הערכה של תאי עוזר T זקיקים ותגובת מרכז חיידקים במהלך שפעת זיהום וירוס בעכברים

תאי עזר זקיקי T הם תת-קבוצה של תאי CD4 T שזוהו לאחרונה המספקים עזרה לתאי B בייצור בעלי חיים בעלי זיקה גבוהה. הדגמת הזיהוי של תאי Tfh בזיהום בנגיף השפעת תעזור לחוקרים חדשים להבין כיצד לבצע את הטכניקות הדרושות למחקרים הקשורים ל-Tfh. מכיוון שטיטר וירוס לא מתאים יכול לגרום לתמותה או לתגובה חיסונית חלשה מדי, אנו ממליצים לקבוע את הטיטר לפני ביצוע ניסוי.

לחיסון נגיף PR8 של עכברים זכרים בני שמונה שבועות C57 שחור 6. בתנאי בטיחות ביולוגית 2, יש להפשיר מלאי של נגיף PR8 המאוחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס על קרח. מערבולת הנגיף לקבלת תמיסה הומוגנית.

לדלל את הנגיף לשתי יחידות פלטפורמה למיקרוליטר PBS בשפופרת מקוררת מראש של 1.5 מיליליטר ולאשר חוסר תגובה של צביטה בבוהן בבעלי החיים המורדמים. מערבולת הווירוס שוב. טען קצה פיפטה של 20 מיקרוליטר עם 10 מיקרוליטר נגיף.

הוסף בזהירות טיפות וירוס לנריס אחד של עד שלוש חיות מורדמות לפני שתחזור על החיסון בצד השני. לאחר מכן, הניחו את כל העכברים בשכיבה על עצם החזה בכלובים חמים עם ניטור עד להחלמה מלאה, ושקלו כל עכבר מדי יום במשך 10 ימים. בסוף הניסוי, הנח את העכברים לתוך מכסה זרימה למינרי ברמת בטיחות ביולוגית 2, ואבטח את החיה הראשונה ללוח חיתוך קצף סופג ומכוסה נייר.

השתמש במספריים לדיסקציה כדי לחתוך את העור לאורך קו האמצע של הבטן, למתוח את העור בפינצטה ולהצמיד את העור ללוח הדיסקציה. פתח את הצפק כדי לאסוף את הטחול, והנח את הטחול בפילטר של 70 מיקרומטר עם צלחת של 6 סנטימטר המכילה 5 מיליליטר DMEM בתוספת 1% FBS. פצלו את הסרעפת והצלעות עד לתימוס ואבטחו את הצלע הצידה כדי לחשוף את חלל בית החזה.

הזז את הריאה והלב כדי לאתר את בלוטת הלימפה המדיאסטינלית ליד הצד הגחוני של קנה הנשימה. לאחר מכן, הניחו את בלוטת הלימפה במסננת משלה בצלחת שנייה של 6 סנטימטרים המכילה 5 מיליליטר מדיום והשתמשו בבוכנות מזרק של 3 מיליליטר כדי לרסק בעדינות את שתי הרקמות דרך הרשת של שתי המסננות. שטפו כל מסננת עם 1 מיליליטר של DMEM טרי בתוספת FBS, והעבירו את מתלי התאים לצינורות צנטריפוגה בודדים של 15 מיליליטר.

אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה והשהה היטב את הכדורים ב-1 מיליליטר של DMEM טרי בתוספת FBS לכל צינור. לאחר מכן הוסיפו ארבעה מיליליטר נוספים של מדיום לתרחיף תאי הטחול והניחו את שני הצינורות על קרח. כדי לצבוע את התאים לביטוי CXCR5, הפוך את הצינור מספר פעמים כדי לערבב ולהעביר 2 פעמים 10 ל-6 תאים לדגימה לצינורות FACS בודדים.

הוסף 2 מיליליטר של מאגר מכתים לכל צינור וערבב את התאים על ידי מערבולת. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה והשליכו את הסופרנטנטים. הקש בעדינות על כל שפופרת על נייר סופג פעמיים והחלק בעדינות את שתי התחתיות כדי להשעות מחדש את התאים בשאריות הסופרנטנט.

חסום את הקישור הלא ספציפי עם 0.2 מיקרוליטר של בלוק קולטן Fc לכל צינור, והחליק את הצינור בעדינות כדי לערבב לפני הנחת הצינורות על קרח למשך 10 דקות. בסוף הדגירה מוסיפים 0.3 מיקרוליטר ביוטין נגד עכבר CXCR5 לכל צינור ומערבבים בתנועה עדינה. הניחו את הצינורות על קרח למשך שעה עם תנועה עדינה לאחר 30 דקות.

בתום הדגירה, הוסף 2 מיליליטר של מאגר צביעה לצינורות ולמערבולת כדי לערבב לפני שקיעת התאים על ידי צנטריפוגה. השליכו את הסופרנטנט והחליקו כדי להשהות מחדש את התאים במאגר השיורי. לאחר מכן, הניחו את הצינורות על קרח וסמנו את התאים בנוגדנים כנגד סמן פני השטח המעניין כפי שמתואר בטבלה כפי שהודגם זה עתה.

בתום הדגירה יש לשטוף את התאים עם 2 מיליליטר של מאגר צביעה ולהשעות מחדש כל כדור ב -400 מיקרוליטר של מאגר צביעה טרי לניתוח על ידי ציטומטריית זרימה. עכברים נגועים בנגיף PR8 מתחילים לרדת במשקל ביום השישי, מגיעים לירידה הגבוהה ביותר ביום השמיני וחוזרים לרמות המשקל הראשוניות ביום העשירי. כצפוי, ירידה במשקל לא נצפתה בעכברי ביקורת שטופלו ב-PBS.

זיהום בנגיף מוביל גם להתרחבות לימפוציטים חזקה בתוך בלוטת הלימפה המנקזת. כפי שנצפה על ידי ניתוח זרימה ציטומטרי, התמיינות תאי עזר זקיקי T מאתחלת ביום החמישי ומגיעה לשיאה ביום ה-10 לאחר ההדבקה עם מספרים חזקים של תאי עזר זקיקי T המושרים בעכברים נגועים בנגיף השפעת בהשוואה לחיות ביקורת. יתר על כן, הן בבלוטות הלימפה המדיאסטינליות והן בטחול, מספרי תאי T חיוביים ל-CD4 ספציפיים לאנטיגן שפעת מושרים באופן משמעותי בהשוואה לאלו שנצפו בעכברי ביקורת עם אוכלוסיות מוגברות של תאים חיוביים ל-PD-1 חיוביים ל-CXCR5 בבעלי חיים PR8.

בנוסף, צביעה תוך-תאית ל-IL-21 מגלה כי זיהום PR8 גורם לייצור גבוה משמעותית של ציטוקין זה בתגובה לזיהום בנגיף. צביעה אימונו-פלואורסצנטית מצביעה על נוכחות של תגובת מרכז נבט מושרית בעכברים נגועים ב-PR8, ו-ELISA מדגימה יצירת נוגדנים ספציפיים לנגיף השפעת בבעלי חיים נגועים בנגיף. חשוב לבצע צביעה של CXCR5 על קרח למשך שעה, מכיוון שאיכות הכתם תושפע מטמפרטורת הצביעה ומהזמן.

למרות שהדגמנו צביעת CXR5 ו-IL-21, ניתן להעריך סמני שטח אחרים, גורמי שעתוק וציטוקינים בשיטה זו כדי לספק המון על התמיינות ותפקוד Tfh.