שיטת בימוי עצמי סטטי ליצירת אורגנואידים המוח מתאי גזע האדם העובריים

פרוטוקול זה נוצר כאמצעי לייצר אורגנואידים המוח באופן פשוט, עלות נמוכה ללא גורמי צמיחה אקסוגני או מטריקס קרום המרתף תוך שמירה על מגוון של סוגי תאי המוח ותכונות רבות של ארגון הסלולר.

אורגנואידים במוח האנושי הם כלי משמעותי לחקר מחלות במערכת כי הוא מניפולציה בקלות ומשלב הגדרה אנושית ואת האינטראקציה המתאימה של סוגי תאים מרובים. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי לחקור מחלות רבות של המוח, כולל הפרעות נוירו-התפתחותיות, עלבונות רעילים, ואת הצמיחה והטיפול בסרטן במוח. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא היכולת ליצור אורגנואידים במוח לשחזור מאוד עם מגוון רחב של סוגי תאים עצביים.

פעולה זו נעשית באמצעות זרימת עבודה פשטנית מאוד שיכולה להתבצע על ידי רוב המעבדות. ואלה מיוצרים באופן זמני מתאים ללא השפעה מגורמי גדילה מיוחדים או מטריסות לא מוגדרות מה שהופך אותו למערכת פשוטה מאוד וחסכונית. כדי להתחיל, לשלב 100 microliters של מטריצה עם 5.9 מיליליטר של קר קרח של Dulbecco של נשר בינוני או F12 מדיה בצינור חרוט 15 מיליליטר.

מצפים כל באר בצלחת של שש בארות עם מיליליטר אחד של מטריצת הממברנה. עוטפים את הצלחת בסרט פרפין ומאחסנים לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, שאפו מדיה עודפת מכל באר, שטפו את הבארות עם F12, והוסיפו H9 hESCS בנפח כולל של שני מיליליטר של מדיית mTeSR1 ל הבאר.

תרבו את התאים משבוע לשבוע. אספקה יומית עם שני מיליליטר של מדיה mTeSR1 ולהצבת הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס חממת חמצן נמוכה עם 5%חמצן ו 5% פחמן דו חמצני. השתמש בכלי זכוכית כדי להפוך את התאים המשלמים מן התרבות בין קטעים.

רענן את המדיה מדי יום. תאים יש לעבור ארבעה עד שישה ימים לפני ניצול תאי H9 לייצור אורגנואידים. כדי לעבור את התאים, להתחיל על ידי שטיפה אותם עם מדיה DMEM F12 ושאיפת הנוזל העודף.

לאחר שטיפה, מוסיפים פתרון פרוטאז ו דגירה את התאים במשך 40 דקות על מנת מושבות לצוף בתוך הבאר. לאחר מכן, לשטוף את התאים שלוש פעמים באמצעות DMEM F12 ואם יש צורך titrate כדי להפוך את החלקים קטנים יותר. לאחר מכן להפיץ את התאים ביחס משוער של 1 עד 8 על פני ארבע צלחות שש בארות ולמקם את הצלחות באינקובטור ולהאכיל מדי יום.

לאחר ארבעה עד שישה ימים, התאים מגיעים לכ-80%. להעביר אותם לאנקובטור רגיל. לדלל את פתרון מלאי פרוטאז לריכוז עובד על ידי הוספת מיליליטר אחד של פתרון המלאי לחמישה מיליליטר של DMEM או F12 בינוני לכל צלחת שש באר של hESCS.

שאף והסר את המדיה של תרבות התאים, ולאחר מכן לכסות את hESCS עם פתרון פרוטאז. מניחים את הצלחות באינקובטור במשך 10 עד 15 דקות או עד שקצוות המושבות מתעגלים ומתחילים להיפרד מהמטריצה אך לפני שהם מתעגלים לחלוטין. להטות את הצלחת, שאפו את פתרון הפרוטאז, ושטפו בעדינות את התאים עם שני מיליליטר של DMEM או F12 עבור כל באר שלוש פעמים.

תוודא שהמושבות נשארות מחוברות למטריצה. אז זה קריטי כי חתיכות של תאי ES נמצאים בגודל המתאים כדי לוודא שהם dispase עבור כמות הזמן המתאימה. אם הם שם לזמן קצר מדי, זה יכול להיות מאוד קשה לשטוף אותם ולשבור אותם לגזרים.

ואם הם שם יותר מדי זמן, הם יכולים פשוט לרדת במהלך מדרגות הכביסה. הוסף בחזרה על אחד עד 1.5 מיליליטר של מדיה mTeSR טרי לכל באר לשטוף את התאים מהצלחת לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר באמצעות צינורות עדינים. שאפו ופונו hESCS בתוך הצלחת עד שהם מגיעים כ 1/30th של גודלם המקורי.

עכשיו צבירי המושבה דומים ל-250 עד 350 חתיכות בגודל מיקרומטר. העבר את התאים לבקבוק T75 יחיד עם קובץ מצורף נמוך במיוחד המכיל 30 מיליליטר של מדיית mTeSR ללא bFGF. למחרת, להטות את הבקבוק כך תאים חיים בריכה בפינה.

אם יש מספר גדול של תאים שדבקו בתחתית הבקבוק, השתמש בפיפיטה של 10 מיליליטר כדי להעביר את התאים לבקבוקון חדש. צפו לאוכלוסייה גבוהה של תאים מתים בימים הראשונים. לאחר התאים להתיישב, שאפו את התקשורת ותאים מתים עוזב על 10 מיליליטר של מדיה המכילה את התאים החיים ולהוסיף 20 מיליליטר של מדיה bFGF נמוך בתוספת 30 ננוגרם למיליליטר של bFGF.

אחרי יומיים, תבדקו את התאים. רוב התאים צריכים להיראות בריאים ובהירים. עם זאת, אם יותר משליש מהתאים נראים כהים, להטות את הבקבוק ולהחליף 20 מיליליטר של מדיה עם 20 מיליליטר של מדיה bFGF נמוך בתוספת 20 ננוגרם למיליליטר של bFGF.

ביום השלישי, להסיר מחצית המדיה ולהחליף עם 15 מיליליטר של מדיה hESC בתוספת 10 ננוגרם למיליליטר של bFGF. ביום החמישי, החלף מחצית מהתקשורת ב-15 מיליליטר של תקשורת אינדוקציה עצבית. לאחר מכן, כל יומיים, החלף חצי מהמדיום במדיה אינדוקציה עצבית.

לאחר שלושה שבועות בתרבות, להוסיף 100X פניצילין-סטרפטומיצין לתקשורת בריכוז סופי של 1X אם תרצה. רענן חצי מהמדיה כל יומיים. בפרוטוקול זה, האורגנואידים במוח שנוצרו נראו בהירים ודומים בגודלם ללא תאים גוססים כהים במרכזי אשכולות אלה.

התאים נאנקו בהדרגה מ- bFGF. ביום החמישי, הם הוכנסו לתקשורת אינדוקציה עצבית והם נשארו בתקשורת זו לאורך כל תקופת התרבות. למרות האורגנואידים גדל ובכך כהה יותר לאורך זמן, מבנים דמויי רוזט עצבי התרחב אשר מציין את החניכה של הבחנה עצבית ומכיל תכונות של הצינור העצבי העוברי.

כדי להעיף מבט מעמיק יותר על ביטוי הגן בתוך התאים, בוצע ניתוח qPCR. טרנספורטר גלוטמט VLGUT1 בא לידי ביטוי בשבועיים וחצי, גדל בחמישה שבועות, ונשאר עקבי לאורך חמישה חודשים של תרבות. סמן forebrain Foxg1 בא לידי ביטוי ברמות נמוכות עד חמישה שבועות בתרבות.

סמן השכבה העמוקה Tbr1 הגיע לשיאו בסביבות חמישה שבועות והצטמצם לאחר מכן. בעוד הביטוי של סמן השכבה העליונה Satb2, סמן הגחון Eng1, סמן חוט השדרה האחורי Hoxb4, כמו גם סמן אוליגודנדרוציטים Olig2 כל גדל עם הזמן. לעומת זאת, סמן תאי הגזע Sox2 ירד עם הזמן.

סמן הגלישה GFAP הגיע לשיאו בחמישה שבועות ונשאר קבוע יחסית לאחר מכן. זכור לקחת את הטיפול המרבי בעת טיפול בתאי ES באורגנואידים בשלב מוקדם כדי למנוע זיהום כפי שהם גדלים ללא אנטיביוטיקה וגם לזכור להאכיל על פי לוח הזמנים. בעקבות הליך זה, אתה יכול להעריך את האורגנואידים באמצעות טכניקות כגון RT-PCR כמותי עבור ביטוי גנים immunofluorescence עבור ביטוי חלבון לוקליזציה.

באמצעות טכניקה זו, הצלחנו לחקור את היכולת של מולקולה קטנה כדי להקל על היבטים של פגיעה היפוקסית יילודים אנושי כמו מודל בתא היפוקסיה. זה משמעותי כי אלה אורגנואידים המוח האנושי התנהג באופן דומה בניסויים עכבר vivo.