לוקליזציה וקוונפיקציה של וירוסים באגאוטיות ברקמות Whitefly על ידי Immunofluorescence ו-PCR כמותי

הבהרת המרחביות וכמות הנגיף בווקטורים לבנים יכולה לסייע בהבנת אינטראקציות begomovirus-whitefly ובפיתוח אסטרטגיות חדשניות לשליטה במחלות begomoviral חמורות. היתרונות של טכניקה זו הם שאנחנו יכולים לבודד במהירות רקמות whitefly, שיתוף לוקליזציה חלבונים ויראליים לבןfly, ולכרות וירוסים בגופים שלמים לבן וצמחים נגועים בווירוסים. בנקודת הזמן הניסיונית המתאימה, לאחר רכישת הנגיף, מניחים את הגחליליות הלבנות שעברו הרדמה בקרח לטיפה של PBS בשקופית מיקרוסקופ ולהשתמש במחט דיקור עדין כדי לפתוח את הבטן של הגחלילית הלבנה תחת מיקרוסקופ סטריאו.

השתמש במחט כדי לחלץ את midgut ולהניח את midgut לתוך צלחת אוסף של PBS. כדי לאסוף את PSGs, לפצל את הגוף בבית החזה מהצד הגבי ליד הראש ולתקן את whitefly עם מחט דרך בית החזה. השתמש מחט שנייה כדי לנער את הזבוב הלבן עד שתי בלוטות הרוק מופרדים מהגוף ולהעביר את הבלוטות לצלחת חדשה של PBS.

כדי לאסוף את השחלות, לפתוח לחלוטין את הבטן ולהשתמש במחט כדי להפריד את השחלות מן הרקמות האחרות. השתמש פיפטה כדי להסיר את הרקמה העודפת ולהעביר את השחלות לתוך צלחת חדשה של PBS. כדי לאסוף מדגם המולימפה, להוסיף 10 microliters של PBS על שקופית מיקרוסקופ חדש ולמקום לבן חדש לתוך טיפה.

השתמש מחט דיקור עדין בעדינות לעשות חור בבטן. לאחר מכן להחיל לחץ קל על הבטן כדי לשחרר את ההמולימפות לתוך החיץ ולאסוף מדגם שמונה microliter של הנוזל. כדי לדמיין לוקליזציה של TYLCV ברקמות פ.ס.ז’, מידגוט או השחלות שנקטפו, העבר 15 עד 20 דגימות לצלחת פטרי זכוכית באורך 3.5 ס”מ ושאוף את המאגר העודף.

תקן את הרקמות במיליליטר אחד של 4% paraformaldehyde במשך שעתיים בטמפרטורת החדר לפני בזהירות לשטוף את הדגימות שלוש פעמים במשך שתי דקות במיליליטר אחד של TBS טרי לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, לחלחל את הדגימות עם מיליליטר אחד של 0.5% טריטון X-100 במשך 30 דקות לפני הכביסה שלוש פעמים כפי שהוכח רק עם מיליליטר אחד של TBST לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, לחסום כל כריכה לא ספציפית עם מיליליטר אחד של אלבומין סרום 1%bovine במשך שעתיים בטמפרטורת החדר ואחריו שלוש שטיפות ב- TBST כפי שהוכח.

לאחר הכביסה האחרונה, תייג את התאים בנוגדנים העיקריים המעניינים בן לילה בארבע מעלות צלזיוס המוגנים מפני אור. למחרת בבוקר, לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם TBST לפני הוספת נוגדנים משניים המתאימים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור. בסוף הדגירה, לשטוף את midguts שלוש פעמים ולהעביר את הדגימות לשקופית מיקרוסקופ נקי.

הסר מאגר רב ככל האפשר ולהכתים את הגרעינים עם טיפה אחת של DAPI לפני הרכבה עם כיסוי ובחינת הרקמות המסוותוויות על ידי מיקרוסקופיה קונפוקאלית. לכימות TYLCV, שטפו את דגימות רקמת הזבוב הלבן שנקטפו פעמיים עד שלוש פעמים ב-PBS טרי והעבירו 20 מיקרו-רובוטים, 20 PSGs או שחלה אחת בחמישה מיקרוליטרים של PBS לצינורות PCR בודדים המכילים 25 מיקרוליטרים של תותבת. מוסיפים חמישה עד שבעה חרוזים קרמיים בקוטר 2 מ”מ לכל צינור וטוחנים את הדגימות בהומוגניזר.

הוסף דגימה אחת של שמונה מיקרוליטר של המולימפה לתוך צינור PCR חדש ולהוסיף 10 microliters של תזה לצינור עם ערבוב יסודי. דגירה כל הדגימות ב 65 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת ואחריו דגירה של 10 דקות ב 100 מעלות צלזיוס וצנטריפוגה קצרה. לאחר מכן, הוסיפו 18 מיקרוליטרים של תערובת אב לבקבוקונים של צינורות פס PCR כמותיים והוסיפו שני מיקרוליטרים של כל דגימת דנ”א לשלושה בקבוקונים לפחות.

כאשר כל הדגימות נטענו, סגור את הצינורות ואת הצנטריפוגה כדי להזרים את הפתרון בתחתית כל בקבוקון. לטעון את הבקבוקונים על רוכב מחזור תרמי בזמן אמת עבור PCR כמותי, בחירת סייבר כצבע פלואורופור ולא ידוע כמו סוג המדגם. לאחר מכן לייצא את הנתונים הכמותיים לגיליון אלקטרוני לניתוח הכמות היחסית של DNA ויראלי בכל דגימה.

כאן, תמונות מייצגות של TYLCV בכתמי DAPI ב PSGs לבן, midguts, ושחלות מוצגים. כפי שנצפה, TVLCV מדגים הצטברות גדולה יותר בתוך PSGs ו midguts מאשר בשחלות. כימות הנגיף ב- PSGs לבן, midguts, hemolymph, ושחלות לאחר האכלה על עגבניות נגועות TYLCV במשך 24, 48, ו 72 שעות עולה כי כמות הנגיף עולה ברקמות שונות של לבןfly בקורלציה ישירה לעלייה בתקופת הגישה לרכישה.

עדיף להשתמש לבנים טריים, כמו חרקים מתים יגדיל את הקושי של ניתוח. בעקבות הליך זה, ניתוחים אחרים, כמו כתמים מערביים ושיתוף immunoprecipitation, ניתן לבצע כדי לענות על שאלות נוספות על ביטוי חלבון ויראלי אינטראקציות חלבון ויראלי וקטור.