Name: שיטת בימוי עצמי סטטי ליצירת אורגנואידים המוח מתאי גזע האדם העובריים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: למד שיטה פשוטה וחסכונית ליצירת אורגנואידי מוח ממתאי גזע עובריים אנושיים ללא גורמי גדילה חיצוניים. הפרוטוקול מייצר אורגנואידים בעלי מגוון רחב של סוגי תאים עצביים וארגון תאי תקין לחקר מחלות נוירולוגיות שונות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לליבת תאי הגזע של ייל (YSCC), ומרכז הסרטן של ייל (YCC) לסיוע. אנחנו מודים לד ר יונג קים. על סקירת הנוירופתולוגיה שלו עבודה זו נתמכה על ידי הרפואה הרגנרטיבית של קונטיקט הקרן, מארס של מטבעות המלך, ו nhlbi R01HL131793 (S.G.K.), מרכז הסרטן של ייל ואת אוניברסיטת ייל ביולוגיה אימון תוכנית nci CA193200 (אי) ומתנה נדיבה מוגבלת של יוסף ו . לוסיל מאסי

1. תחזוקת תאי גזע
<ol><li>לשמור על H9 hESCs על שכבה של גורם צמיחה מופחתת מטריקס קרום המרתף (לראות את הטבלה של חומרים, מעתה ואילך פשוט המכונה מטריצה) על פי הוראות היצרן.<ol>
<li>כדי לחלוק את אחד 6-באר צלחת או 1 10 ס"מ צלחת, לשלב 100 μL של מטריקס עם 5.9 mL של מדיום שונה של הקרח הקרה של Dulbecco (DMEM)/F12 מדיה. לוחות לעטוף בסרט פרפין ולאחסן לילה ב 4 ° c. השתמש בהם ביום שלמחרת לפני שאתם משתמשים בתאי הזדקנות לאחר שעודפי המולטימדיה/המדיה משופחת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תרבות התאים שבוע לשבוע בקירוב 1:12 מפוצל כל 7 ימים. שמור על התאים באמצעות מדיה mTESR-1 ב 37 ° c, אינקובטור נמוך חמצן (5% O2, 5% CO2). רענן מדיה מדי יום. מריחואנה מבדילים בין תאים מהתרבות בין מעברים בעזרת כלי זכוכית.</li>
	<li>H9 תאים צריך להיות מעבר ארבעה עד שישה ימים לפני ניצול אותם כדי לייצר אורגנואידים. התאים צריכים להיות מיושנים בערך 1:8 יחס של אשכולות תאים. כדי לעשות זאת, להתחיל על ידי שטיפה את התאים עם מדיה F12 dmem ו הנתק את התאים עם פרוטאז נייטרלי (למשל, dispase, מעתה המכונה פשוט פרוטאז), לשטוף עם dמאמ/F-12, ואת הצלחת כמו אשכולות תא 30-60 על פני 4 צלחות (6-טוב או 10 ס מ) ב ~ 20% ה יומיים לפני הקציר, מעבר אותם לאינקובטור רגיל (21% O2, 5% CO2). לוחיות הרישוי אמורות להגיע ל-~ 80% שליטה בזמן התחלת היווצרות מבנה ארגונית.</li>
</ol>2. דיסוציאציה של hESCs לתרבות ארגונית
<ol><li>מחלקים את פתרון מלאי הפרוטאז (5 U/mL). הערה: אנחנו בדרך כלל להקפיא למטה 1 mL מתחת ל-20 ° c לשימוש במשך מספר חודשים.</li>
	<li>לדלל את הפתרון מלאי פרוטאז לריכוז העבודה על ידי הוספת 1 מ ל של פתרון המניה פלוס 5 מ ל/F12 עבור כל 6-היטב או 10 ס"מ צלחת של hESCs.</li>
	<li>מנושף ומסיר את מדיית תרבות התא, ולאחר מכן מכסים את hESCs עם פתרון הפרוטאז. מניחים צלחות בחממה עבור 10-15 דקות או עד שקצות המושבות מסתובבים ומתחילים להיפרד מהמטריקס.</li>
	<li>הטה את הצלחת, ומכה את פתרון הפרוטאז, ושטוף בעדינות את התאים באמצעות DMEM/F12 שלוש פעמים. השתמש 2 mL/גם עבור כל כביסה בעת שימוש צלחת 6-הבאר ו 6 מ ל כאשר משתמש בצלחת 10 ס מ. ודא שמושבות נשארות מצורפות למטריצה בעת ביצוע שלב זה.</li>
	<li>הוסף בחזרה על 1.5 mL של מדיית mTESR טרי לכל טוב (או 5 מ ל על צלחת 10 ס מ) ולשטוף את התאים החוצה את הצלחת באמצעות ליטוף עדין.</li>
	<li>באמצעות שימוש בפיפטה בגודל 10 מ ל, בעדינות לחלק את hESC ולוותר בתוך הצלחת עד שהם מגיעים כ 1/30th מהגודל המקורי שלהם. אשכולות המושבה צריכים להידמות לריבועים בגודל של ~ 250-350 יקרומטר בסיום שלבים אלה.</li>
</ol>3. הדור של אורגנואידים
<ol><li>העברת תאים לתוך מצורף יחיד אולטרה נמוך T75 תרמוס המכיל 30 מ ל של mTESR מדיה ללא מקדם בסיסי הצמיחה פיברוהפיצוץ (bFGF).</li>
	<li>למחרת, להטות את הבקבוקון (עם) כך את הבריכה תאים חיים בפינה (זה יכול לקחת 5-10 דקות ביום הראשון, אבל יהיה מהיר ככל האשכולות לגדול). הערה: אם יש מספר גדול של תאים שדבקו בתחתית הבקבוקון בשלב זה או בצעדים הבאים, העבר את התאים לבקבוקון חדש. זה נורמלי להיות אוכלוסיה גבוהה של תאים מתים ביומיים הראשונים. בעת ביצוע שינויי מדיה, הקפד להסיר את הפסולת הסלולרית ככל האפשר.</li>
	<li>לאחר התאים להתיישב, לאכול את התקשורת ואת התאים מת עוזב כ 10 מ ל של מדיה המכילה את התאים החיים.</li>
	<li>הוסף ~ 20 מ ל של מדיה bFGF נמוכה (Dמאמ/F12 שיושלם עם 1x N2, 1x B27, 1x L-גלוטמין, 1x NEAA, 0.05% בסרום שור (BSA), ו 0.1 מ"מ מונטגליצרול (MTG) שיושלם עם 30 ng/mL bFGF).</li>
	<li>. תבדקו את התאים ביום השני אם רוב התאים נראים בריאים ובהירים, אין צורך לעשות דבר. עם זאת, אם יותר משליש תאים מופיעים כהה, להחליף את המדיה (באמצעות אותה טכניקה הטיה כמו בשלב 3.2) עם ~ 20 mL של מדיה נמוכה bFGF שיושלם עם 20 ng/mL bFGF.</li>
	<li>ביום 3, להחליף חצי של התקשורת (באמצעות טכניקת הטיית בשלב 3.2) עם 20 מ ל של מדיה נמוכה bFGF בתוספת 10 ng/mL bFGF.</li>
	<li>ביום 5, להחליף חצי בינונית (באמצעות טכניקת הטיית בשלב 3.2) עם 20 מ ל של מדיה השראה עצבית (נים: DMEM/F12, 1x תוספת, 0.1 mM הגברת NEAA, 2 μg/mL הפארין). הערה: אם ישנם אשכולות גדולים של תאים או אורגנואידים הגדולים בהרבה מהאחרים, יש להסירם מהתרבות. גודל מוערך על ידי המראה תחת המיקרוסקופ; לדוגמה, באמצעות עינית עם reticle. רוב האורגנואידים הם בגודל דומה (בערך 100 ± 20 μm). הסרנו את האורגנואידים שהיו בערך. שני קטנים או גדולים מהאחרים</li>
	<li>להחליף חצי בינוני (~ 15 מ"ל) (באמצעות טכניקת הטיית) עם נים בכל יום אחר.</li>
	<li>לאחר 3 שבועות בתרבות, להוסיף 100x פניצילין/סטרפטומיצין למדיה (נים: DMEM/F12, 1x N2 תוספת, 0.1 mM הגברת NEAA, 2 μg/mL הפארין) בריכוז הסופי של 1x אם תרצה. . תרענן את המדיה כל יומיים הערה: בצורה זו שמרו על האורגנואידים של עד 6 חודשים בתרבות.</li>
</ol>4. הוצאת רנ א והכנה
<ol><li>בעדינות לחלץ כ 15 אורגנואידים (בהתאם לגודל) מן הבקבוקון באמצעות צינור 10 מ"ל ומקום לתוך שפופרת 1.5 mL.<ol>
<li>בעדינות הגלולה האורגנואידים בצנטריפוגה (200 x g עבור 1 דקות), ולשטוף עם ה-PBS של שיתוף 1X של דולפי (dpbs) שלוש פעמים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחלץ RNA באמצעות מערכת או פרוטוקול מאומתים (לדוגמה, RNeasy kit).</li>
	<li>למדוד את ערך צפיפות אופטית של כל מדגם ב 260 ו 280 nm.</li>
	<li>הכן cDNA באמצעות מערכת או פרוטוקול מאומת (למשל, iScript cDNA ערכת סינתזה).</li>
	<li>בצעו רביעיית-PCR באמצעות התחל מראש (שולחן 1) כולל גן אחד לפחות של משק בית.</li>
</ol>5. אימונוהיסטוכימיה
<ol><li>קיבעון<ol>
<li>הכינו פתרון של 4% פאראמפורמלדהיד והניחו אותו ב -4 ° c.</li>
		<li>תחתוך את הקצה של. פיפטה העברה סטרילית</li>
		<li>בעדינות לחלץ אורגנואידים באמצעות העברה לחתוך את הצנרת, כפי שהם יכולים להישבר בקלות בנפרד, במיוחד כאשר הם גדלים גדולים, ולמקם אותם לצלחת 6-היטב עם מדיה נוספת או DPBS.</li>
		<li>להטות את הצלחת, לנפח את התקשורת, ולהחליף עם 1x DPBS. שטפו את התאים באמצעות 1x DPBS פעמיים נוספות.</li>
		<li>החליפו את ה-DPBS עם 4% הפתרון החצי-בחצי הכולל והניחו על שייקר ב -4 ° c. הערה: בזמן שתיקנו במשך יומיים (עבור אורגנואידים קטנים) ל -7 ימים (עבור אורגנואידים > 3 חודשים), פעמים קצרות יותר (לדוגמה, 16-24 h) יכולים להיות גם אפשריים.</li>
		<li>הכינו 30%, 20% ו -10% סוכרוז פתרונות ב-DPBS.</li>
		<li>לאחר קיבוע בשנת הג, להחליף עם 10% סוכרוז פתרון ומקום על שייקר ב -4 ° c עבור 24 שעות.</li>
		<li>החליפו את ה-10% סוכרוז עם 20% סוכרוז והניחו על שייקר ב -4 ° c במשך 24 שעות.</li>
		<li>החליפו 20% סוכרוז ב-30% מעלות ומניחים על שייקר ב -4 ° c במשך 24 שעות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מקטעים קפואים<ol>
<li>הכינו שכבה שטוחה של קרח יבש והניחו עובש פלסטי מתויג על גבי זה.</li>
		<li>יוצקים שכבה דקה של בינוני בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) לתוך התבנית ומאפשרים לה להתחיל להארדן (תוך כמה שניות).</li>
		<li>מניחים כמה אורגנואידים על החלק העליון של OCT בתבנית באמצעות פיפטה העברה עם הקצה לחתוך ולשים לב קרוב למיקום של האורגנואידים.</li>
		<li>הוסיפו לאט את אוקטובר עד שעובש מלא והאורגנואידים מכוסים. תן לו להיות מרדן לחלוטין עבור 10 דקות נוספות. הערה: בזמן הקפאת מעל 10 דקות מסייע להבטיח מיקום יחסי אידיאלי של אורגנואידים מרובים עבור הצבת, אפשר להשתמש בתערובת הקרח אתנול יבש או חנקן נוזלי כדי להקפיא מהר יותר.</li>
		<li>סמן את המיקום היחסי של האורגנואידים עם סמן כדי להקל על מיקומם בעת חיתוך.</li>
		<li>מקם את התבניות בשקית או בקופסה ואחסן ב-80 ° c עד שמוכן לחתוך את המקטעים.</li>
		<li>באמצעות קריוסטט, פרוסה 10 יקרומטר סעיפים ומניחים את הרקמה על תווית, טעונה באופן חיובי שקופיות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>צביעת<ol>
<li>הכנת פתרון חסימה (0.3% טריטון X-100, 4% סרום חמור רגיל ב-PBS).</li>
		<li>השתמש בעט הידרופובי לצייר סביב המערכת של הרקמה.</li>
		<li>שטוף את השקופיות עם PBS 3 פעמים עבור 5 דקות כל אחד.</li>
		<li>החלף את ה-PBS בפתרון חסימה של 1 h בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>החלף את פתרון חסימת עם פתרון נוגדן (נוגדן בריכוז המתאים, 0.1% טריטון X-100, 4% סרום חמור רגיל ב-PBS) ב 4 ° c ללילה.</li>
		<li>ביום שלמחרת, שטוף את השקופית 3 פעמים עם PBS במשך 10 דקות כל אחד.</li>
		<li>החלף את ה-PBS עם הנוגדן המשני המתאים (בריכוז המתאים) מדולל בתמיסה הנוגדן עבור 1 h בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>לשטוף 3 פעמים עבור 10 דקות בכל פעם עם 1x PBS.</li>
		<li>החל את 4 ', 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI) כתם לשטוף שלוש פעמים עבור 10 דקות כל אחד עם 1x PBS.</li>
		<li>כיסוי מוספית מחליק לקדמת השקופיות עם הפתרון הגובר, לייבש את טמפרטורת החדר בחושך, ולאחסן בחשיכה ב -4 ° c.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Northcutt, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+vertebrate+brain+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+and+Comparative+Biology%22%5BJournal%5D)">Understanding vertebrate brain evolution.</a> Integrative and Comparative Biology. 42 (4), 743-756 (2002).</li>
<li>Roth, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoth%2C+G+%22The+Long+Evolution+of+Brains+and+Minds%22">The Long Evolution of Brains and Minds</a>. , Springer Netherlands. (2013).</li>
<li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+brain+in+numbers%3A+a+linearly+scaled-up+primate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Human+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain.</a> Frontiers in Human Neuroscience. 3, 31(2009).</li>
<li>Roth, G., Dicke, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+brain+and+intelligence%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cognitive+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evolution of the brain and intelligence.</a> Trends in Cognitive Sciences. 9 (5), 250-257 (2005).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organized+formation+of+polarized+cortical+tissues+from+ESCs+and+its+active+manipulation+by+extrinsic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+telencephalic+precursors+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells.</a> Nature Neuroscience. 8 (3), 288-296 (2005).</li>
<li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+axial+polarity%2C+inside-out+layer+pattern%2C+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+motoneurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Specification of motoneurons from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (2), 215-221 (2005).</li>
<li>Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+transplantable+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 19 (12), 1129-1133 (2001).</li>
<li>Pasca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li>
<li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li>
<li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Region-Specific+Organoids+Using+Mini-bioreactors+for+Modeling+ZIKV+Exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li>
<li>Sloan, S. A., Andersen, J., Pasca, A. M., Birey, F., Pasca, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+assembly+of+human+brain+region-specific+three-dimensional+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures.</a> Nature Protocols. 13 (9), 2062-2085 (2018).</li>
<li>Kelava, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Models+of+Human+Brain+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Models of Human Brain Development.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).</li>
<li>Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Madri, J. A., Katz, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minocycline+mitigates+the+effect+of+neonatal+hypoxic+insult+on+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Minocycline mitigates the effect of neonatal hypoxic insult on human brain organoids.</a> Cell Death and Disease. 10 (4), 325(2019).</li>
<li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain-barrier+organoids+for+investigating+the+permeability+of+CNS+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Blood-brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics.</a> Nature Protocols. 13 (12), 2827-2843 (2018).</li>
<li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).</li>
<li>Pham, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+vascularized+brain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Generation of human vascularized brain organoids.</a> Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).</li>
<li>Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+specification+of+telencephalic+glutamatergic+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).</li>
</ol>

S.G.K. הוא חבר SAB עבור Dansar IT ו ג'ין בתוך התא.

בדומה למודלים אורגנואיד אחרים, זוהי מערכת מלאכותית המגיעה עם מספר אזהרות. למרות שהיה אצווה קטנה וריאציה אצווה במונחים של רמות הביטוי הכולל, אורגנואידים בודדים הראו הבדלים. לדוגמה, המיקום של האזורים החיוביים של סוקס-2 לא היה זהה בכל אורגנואיד (איור 3). בעוד qPCR מתאים לחפש שינויים כוללים באצוות של תאים, שיטות נוספות כגון RNAseq תא יחיד יהיה מנוצל במחקרים עתידיים כדי לאסוף מידע נוסף על בסיס תא אחר תא. מגבלה נוספת של מערכת זו, היא שהיא אינה משלבת את ואצלב בתוך האורגנואידים כפי שנעשה בכמה מחקרים שנעשו לאחרונ...

בשל מגבלות מעשיות ואתיות רבות, יש קושי רב בלימוד המוח האנושי. בעוד מחקרים ניצול מכרסמים היו קריטיים להבנה שלנו של המוח האנושי, המוח העכבר יש הרבה וני1,2. מעניין, עכברים יש צפיפות עצבית כי הוא לפחות 7 פעמים פחות מאשר המוח הפרימטים3,4. למרות הפרימטים קרובים יותר לבני אדם מאשר מכרסמים מבחינה אבולוציונית, זה לא מעשי עבור רוב החוקרים לעבוד איתם. המטרה של פרוטוקול זה היתה לסכם תכונות חשובות רבות של המוח האנושי באמצעות שיטה פשוטה וזולה יותר ללא צורך במרתף הטרוולוגי מטריקס קרום או גורמי צמיחה אקסוגני תוך שמירה על מגוון תאי המוח וארגון הסלולר.
עבודת המעצבים מן המעבדה sasai בשימוש סרום חופשי התרבות של embryoid גופים (sfebq) שיטה לייצר שני ותלת מימדי התאים העצביים מתאי גזע עובריים (escs)5,6. הרבה שיטות של אורגנואיד של המוח האנושי הלכו בדרך דומה יחסית של escs7,8. לעומת זאת, פרוטוקול זה מתחיל עם אשכולות של escs האדם הפרטי (hESCs), בדומה לשלבים הראשוניים של עבודה הזרע של מעבדות תומסון ו ג'אנג לפני שלבי הציפוי9,10 , כמו גם את השלב ההתחלתי של פרוטוקול המוח אורגנואיד של המעבדה pasca לפני התוספת של גורמי צמיחה אקסוגני11. מטריצות קרום מרתף (למשל, מטריצות) כבר נוצלו בפרוטוקולים מאורגאיד של המוח הרבים וזה הוכח להיות הגרדום האפקטיבי8. עם זאת, הנפוץ ביותר מטריצות קרום המרתף לא בא ללא סיבוכים כפי שהם שיתוף לטהר עם כמויות לא ידועות של גורמי גדילה עם אצווה לשונות אצווה במהלך הייצור12. בנוסף, מטריצות אלה יכולים לסבך את ההדמיה, ולהגדיל את הסיכון של זיהום ועלות.
בעוד מאורגנואידים המוח האנושי יכול לשמש כדי לענות על שאלות רבות, יש מגבלות מסוימות לזכור. עבור אחד, החל בתאי גזע עובריים, אורגנואידים דומה יותר למוח בוגר מאשר המוחות הישנים וככזה לא יכול להיות מודלים אידיאליים עבור מחלות המתרחשות בגיל הזקנה, כמו מחלת אלצהיימר. שנית, בעוד הפרוטוקול שלנו מצאו סמנים של המוח הקדמי, אמצע המוח התפתחות המוח אשר שימושיים כדי ללמוד את ההשפעה של טיפול או מחלה על תאים מאזורי מוח מרובים בהופעה, ניתן לעקוב אחר פרוטוקולים אחרים כדי להתרכז באזורי מוח ספציפיים13,14. לבסוף, הגבלה נוספת של מודלים אורגנואיד הוא זה של גודל, בעוד האורך הממוצע של המוח האנושי כ 167 מ"מ, אורגנואידים המוח עשה עם שימוש של עצבנות לגדול עד 4 מ"מ8 ואת האורגנואידים שנוצר על ידי פרוטוקול זה לגדול ל 1-2 מ"מ ידי 10 שבועות. למרות זאת, פרוטוקול זה מספק כלי חשוב לחקר רקמת המוח האנושי והאינטראקציה של סוגי תאים מרובים.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 עז נגד עכבר</td><td>Thermo Fisher Scientific, וולת'אם, MA, ארה"ב</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 עז נגד ארנב</td><td>Thermo Fisher Scientific, וולת'אם, MA, ארה"ב</td><td>A11035</td><td></td></tr><tr><td>B27 תוסף</td><td>Gibco, וולת'אם, MA, ארה"ב</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Life Technologies, קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב</td><td>PHG0263</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>BX43 מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס, שינג'וקו, טוקיו, יפן</td><td></td><td></td></tr><tr><td>כתם DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific, וולת'אם, MA, ארה"ב</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>STEMCELL Technologies, ונקובר, קנדה</td><td>07913</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher Scientific, וולת'אם, MA, ארה"ב</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco, Waltham, MA, USA</td><<td>a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023" target="_blank">10010023</a></td><td></td></tr><tr><td>FluroSave</td><td>MilliporeSigma, Burlington, MA</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן GFAP</td><td>NeuroMab, Davis, CA</td><td>N206A/8</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה מופחת מטריג'ל (מטריקס)</td><td>קורנינג, קורנינג, ניו יורק, ארה"ב</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>H9 hESCs</td><td>WiCell, מדיסון, ויסקונסין, ארה"ב</td><td>WA09</td><td></td></tr><tr><td>הפרין</td><td>סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>9041-08-1</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad, הרקולס, קליפורניה, ארה"ב</td><td>1708880</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit</td><td>Bio-Rad, הרקולס, קליפורניה, ארה"ב</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Gibco, וולת'אם, MA, ארה"ב</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>מונותיוגליצרול</td><td>סיגמא-אולדריץ', סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>mTESR media</td><td>STEMCELL Technologies, ונקובר, קנדה</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>N2 NeuroPlex</td><td>Gemini Bio Products, מערב סקרמנטו, קליפורניה, ארה"ב</td><td>400-163</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific, וולת'אם, MA, ארה"ב</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco, וולת'אם, MA, ארה"ב</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>סרום חמור רגיל (NDS)</td><td>ImmunoResearch Laboratories Inc., ווסט גרוב, פנסילבניה, ארה"</td><td>ב<a href="https://www.jacksonimmuno.com/catalog/products/017-000-121" target="_blank">017-000-121</a></td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>סאקורה פינטק, טורנס, קליפורניה, ארה"ב</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td></td><td>PFA מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית, האטפילד, פנסילבניה</td><td>RT15710</td><td></td></tr><tr><td>מכונת qPCR</td><td>Bio-Rad, CFX96, הרקולס, קליפורניה, ארה"ב</td><td>1855196</td><td></td></tr><tr><td>ערכת RNeasy</td><td>Qiagen, הילדן, גרמניה</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Sox2</td><td>MilliporeSigma, ברלינגטון, MA</td><td>AB5603</td><td></td></tr><tr><td>TMS-F מיקרוסקופ</td><td>ניקון, מלוויל, ניו יורק, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות T75 מצורפות אולטרה-נמוכה</td><td>קורנינג, קורנינג, ניו יורק, ארה"ב</td><td>3814</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטת בימוי עצמי סטטי ליצירת אורגנואידים המוח מתאי גזע האדם העובריים

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

אורגנואידים המוח האנושי הבדיל מתאי גזע עובריים להציע את ההזדמנות הייחודית לחקור אינטראקציות מסובכות של סוגי תאים מרובים במערכת תלת ממדית. כאן אנו מציגים שיטה ברורה יחסית וזולה אשר מפיקה אורגנואידים במוח. בפרוטוקול זה האדם בתאי גזע רב עוצמה מנותקים לאשכולות קטנים במקום תאים בודדים גדל במדיה בסיסית ללא מטריצה הטרוולוגי מטריקס מטריצות או גורמי גדילה אקסוגניים, המאפשר רמזים התפתחותיים מהותי כדי לעצב את ה גידול של אורגאיד. מערכת פשוטה זו מייצרת מגוון של סוגי תאי המוח כולל התאים גליה ו microglial, בתאי גזע, ונוירונים של המוח הקדמי, אמצע המוח, ו הראש. אורגנואידים שנוצר מפרוטוקול זה גם להציג את הסימנים של הזמן המתאים וארגון מרחבית הפגינו על ידי תמונות ברייטפילד, היסטולוגיה, immunofluorescence ובזמן אמת הפוכה כמותית התגובה שרשרת פולימראז ( רביעיית-PCR). מכיוון שאורגנואידים אלה מכילים סוגי תאים מחלקים שונים של המוח, הם יכולים להיות מנוצלים ללימוד מספר רב של מחלות. לדוגמה, במאמר האחרון הדגמנו את השימוש באורגנואידים שנוצר מפרוטוקול זה לחקר ההשפעות של היפוקסיה על המוח האנושי. גישה זו יכולה לשמש כדי לחקור מערך של קשה אחרת ללמוד תנאים כגון מגבלות נוירולוגיים, הפרעות גנטיות, ומחלות נוירולוגיות.

איור 1 מציג נציג ברייטפילד תמונות של מספר נקודות זמן כדי להדגים מה התאים/האורגנואידים נראים כמו בכל השלבים השונים של הפרוטוקול. HESCs הוסרו מלוח התרבות רקמה, שבור לחתיכות קטנות, והניח בתוך T75 מצורף אולטרה נמוך בקבוקון שבו הם יצרו כדורים. חשוב לציין כי התאים נראים בהירים ודומים בגודלם, ללא תאים אפלים ומתים במרכזים של אשכולות אלה. התאים הוסלו בהדרגה. ביום 5, הם הושמו בתקשורת השראה עצבית והם נשארו בתקשורת הזאת לאורך תקופת התרבות. למרות האורגנואידים לקבל גדול יותר ולכן כהה יותר לאורך זמן, חשוב ...

פרוטוקול זה נוצר כאמצעי לייצר אורגנואידים המוח באופן פשוט, עלות נמוכה ללא גורמי צמיחה אקסוגני או מטריקס קרום המרתף תוך שמירה על מגוון של סוגי תאי המוח ותכונות רבות של ארגון הסלולר.

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

אורגנואידים במוח האנושי הם כלי משמעותי לחקר מחלות במערכת כי הוא מניפולציה בקלות ומשלב הגדרה אנושית ואת האינטראקציה המתאימה של סוגי תאים מרובים. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כדי לחקור מחלות רבות של המוח, כולל הפרעות נוירו-התפתחותיות, עלבונות רעילים, ואת הצמיחה והטיפול בסרטן במוח. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא היכולת ליצור אורגנואידים במוח לשחזור מאוד עם מגוון רחב של סוגי תאים עצביים.פעולה זו נעשית באמצעות זרימת עבודה פשטנית מאוד שיכולה להתבצע על ידי רוב המעבדות. ואלה מיוצרים באופן זמני מתאים ללא השפעה מגורמי גדילה מיוחדים או מטריסות לא מוגדרות מה שהופך אותו למערכת פשוטה מאוד וחסכונית. כדי להתחיל, לשלב 100 microliters של מטריצה עם 5.9 מיליליטר של קר קרח של Dulbecco של נשר בינוני או F12 מדיה בצינור חרוט 15 מיליליטר.מצפים כל באר בצלחת של שש בארות עם מיליליטר אחד של מטריצת הממברנה. עוטפים את הצלחת בסרט פרפין ומאחסנים לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, שאפו מדיה עודפת מכל באר, שטפו את הבארות עם F12, והוסיפו H9 hESCS בנפח כולל של שני מיליליטר של מדיית mTeSR1 ל הבאר.תרבו את התאים משבוע לשבוע. אספקה יומית עם שני מיליליטר של מדיה mTeSR1 ולהצבת הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס חממת חמצן נמוכה עם 5%חמצן ו 5% פחמן דו חמצני. השתמש בכלי זכוכית כדי להפוך את התאים המשלמים מן התרבות בין קטעים.רענן את המדיה מ

a-static-self-directed-method-for-generating-brain-organoids-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

הסרטון מדגים שיטה ליצירת אורגנואידים במוח אנושי מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים. זה מראה כיצד הנוירוספירה יוצרת שכבה neuroectodermal, אשר מדכא את היווצרות של שכבות נבט אחרות. הנוירוספרות משובצות במטריצת ג'ל תלת ממדית ויוצרות ניצנים נוירואפיתליאליים. כאשר מודגרים עם מדיה אורגנואידים, ניצנים נוירואפיתליאליים אלה מתמיינים לאזורי מוח ספציפיים, וכתוצאה מכך נוצרים אורגנואידים בוגרים במוח.

שיטת מבחנה ליצירת אורגנואידים אנושיים במוח

סרטון זה מדגים טכניקה ליצירת אורגנואידים מוחיים מתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs). התרבית הדבקה של מושבות תאי גזע עובריים עובריים מטופלת באנזימים כדי לנתק ולפרק אותם לאשכולות. צבירים אלה יוצרים כדורים תלת-ממדיים בהשעיה, אשר לאחר מכן מושרים להתמיין לאורגנואידים המחקים את קליפת המוח עם שכבות של תאי עצב ותאי גלייה.

טכניקה ליצירת אורגנואידים במוח מתאי גזע עובריים אנושיים

סרטון זה מתאר את היצירה של אורגנואידים מסוג המוח הקדמי מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (iPSCs), ומדגים את ההתקדמות מצברי תאי גזע למבנים מורכבים המחקים את קליפת המוח ומתמיינים לסוגי נוירונים שונים.

יצירת אורגנואידים מוחיים מסוג המוח הקדמי מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אדם

מידול התפתחות המוח האנושי נפגע עקב המורכבות חסרת התקדים של רקמת האפיתל העצבית. כאן מתוארת שיטה לייצור חזק של אורגנואידים במוח כדי לתאר אירועים מוקדמים של התפתחות המוח האנושי ולדגמן מיקרוצפליה במבחנה.

הדור של Organoids Human Brain iPSC הנגזרות למודל הפרעה נוירו-התפתחותית מוקדמת

Organoids מוחי לייצג מערכת מודל חדש לחקור מוקדם המוח האנושי לפיתוח במבחנה. מאמר זה מספק את המתודולוגיה מפורט לייצר ביעילות organoids הומוגנית מסוג הקדמי הגבי מתאי גזע pluripotent המושרה האנושי כולל שלבים קריטיים איפיון ואימות.

דור של Organoids מוחי סטנדרטית ו לשחזור הקדמי-סוג של האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים ליצירה ואפיון של תאים גזע פלוריפוטנטיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים המושרים על ידי בני אדם (hIPSC) מודלים מבוססי התפתחות ניאוקורטית, כמו גם מתודולוגיות משלימות המאפשרות ניתוח איכותי וכמותי של ביוגניזיס סיליום ראשוני (PC) ותפקוד.

מודלים מבוססי תאי גזע פלוריפוטנטיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים אנושיים לניתוח מעורבות סיליום ראשוני במהלך התפתחות ניאוקורטיקלית

כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירת אורגנוידים במוח מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם (IPSCs). כדי להשיג אורגנוידים במוח בכמויות גדולות ובאיכות גבוהה, אנו משתמשים ביו-רה-קטרים מיני תוצרת בית.

דור אורגנויד במוח מתאי גזע פלוריפוטנטים מושרים במיני ביו-רהקטורים תוצרת בית

במחקר זה, אנו מספקים טכניקה מפורטת למערכת תרבית אורגנואידים פשוטה אך חזקה בקליפת המוח באמצעות תרביות hPSC סטנדרטיות ללא הזנה. זהו פרוטוקול מהיר, יעיל וניתן לשחזור ליצירת אורגנואידים המדגימים היבטים של סנסנציית המוח במבחנה.

דור חזק וניתן לשחזור של אורגנואידים במוח קליפת המוח למידול סנסנציה עצבית במוח במבחנה

מחקרים בהתפתחות חיך מונעים על ידי את השכיחות של חיך שסוע, מומים מולדים שמטיל נטל בריאותי עצום ויכולים להשאיר נמשך השחתה. אנו מדגימים כאן טכניקה למדפי חך התרבות שיכול לשמש כדי לחקור מסלולי איתות שונים מעורבים בפיתוח חיך והיתוך.

שיטה של ​​לימוד Palatal היתוך באמצעות סטטי איברים תרבות

אימות ניסיוני של פעילות משפר ניגש בצורה הטובה ביותר על ידי ניתוח אובדן תפקוד. מוצג כאן פרוטוקול יעיל המשתמש במחיקה בתיווך CRISPR/Cas9 כדי לחקור ויסות ספציפי לאלל של שעתוק גנים בתאי F1 ES המכילים גנום היברידי (Mus musculus129 x Mus castaneus).

יצירת CRISPR / Cas9 מתווכת Monoallelic מחיקות ללמוד לתפקד Enhancer בתאי עכבר גזע עובריים

למד שיטה פשוטה וחסכונית ליצירת אורגנואידי מוח ממתאי גזע עובריים אנושיים ללא גורמי גדילה חיצוניים. הפרוטוקול מייצר אורגנואידים בעלי מגוון רחב של סוגי תאים עצביים וארגון תאי תקין לחקר מחלות נוירולוגיות שונות.

שיטת בימוי עצמי סטטי ליצירת אורגנואידים המוח מתאי גזע האדם העובריים

גלה סרטונים נוספים