דור של Organoids מוחי סטנדרטית ו לשחזור הקדמי-סוג של האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר אורגנואידים סטנדרטיים וניתנים לשחזור מסוג המוח הקדמי מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. שיטה זו היא כלי רב עוצמה למידול מנגנוני פיתוח של NTZs חדשים. בפרט, זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח הקשורות להיווצרות קליפת המוח האנושית המוקדמת.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת יצירה סטנדרטית וחסכונית בזמן של רקמת קליפת המוח האנושית עם שינויים קטנים בין אורגנואידים בודדים לאצוות אורגנואידים. טכנולוגיית אורגנואידים יכולה לספק תובנה לגבי ההתפתחות, המבנה והתפקוד של המוח האנושי, במיוחד עבור אותם היבטים שאינם נמצאים במודלים המוחיים של מינים נמוכים יותר. כדי ליצור אגרגטים של תאי גזע פלוריפוטנטיים, כאשר תרביות תאי הגזע מגיעות למפגש של 70 עד 90%, הוסף 500 מיקרוליטר של מגיב דיסוציאציה של תאים לבאר אחת מתוך צלחת תרבית שש הבארות כדי לנתק את התאים.

תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים, המותאמים לתנאי תרבית חד-שכבתית, הם סוג תאים טוב ליצירת אגרגטים מכיוון שהם פחות מועדים למוות תאים הנגרם על ידי לחץ במהלך הליך הדיסוציאציה והצבירה. לאחר חמש עד 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, הקש בעדינות על הצלחת, והשתמש בשני מיליליטר DMEM/F-12 כדי לשטוף את התאים מתחתית הבאר. העבירו את תרחיף התא שנוצר לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר, והביאו את נפח תמיסת התא עד 10 מיליליטר עם יותר מדיום DMEM/F-12.

לאחר הספירה, העבירו 4.5 פעמים 10 לתאים השלישיים לכל תאי גזע פלוריפוטנטיים לתוך צינור חדש של 15 מיליליטר, ואספו את התאים על ידי צנטריפוגה. אנו משעים את הגלולה בנפח המתאים של מדיום תאי גזע פלוריפוטנטיים, בתוספת מעכב סלע מיקרו-מולרי של 50 כדי להשיג 4.5 פעמים 10 לתאים השלישיים לכל 150 מיקרוליטר של ריכוז בינוני. לאחר מכן, הוסף 150 מיקרוליטר תאים לבארות בודדות של צלחת U תחתונה נמוכה של 96 בארות, והנח את הצלחת בחממה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

לניטור אינדוקציה של נוירואקטודרם קדמי, השתמש במיקרוסקופ תרבית רקמות כדי להתבונן מקרוב בשינויים המורפולוגיים של אגרגטים של תאי גזע פלוריפוטנטיים מדי יום בהגדלה נמוכה. ביום הראשון יש להקפיד על אגרגטים של תאים עם גבולות ברורים. ביום השני, שאפו בזהירות כשני שליש מהמדיום, מבלי להפריע לצברי התאים בתחתית כל באר, והחליפו את המדיום המושלך ב-100 מיקרוליטר של מדיום תאי גזע פלוריפוטנטיים טריים.

בין ארבעה לשישה ימים לאחר מכן, כאשר אגרגטים של התאים מגיעים לקוטר של 350 עד 450 מיקרומטר, ומציגים קצוות חלקים, השתמש בקצה פיפטה שונה של 100 מיקרוליטר כדי להעביר עד 20 אגרגטים לתוך צלחת תרבית אחת נמוכה של שישה סנטימטרים המכילה חמישה מיליליטר של מדיום אינדוקציה קליפת המוח. החלף את מדיום האינדוקציה בקליפת המוח במדיום טרי אחת לשלושה ימים, תוך ניטור המורפולוגיה של האגרגטים מדי יום תחת יעד 4X. לאחר ארבעה עד חמישה ימים במדיום האינדוקציה בקליפת המוח, קצוות אגרגטי התאים צריכים להתחיל להתבהר על פני השטח, מה שמצביע על התמיינות נוירו-אקטודרמלית וארגון רדיאלי של אפיתל פסאודוסטטי.

כדי להטמיע את האגרגטים הנוירו-אקטודרמליים בפיגום מטריצה, יש להפשיר תמצית קרום הבסיס על הקרח למשך שעתיים-שלוש. בזמן שהתמצית מפשירה, השתמש במספריים סטריליים כדי לחתוך סרט פרפין מפלסטיק לריבוע אחד של ארבעה על ארבעה סנטימטרים לכל 16 אורגנואידים, והנח כל פיסת סרט על מגש קצה מיקרופיפטה ריק של 100 מיקרוליטר. לחץ על סרט הפרפין בקצה אצבע עטוי כפפה כך שיופיעו גומות קטנות, ונקה את הסרט עם 70% אתנול.

לאחר קרינת UV בארון בטיחות ביולוגית סגור וסטרילי למשך 30 דקות, השתמש בקצה פיפטה שונה של 100 מיקרוליטר עם פתח של מילימטר וחצי עד שניים כדי להעביר כל אגרגט תאים לגומה אחת בסרט. לאחר שכל האגרגטים הועברו, השתמש בקצה פיפטה לא חתוך של 100 מיקרוליטר כדי לשאוב בזהירות את המדיום מכל גומה, והוסף 40 מיקרוליטר של תמצית קרום בסיס לא מדוללת לכל אגרגט תא. היזהר לא לפגוע באורגנואידים על ידי מניפולציה גסה או שאיפה לקצה הפיפטה מכיוון שהדבר יפגע בנוירואפיתל המתפתח.

השתמש בקצה הפיפטה כדי למקם את האגרגטים באמצע כל טיפה, והשתמש במלקחיים סטריליים כדי להעביר בזהירות את יריעת סרט הפרפין מפלסטיק לצלחת פטרי של 10 סנטימטרים. מניחים את המנה בחממה למשך 15 עד 20 דקות. בזמן שהתמצית מתמצקת, הוסף חמישה מילימטרים של מדיום אינדוקציה קליפת המוח הטרי לצלחת תרבית התקשרות נמוכה של שישה סנטימטרים.

בתום הדגירה, הפוך את יריעת סרט הפרפין והשתמש במלקחיים סטריליים כדי לסחוט בעדינות עד 16 טיפות פולימריזציה לכל צלחת של שישה סנטימטרים. לאחר מכן החזר את האגרגטים לחממת תרבית התאים. למחרת, העבירו את צלחות התרבית האורגנואידית לשייקר תרבית תאים מתנדנד, מוטה בזווית של חמש מעלות ב-14 סל"ד בתוך אינקובטור תרבית תאים, עם ניטור מיקרוסקופ אור יומי, עד שהאגרגטים מגיעים לשלב ההתמיינות המעניין.

ביום ה-20, השתמשו בקצה פיפטה של מיליליטר אחד עם פתח של שלושה עד שלושה וחצי מיליליטר כדי לאסוף שישה אורגנואידים מתרביות הצבירה. הניחו שלושה מהאורגנואידים בבאר אחת של צלחת בת 24 בארות המכילה 500 מיקרוליטר PBS, והשתמשו בפיפטה של חמישה מיליליטר כדי לשטוף את האורגנואידים פעמיים עם 500 מיקרוליטר PBS טרי בכל שטיפה. לאחר הכביסה השנייה, יש לתקן את האורגנואידים ב-4% פרפורמלדהיד קר למשך 15 דקות, ולאחר מכן שלוש שטיפות של 10 דקות ב-PBS בטמפרטורת החדר, והתייבשות אחרונה למשך הלילה בתמיסת סוכרוז 30% בארבע מעלות צלזיוס.

למחרת, צבעו מראש את האורגנואידים המיובשים בדילול טריפן כחול אחד עד 50 למשך 10 דקות כדי לאפשר הדמיה של האורגנואידים במהלך הליך ההקפאה, והחליפו את הסוכרוז במדיום הטבעה טרי שהוכן מראש. מחממים את הצלחת על כרית חימום של 60 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי לאזן את האורגנואידים במדיום ההטבעה, ומכסים את החלק התחתון של תבנית הטבעה אחת לכל אורגנואיד במדיום הטבעה טרי. מניחים את התבנית על קרח כדי למצק את מדיום ההטבעה, מעבירים את האורגנואידים לתבניות ההטבעה ומוסיפים מדיום הטבעה טרי עד שכל אורגנואיד מכוסה.

לאחר מכן הקפיא את האורגנואידים באמבט הקפאת קרח יבש 100% אתנול למשך דקה אחת לפחות, והשתמש בקריוסטט כדי להשיג חלקים בעובי 20 מיקרומטר של כל אורגנואיד לניתוח אימונוציטוכימי. כדי ליצור אורגנואידים מסוג המוח הקדמי, השתמש רק בתרביות IPSC המציגות כשכבה חד-שכבתית הומוגנית של תאים לא ממוינים באוכלוסייה ההתחלתית. ביום השני, אגרגטים היו צריכים ליצור ניצני תאים קומפקטיים עם קצוות חלקים.

אגרגטים של יום 10 צריכים להראות רקמה חלקה וחלקה אופטית ושקופה אופטית על פני השטח החיצוניים, המייצגת את השראת הנוירואקטודרם. אם הפרוטוקול בוצע מקרוב, ייווצרו קבוצות אורגנואידים סטנדרטיות מאוד המדגימות הומוגניות גדולה או שווה ל-90% בהיווצרות נוירואקטודרם מקוטב בתוך ובין אצוות. ניתוח אימונוציטוכימי של אורגנואידים ביום 20 חושף לולאות נוירו-אפיתל מרובדות המבטאות את סמן תאי הגזע העצביים Sox2, את סמני המוח הקדמי Pax6 ו-Otx2, ואת סמן קליפת המוח הגבי Emx1.

לולאות קליפת המוח הללו מאופיינות עוד יותר בלוקליזציה אפיקלית של N-cadherin ו-ZO-1, מיקרו-צינורית שמקורה בתאי גליה רדיאליים באזור החדר, המשתרעת מהצד האפיקלי לצד הבסיסי של המבנים, ותאי חלוקה הממוקמים אפיקליים הצבועים חיוביים לווימנטין זרחני. כדי לנתח את מישור החלוקה של תאי גליה רדיאליים אפיקליים ניתן לבצע צביעה כפולה עבור וימנטין ו-Tpx2, ניתן לבצע חלבון הקשור למיקרו-צינוריות שניתן להשתמש בו כדי לדמיין את הציר המיטוטי ואת התהליכים האפיקליים במהלך נדידת גרעין בין-קינטית. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר אורגנואידים סטנדרטיים והומוגניים מסוג המוח הקדמי מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים.

טכניקה זו מקלה על חקר ההיבטים הספציפיים לאדם של הפרעות נוירו-התפתחותיות באמצעות מודל תאים תלת מימדי מורכב המסודר באופן ספציפי לרקמות עצביות. לאחר שליטה בטכניקה, ניתן להשתמש באורגנואידים קליפת המוח הללו למגוון יישומים, כגון מחקרי נוירו-התפתחותיים, אבולוציוניים או תפקודי גנים, כולל מודלים של מחלות ובדיקות או טיפול תרופתי פוטנציאלי.