת דגימה.</td></tr><tr><td>מתנול LC-MS Chroma Solv 99.9%</td> <td>Honeywell</td><td>9814920</td><td>ממס/LCMS</td></tr><tr><td>מוטיק קמארה</td><td>מיקרוסקופיה</td><td>מוטית</td><td></td></tr><tr><td>MTBE</td><td>Honeywell</td><td>34875-1L</td><td>ממס/LCMS</td></tr><tr><td>MultiQuant 3.0 חבילת תוכנה לכימות</td><td>AB SCIEX, Darmstadt</td><td></td><td>Software</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c ספקטרופוטומטר</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>מכשור/qPCR</td></tr><tr><td>PA 16:0-18:1</td><td>Avanis Polaris</td><td>840857P</td><td>Lipid Std</td></tr><tr><td>PA 17:0-14:1</td><td>Avanis Polaris</td><td>LM-1404</td><td>Lipid Std</td></tr><tr><td>Palmitoyl Ethanolamide</td><td>Biomol</td><td>Cay90350-100</td><td>Lipid Std</td></tr><tr><td>Palmitoyl Ethanolamide-d5</td><td>Biomol</td><td>Cay9000573-5</td><td>Lipid Std</td></tr><tr><td>PC 16:0-18:1</td><td>Avanis Polaris</td><td>850457P</td><td>ליפידים מתוקננים</td></tr><tr><td>PC 16:0-18:1</td><td>Avanis Polaris</td><td>850457P</td><td>Lipid Std</td></tr><tr><td>PC 17:0-14:1</td><td>Avanis Polaris</td><td>LM-1004</td><td>Lipid Std</td></tr><tr><td>PE 16:0-18:1</td><td>Avanis Polaris</td><td>850757P</td><td>Lipid Std</td></tr><tr><td>PE 17:0-14:1</td><td>Avanis Polaris</td><td>LM-1104</td><td>Lipid Std</td></tr><tr><td>PG 16:0-18:1</td><td>Avanis Polaris</td><td>840457P</td><td>Lipid Std</td></tr><tr><td>PG 17:0-14:1</td><td>Avanis Polaris</td><td>LM-1204</td><td>Lipid Std</td></tr><tr><td>PI 17:0-14:1</td><td>Avanis Polaris</td><td>LM-1504</td><td>Lipid Std</td></tr><tr><td>Precelleys 24</td><td>מכשור</td><td></td><td>/הכנת דגימה.</td></tr><tr><td>Precellys Keramik-K&uuml; gelchen</td><td>Peqlab</td><td>91-pcs-ck14p</td><td>הכנת מדגם.</td></tr><tr><td>Precellys Stahlkugeln 2,8 מ"מ</td><td>Peqlab</td><td>91-PCS-MK28P</td><td>הכנת מדגם.</td></tr><tr><td>Precellys-keramik-kit 1,4 מ"מ</td><td>VWR</td><td>91-PCS-CK14</td><td>הכנה לדוגמא.</td></tr><tr><td>פרוסטגלנדין D2</td><td>ביומול</td><td>קיי 12010</td><td>ליפיד מתוקנן</td></tr><tr><td>פרוסטגלנדין D2-d4</td><td>ביומול</td><td>קיי 312010</td><td>ליפיד מתוקנן</td></tr><tr><td>פרוסטגלנדין E2</td><td>ביומול</td><td>קיי10007211-1</td><td>ליפיד מתוקנן</td></tr><tr><td>פרוסטגלנדין E2-d9</td><td>ביומול</td><td>Cay10581-50</td><td>ליפיד מתוקנן</td></tr><tr><td>PS 17:0-14:1</td><td>Avanis Polaris</td><td>LM-1304</td><td>ליפיד Std</td></tr><tr><td>Q מלכודת 5500 מלכודת יונים ליניארית משולשת-מרובעת MS</td><td>AB SCIEX</td><td></td><td>AU111609004 מכשור/LCMS</td></tr><tr><td>מערכת PCR בזמן אמת</td><td>Appliert Biosystem</td><td></td><td>Instrumentation/qPCR</td></tr><tr><td>Resolvin D1</td><td>Biomol</td><td>Cay10012554-11</td><td>Lipid Std</td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit - סט DNase ללא RNAase (50)</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>הכנת מדגם.</td></tr><tr><td>מאבטח precolumn</td><td>Phenomenex</td><td></td><td>מכשור / LCMS</td></tr><tr><td>Shandon לוחות כיסוי</td><td>תרמו פישר</td><td></td><td>72110017 מיקרוסקופיה</td></tr><tr><td>מתלה שקופיות שנדון ומכסה</td><td>תרמו פישר</td><td></td><td>73310017 מיקרוסקופיה</td></tr><tr><td>SM 18:0</td><td>Avanis Polaris</td><td>860586P</td><td>ליפיד Std</td></tr><tr><td>SM d18:1/12:0</td><td>Avanis Polaris</td><td>LM-2312</td><td>Lipid Std</td></tr><tr><td>מלקחיים סטנדרטיים ישרים חלקים</td><td>FST</td><td>11016-17</td><td>כלים כירורגיים</td></tr> מספריים <tr><td>כירורגיים ToughCut דפוס סטנדרטי</td><td>FST</td><td>14130-17</td><td>כלים כירורגיים</td></tr><tr><td>T3000 מכשור</td><td>ביומטרי</td><td></td> תרמוציקלר <td>/ qPCR</td></tr><tr><td>תרומבוקסן B2</td><td>ביומול</td><td>Cay19030-5</td><td>ליפיד Std</td></tr><tr><td>תרומבוקסן B2-d4</td><td>ביומול</td><td>Cay319030-25</td><td>ליפידים מתוקננים</td></tr><tr><td>לייזר רקמות II</td><td>Qiagen / Retsch</td><td>12120240804</td><td>מכשור / הכנת דגימה.</td></tr><tr><td>Tissue Tek</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td>מיקרוסקופיה</td></tr><tr><td>Toluidinblau</td><td>Roth</td><td>0300.2</td><td>מיקרוסקופיה</td></tr><tr><td>Vapotherm</td><td>Barkey</td><td>4004734</td><td>מכשור/הכנת דגימה.</td></tr><tr><td>Wasser LC-MS Chroma Solv</td><td>VWR</td><td>9814920</td><td>ממס/LCMS</td></tr></tbody></table>

ליפידומיקה ותעתיק במחלות נוירולוגיות

Lipidomics and Transcriptomics in Neurological Diseases

שומנים משמשים כממשק העיקרי לעלבונות מוחיים או לגירויים התורמים למחלות נוירולוגיות והם מאגר לסינתזה של שומנים עם איתותים שונים או תפקוד ליגנד שיכולים להדגיש את הופעתן והתקדמותן של מחלות. לעתים קרובות משתנה ברמה הקדם-סימפטומטית, שומנים הם מקור מתעורר של מטרות סמים וסמנים ביולוגיים. מחלות נוירולוגיות רבות להפגין neuroinflammation, ניוון עצבי, עירור עצבי, כמו סימני היכר נפוצים, בחלקו מווסת על ידי מערכות איתות שומנים ספציפיים. התלות ההדדית והיחסים ההדדיים של סינתזה של שומנים שונים מעוררים ניתוח רב-ליפידי, רב-ליפידי ורב-תפיסתי על מנת להפיק את המשותף והייחודיות של ההקשרים הנוירולוגיים ולזרז את פירוק ההיבטים המכניים של התפתחות המחלה והתקדמותה. רישום תפקידי השומנים לאזורים שונים במוח מקדם את הקביעה של פנוטיפ מולקולרי שומנים בדם ומורפולוגיה הקשורים למחלה נוירולוגית.
מוצג כאן הוא פרוטוקול מודולרי המתאים לניתוח של שומנים ממברנה אותות שומנים במורד הזרם יחד עם mRNA של אנזימים ומתווכים שבבסיס הפונקציונליות שלהם, המופק מאזורי מוח נפרדים הרלוונטיים למחלה נוירולוגית מסוימת ו /או מצב. כדי להבטיח פרופיל ליפידומי השוואתי מדויק, זרימות העבודה וקריטריוני ההפעלה היו ממוטבים ומתוקננים עבור: i) דגימת מוח וחיתוך של אזורי עניין, ii) מיצוי משותף של אותות שומנים מרובים ושומנים ממברנה, iii) מיצוי שומנים כפול / mRNA, iv) כימות על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ניטור תגובה מרובה (LC / MRM), ו v) פרופיל mRNA סטנדרטי. זרימת עבודה זו מקובלת על כמויות הרקמות הנמוכות המתקבלות על ידי דגימה של תתי-הקטגוריות המוחיות הנפרדות מבחינה תפקודית (כלומר על ידי אגרוף מוחי), ובכך מונעת הטיה בניתוח רב-מולקולרי עקב הטרוגניות של רקמות ו/או שונות מן החי. כדי לחשוף את ההשלכות ההיקפיות של מחלות נוירולוגיות ולהקים קריאות מולקולריות תרגומיות של מצבי מחלות נוירולוגיות, דגימת איברים היקפיים, עיבוד, וניתוח ליפידומי לאחר מכן, כמו גם ליפידומיקה פלזמה, הם גם נרדפים ומתוארים. הפרוטוקול מוצג על מודל עכבר אפילפסיה חריפה.

ניתן לשלב את מערכת הפרוטוקולים המתוארים ברמות שונות באופן ספציפי למטרה, כגון בחירת מודל בעלי חיים, מסלול דגימה, שיטת מיצוי ופרופיל (איור 1).
על מנת לקבוע שינויים ברמת השומנים במוח ובפריפריה לאורך זמן של מצב התקף אפילפטי חריף ולפענח את ההשפעה האנטי-אפילפטית הפוטנציאלית13 של PEA והשפעתה על שינויים בליפידום במוח ובפריפריה, שלוש קבוצות בעלי חיים ניסיוניות טופלו ברכב, KA כדי לגרום...

מאמר זה מציג פרוטוקול מודולרי עבור ליפידומיקה של רקמות ותעתיק, ושומנים פלזמה במודלים עכבר מחלה נוירולוגית מיקוד שומנים המשמשים דלקת ופעילות עצבית, שומנים ממברנה, שליחים במורד הזרם, ואנזימים קידוד mRNA/קולטנים שבבסיס תפקוד השומנים. הליכי דגימה, עיבוד מדגם, מיצוי וכימות מפורטים.

Lipids serve as the primary interface to brain insults or stimuli conducive to neurological diseases and are a reservoir for the synthesis of lipids with ...

פרוטוקול מודולרי זה מאפשר לחקור אירועים מולקולריים מרובים שניתנו על ידי שומנים מבניים ומאותתים, ו/או RNAs, באזורי רקמות דיסקרטיים ובדם עם תפוקת נתונים כמותית ואיכותית משופרת לכל דגימה מדגם. השיטה חלה על כל מודל ניסיוני, והיא יכולה להיות מיושמת גם על דגימות רקמות אנושיות ודם. מי שידגימו את ההליך יהיו קלאודיה שוויטר, טכנאית, ג'וליה פוסט, סטודנטית לתואר שני, וראיסה לרנר, פוסט-דוקטורנטית בקבוצה שלי.כדי להתחיל, לקחת בעבר מבודד, שלם, מוחות קפואים של עכברים עם אפילפסיה חריפה ומטופלת באופן מניעתי חומצה קיינית הנגרמת. הר את המוחות על מערכת ההרכבה של הקריוסטט. הגדר את העובי ל-50 מיקרומטר וחתוך את המוח במצב חיתוך קרוב לאזור העניין.כאשר מתקרבים לאזור העניין, להגדיר את העובי ל 18 עד 20 מיקרומטרים. כדי להתאים את תת-הערך של עניין, להכתים את פרוסות המוח באמצעות טולואידין כחול. השתמש במיקרוסקופ כדי לבדוק את הפרוסות המוכתמות כדי לזהות את אזורי העניין שיש להכות, ולהשתמש אטלס עכבר כהפניה כדי למצוא את האזורים האנטומיים המתאימים במוח.השתמש corers מדגם לקחת אגרופים בקוטר 0.8 עד 1.0 מילימטר. העבר את האגרופים עבור אנדוקנבינואידים ו eicosanoids coextractions לתוך צינורות ענבר 2 מיליליטר מקורר מראש עם שבעה כדורי פלדה מקורר מראש לכל צינור. עבור פוספוליפידים אנדוקנבינואידים דו-קוטביים, חילוץ משותף של שומנים כפולים ו-RNA, מעבירים את האגרופים ל-2 מיליליטר צינורות חילוץ ללא RNase עם חרוזי קרמיקה.לשקול אגרופים קפואים בחדר הקר ומיד להמשיך עם החילוץ או להקפיא ב 80 מעלות צלזיוס. כדי לבצע דו-שיח שומני נוזלי נוזלי של אנדוקנבינואידים ואיקוסנואידים מחתיכות מוח, אגרופים, או דגימות אבקת רקמות, למקם את צינורות החילוץ המכילים את דגימות הרקמות ושבעה כדורי פלדה על קרח. הוסיפו 600 מיקרוליטרים של MTBE קר כקרח ו-50 מיקרוליטרים של מי אצטוניטריל המכילים את הסטנדרטים הפנימיים.לאחר הוספת 400 מיקרוליטרים של חומצה פורמית טוחנת 0.1, השתמש בליזר רקמות להומוגניזציה למשך 30 שניות עד דקה אחת. צנטריפוגה הומוגנית זה במשך 15 דקות ב 5, 000 פעמים g ב 4 מעלות צלזיוס. מניחים אותו במקפיא במשך 10 דקות ב 80 מעלות צלזיוס כדי להקפיא את השלב התחתון מימית, אשר יקל על העברת השלב האורגני העליון.מעבירים את השלב האורגני העליון לצינורות ענבר חדשים של 1.5 מיליליטר, מתאדים תחת זרם עדין של חנקן בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולאחר מכן משחזרים ב-50 מיקרוליטרים של מי אצטוניטר לניתוח נוסף. יש לאחסן את השלב המימי בטמפרטורה של 20 או 80 מעלות צלזיוס לניתוח נוסף של תכולת החלבון. כדי להקדים אנדוקנבינואידים ואיקוסנואידים מדגימות פלזמה, הניחו את דגימות הפלזמה הקפואות על הקרח ותנו להם להפשיר לחלוטין.הוסף 800 מיקרוליטרים של MTBE ו -50 מיקרוליטרים של מי אצטוניטריל המכילים את הסטנדרטים הפנימיים הממוטבים לעלייה באמצעות דגימות פלזמה ייחוס. מוסיפים 600 מיקרוליטרים של 0.1 חומצה פורמית טוחנת ומערבולת ב 4 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות. צנטריפוגה הדגימות ב 4, 000 פעמים g במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.מעבירים את השלב האורגני לצינורות חדשים. התאדו אותו תחת זרם עדין של חנקן ב 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לשפץ אותו עם 50 מיקרוליטרים של מי אצטוניטריל לניתוח ניטור תגובה מרובה כרומטוגרפיה נוזלית. כדי לבצע דו-שיח של פוספוליפידים ואנדוקנאבינואידים מאזורי המוח, אגרופים או דגימות אבקת רקמות אחרות, הנח את צינורות החילוץ המכילים את דגימות הרקמות וחרוזי הקרמיקה על הקרח.הוסיפו 800 מיקרוליטרים של מתיל טרט-בוטיל אתר ותערובת מתנול ו-10 מיקרוליטרים של מתנול המכילים את הסטנדרטים הפנימיים. לאחר מכן, להוסיף 200 microliters של 0.1% חומצה פורמית המכילה 25 טטרהידרפוליפסטטין מיקרומולרי / URB597 ו 50 מיקרוגרם למיליליטר של BHT. לאחר הומוגניזציה עם homogenizer רקמה, צנטריפוגה ב 5, 000 פעמים g ו 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.להעביר את השלב האורגני העליון לתוך צינורות חדשים, להתאדות תחת זרם עדין של חנקן ב 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לשחזר את תמצית השומנים עם 90 מיקרוליטרים של מתנול. אם תמשיך מיד, להוסיף 10% מים aliquot של תמצית השומנים ולהזריק 10 microliters ב LC / MS לניתוח פוספוליפידים. לניתוח אנדוקנבינואידים נוספים, המשיכו בשלב הבא.קח aliquot של תמצית השומנים, להתאדות ליובש, ו reconsacteute במים אצטוניטרילים. כדי לבצע מיצוי כפול של RNA ושומנים ודו-שיח של פוספוליפידים ואנדוקנאבינואידים מדגימות רקמות, להפשיר aliquots אבקת רקמה או צרורות המוח ב 4 מעלות צלזיוס. הוסף את הרקמה לצינורות מיצוי עם חרוזי קרמיקה.לאחר מכן הוסיפו 600 מיקרוליטרים של מאגר RLT יחד עם 200 מיקרוליטרים של כלורופורם. עבור פוספוליפיד ו אנדוקנבינואיד דו-שיח, דגימות ספייק עם 10 מיקרוליטרים של תערובת סטנדרטית פנימית הומוגניזציה במהירות גבוהה במשך 20 שניות. העבר דגימות הומוגניות לצינורות צנטריפוגות וצנטריפוגות חדשות במשך חמש דקות במלוא המהירות ו -4 מעלות צלזיוס כדי לאפשר את הפרדת הפאזה.העבר את השלב העליון לצינור טרי להפקת RNA באמצעות ערכה סטנדרטית. Elute חילץ RNA בנפח כולל של 50 מיקרוליטרים של מים ללא RNase ולאחסן אותו ב 80 מעלות צלזיוס. עבור מיצוי שומנים בדם, להוסיף 800 מיקרוליטרים של MTBE / מתנול ו 200 מיקרוליטרים של 0.1% חומצה פורמית לשלב המכיל כלורופורם התחתון.מערבולת במשך 45 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. מעבירים את השלב האורגני העליון לצינור חדש. להתאדות אותו תחת זרם עדין של חנקן ב 37 מעלות צלזיוס.לניתוח נוסף של LC/MS, שחזרו את המדגם ב-90 מיקרוליטרים של מתנול ואחסנו אותה ב-20 או 80 מעלות צלזיוס, או המשיכו מיד לניתוח. לניתוח אנדוקנבינואידים נוספים, המשיכו בשלב הבא. קח aliquot של תמצית השומנים, להתאדות ליובש, ו reconsacteute במים אצטוניטרילים.לאחר מכן, להזריק 20 microliters ב LC / MS לניתוח אנדוקנבינואידים. אינדוקציה חומצה קיינית של התקפים אפילפטיים חריפים הובילה לעוצמת התקף מקסימלית שעה אחת לאחר ההזרקה. פרופיל ליפידומי של אנדוקנבינואידים ואיקוסנואידים, כמו גם פוספוליפידים ואנדוקנאבינואידים, מראה שינויים ברמת השומנים על פני קליפת המוח, סטריאטום, אזור תלמי, היפוקמפוס, היפותלמוס, מוח קטן, כמו גם רקמת לב וריאה בעכברים ובקרות אפילפטיים הנגרמים על ידי חומצה קיינית.לאחר מיצוי כפול של פוספוליפידים ואנדוקנאבינואידים ורנ"א עבור פרופיל כמותי של אגרופי מוח עכבר, ההתפלגות הכמותית של שומנים בהיפותלמוס, אמיגדלה בזולטרית, וההיפוקמפוס הגחוני והגב נותח. רמות ביטוי יחסיות של אנזימים אנדוגניים וקולטנים המעורבים איתות שומנים בדם, כמו גם סמנים לפעילות המוח נחקר ברמת mRNA באזורים שונים במוח subregions מעכברים נתון התקף אפילפטי הנגרמת חומצה קיינית ובקרות. אפילפסיה הנגרמת על ידי חומצה קיינית גרמה לאובדן מסיבי של אות NeuN, בעיקר באזור CA1, CA3 והילוס של ההיפוקמפוס, מלווה באירועים אפופטוטיים המצוינים על ידי אות כספית-3 בהשוואה לעכברים המוזרקים מלוחים לבקרה.לאחר טיפול עם palmitoylethanolamide subchronic, אות חלבון גרעינים עצביים נשמר באופן ניכר אות CASP3 בקושי ניתן היה לגילוי. ניקוב מוחי וחיתוך של אזורי מוח דיסקרטיים הם מאתגרים למדי ודורשים מיומנויות עדינות כדי להשיג דגימה עקבית על פני קבוצות מרובות. לכן, תרגול על איברי בדיקה וידע טוב של מורפולוגיה במוח מומלץ מאוד.

lipidomics-and-transcriptomics-in-neurological-diseases

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

Microglia תושב מקרופאגים הם המספקים את השורה הראשונה של מעקב ההגנה החיסונית של מערכת העצבים המרכזית. מיקרו RNA הם מולקולות רגולטוריות כי לשחק תפקיד חשוב בתהליכים פיזיולוגיים רבים, כולל הפעלת והבחנה של מקרופאגים. במאמר זה נתאר את שיטת המדידה של מיקרו RNA ב microglia.

זיהוי של מיקרו RNA ב microglia על ידי Real-time PCR ב CNS רגיל ובמהלך Neuroinflammation

אנו מתארים כאן את ההליכים למיצוי והטיהור של mRNA ומטבוליטים...

טיהור של תמלילים ומטבוליטים מ<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ראשים

RNA כולל באיכות גבוהה הוכן מגופי תאים של נוירונים מוטוריים של חוט השדרה של העכבר על ידי לכידת לייזר microdissection לאחר הכתמת מקטעי חוט השדרה עם תכלת B ב 70% אתנול. מספיק RNA (~ 40-60 ng) הוא התאושש מ 3,000-4,000 נוירונים מוטוריים כדי לאפשר ניתוח RNA במורד הזרם על ידי RNA-seq ו qRT-PCR.

ייצור RNA לניתוח תעתיקי מגופי תאי נוירון מוטוריים של חוט השדרה של העכבר על ידי לכידת לייזר Microdissection

פרוטוקול זה ממחיש שינויים מהותיים בחלוקת polyribosome כדי ללמוד translatome של in vivo דגימות במערכת העצבים המרכזית. זה מאפשר הערכה הגלובלית של רגולציה תרגום ותעתיק דרך הבידוד והשוואה של רנ"א הכל לריבוזום שברי RNA מאוגד.

בחקירתו vivo של Translatome מערכת עצבים המרכזי על ידי Polyribosome היפוך חלוק

אנו מתארים תפוקה גבוהה, רב מפלסים, ואת הנוזל השדרתי proteomic ממוקד (CSF) assay שפותחה עם פוטנציאל תרגום קליני. הבדיקה יכולה לכמת סמנים פוטנציאל וגורמי סיכון עבור ניווניות של מערכת העצבים, כגון גרסאות E אפוליפופרוטאין (E2, E3 ו E4), ולמדוד ביטוי אללים שלהם.

תפוקה גבוהה, Multiplexed וממוקדת proteomic CSF Assay לכמת Biomarkers ניווניות ו אפוליפופרוטאין E isoforms סטטוס

הפרוטוקול נועד להציג את השימוש בספקטרומטר מסה מרובע משולש לניטור תגובה מרובה (MRM) של חלבונים מדגימות קליניות. סיפקנו זרימת עבודה שיטתית החל מהכנת מדגם לניתוח נתונים עבור דגימות קליניות עם כל אמצעי הזהירות הדרושים שיש לנקוט.

זרימת עבודה של פרוטאומיה כמותית באמצעות זיהוי מבוסס ניטור תגובה מרובה של חלבונים מרקמת המוח האנושית

מטרת פרוטוקול זה היא לספק הדרכה מפורטת על הכנת דגימה נכונה לניתוח שומנים ומטבוליטים ברקמות קטנות, כגון מוח דרוזופילה , באמצעות הדמיית ספקטרומטריית מסות בסיוע מטריצה.

הכנת דגימה לניתוח שומנים מהיר במוח דרוזופילה באמצעות הדמיית ספקטרומטריית מסה של ספיחה/יינון בלייזר בסיוע מטריצה

DeepOmicsAE היא זרימת עבודה המתמקדת ביישום שיטת למידה עמוקה (כלומר, מקודד אוטומטי) כדי להפחית את המימדיות של נתוני multi-omics, מתן בסיס למודלים חיזוי ומודולי איתות המייצגים שכבות מרובות של נתוני omics.

DeepOmicsAE: ייצוג מודולי איתות במחלת אלצהיימר עם ניתוח למידה עמוקה של פרוטאומיקה, מטבולומיקה ונתונים קליניים

מחקר זה ניתח תעתיקי גרעינים בודדים של שלושים ושלושה אנשים עם מחלת אלצהיימר (AD), וחשף DEGs ספציפיים למין בתאי גלייה. ניתוח העשרה תפקודית הדגיש מסלולים סינפטיים, עצביים והורמונליים. זוהו גנים מרכזיים, כלומר NLGN4Y והרגולטורים שלו, והוצעו מועמדים טיפוליים פוטנציאליים לאלצהיימר ספציפי למגדר.

זיהוי סמן ביולוגי לספציפיות מגדרית של מחלת אלצהיימר בהתבסס על פרופילי שעתוק גליה

כאן, אנו מקימים פרוטוקול המשתמש בכמויות מינימליות של מקטעי רקמת מוח קפואים טריים ושיטת צנטריפוגה נגישה במהירות גבוהה יחד עם כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל כדי להשיג שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות כמקורות לסמנים ביולוגיים של מיקרו-RNA (miRNA) להפרעות נוירולוגיות.

רתימת כוחם של מטעני מיקרו-רנ"א בשלפוחיות חוץ-תאיות קטנות המשתחררות מחלקי מוח אנושיים קפואים טריים 

למד פרוטוקול מודולרי לליפידומיקה ותעתיק של רקמות ופלזמה במודלים של מחלות נוירולוגיות בעכברים. השיטה מאפשרת ניתוח בו-זמני של ליפידים ו-RNA באיכות גבוהה.

ליפידומיקה ותעתיק במחלות נוירולוגיות

גלה סרטונים נוספים