חיזוי קטיעה באמצעות תאי אב מונונוקלאואריים במחזור מקומי בחולים שטופלו באנגיופלסטיקה עם איסכמיה קריטית של הגפיים
22 בספטמבר 2020
קטיעה בגפיים התחתונות עלולה להתרחש גם לאחר אנגיופלסטיקה של כלי דם חסומים באיסכמיה של גפיים קריטיות (CLI). תאי אב מונונוקולריים (MPCs) משקפים תיקון כלי דם. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הכימות של MPCs מהמחזור קרוב אנגיופלסטיקה, ואת הקשר שלה עם תפקוד אנדותל וחיזוי של קטיעה בגפיים התחתונות.
למרות שאנגיופלסטיקה משפרת את זרימת הדם באיסכמיה קריטית של הגפיים, חלק מהחולים עדיין יתקדמו לקטיעת גפיים. בהשוואה לפרוגנוזה המבוססת על גורמי סיכון מסורתיים ומאפיינים פנימיים של כלי הדם, מספר ה-MPCs המקומיים יכול לנבא יותר את התוצאה הקלינית, לגבי תפקוד לקוי של האנדותל וקטיעת גפיים. מספר ה-MPCs המקומיים מייצג אינדיקטור מבטיח לפרוגנוזה של אירועים וסקולריים, כגון איסכמיה, מחלות לב ואיסכמיה בגפיים התחתונות, עם יישום פוטנציאלי בריבוד סיכונים ואכיפת מניעה.
ידגימו את ההליכים אדוארדו ורה-גומז, אלחנדרו הרננדז-פטריסיו, קרולינה ארנדה-רודריגז, חואן אריאל גוטיירז-בואנדיה, אטין סואה רואיז-הרננדז, מריו אנטוניו טלז-גונזלס וגבריאל אלכסנדרה דומינגז-פרז. דוקטורנטים מהמעבדות למטבוליזם ניסיוני והתחדשות רקמות, כמו כן, יהיו גבריאל הרננדז-דה רובין ואוסקר אנטוניו לומן-זוניגה. ואלה מהמחלקה לכירורגיית כלי דם.
כדי לקבוע את ה-FMD לפני ואחרי אנגיופלסטיקה, השתמש במתמר ליניארי וסקולרי כדי למדוד את קוטר העורק הברכיאלי של המטופל. המקום הבא, השרוול של מד לחץ דם מעל אתר המדידה באמה, והשרוול 50 מילימטרים של כספית מעל לחץ הדם הסיסטולי למשך חמש דקות לפני שהוא מתרוקן. תוך 60 שניות מרגע הריקון, מדוד שוב את קוטר העורק הברכיאלי, והשתמש במשוואה כדי להעריך את ה-FMD.
כדי להעריך את החומרה הקלינית של איסכמיה בגפיים, על פי סיווג רתרפורד, הנח מחט בגודל 18 לתוך כלי הדם באתר המפשעה שנבחר, והנח מכניס מעל המחט. קדם חוט מנחה גמיש לתוך המבוא והחלף את המדריך בשישה מבוא צרפתי. באמצעות הנחיה פלואורוסקופית, הזריק מדיום ניגוד כדי לזהות את מסלול העורק ואתרי כלי דם חסומים.
הכניסו שני חוטי ניווט צרפתיים 0.014 ושני חוטי תמיכה צרפתיים 0.014 לתוך הספינה, וקדמו את חוטי ההנחיה לאתר החסום. לאחר מכן, הכניסו קטטר צרפתי אחד חמש ולאחר מכן צנתר צרפתי אחד שלושה, ואספו 10 מיליליטר דם מהמקום הקרוב ביותר לחסימת כלי הדם. הניחו את הדגימה על קרח וקדמו שוב חוט מנחה.
כאשר החוט המנחה נמצא במקומו, הכנס צנתר בלון אנגיופלסטיקה, המכיל בלון מתנפח הממוקם בקצה הצנתר, וקדם את קטטר הבלון אנגיופלסטיקה למקום הנגע. נפחו את הבלון כנגד הפלאק החוסם, הממוקם בדופן כלי הדם, וודאו שחזור זרימת הדם. 30 דקות לאחר ביצוע האנגיופלסטיקה, יש לקדם קטטר לאתר הקרוב ביותר לגוש כלי הדם ולאסוף 10 מיליליטר דם.
לאחר מכן, הסר את כל חוטי ההנחיה וספק את הטיפול המתאים לאחר הניתוח. שבועיים לאחר האנגיופלסטיקה, העריכו את החומרה הקלינית של איסכמיה בגפיים, כאבי מנוחה, איסכמיה נמוכה יותר ושימור תפקודי של כף הרגל, על פי סיווג רתרפורד, וזהו את המקרים הדורשים קטיעה גדולה עקב תוצאה שלילית. תוך שעה אחת מרגע האיסוף, העבירו שישה מיליליטר מכל דגימת דם שנאספה לצינורות חדשים של 15 מיליליטר, ודללו את הדגימות ביחס של אחד לאחד ב-PBS.
הוסף שני מיליליטר של מדיום שיפוע צפיפות לכל אחת משלוש מבחנות, והוסף שלושה נפחים שווים של הדם המדולל לכל שפופרת ללא יותר משלושה רבעים מלאים. הפרד את תאי הדם על ידי צנטריפוגה של שיפוע צפיפות, והשתמש בפיפטה כדי לאסוף את תאי הממשק של השכבות המתקבלות. משוך את התאים מכל דגימה לתוך צינור יחיד של 15 מיליליטר, ושטוף כל דגימה שש פעמים, עם שני מיליליטר PBS לכל שטיפה.
לאחר הכביסה האחרונה, השעו מחדש את ה-MPC המכיל כדורים במיליליטר אחד של PBS לדגימה לספירה, והוסיפו פעם אחת 10 לששת התאים לכל צינור למספר המתאים של חמישה צינורות ציטומטריה זרימה של מיליליטר לדגימה. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה, והשעיה מחדש של כל דגימת תא ב-100 מיקרוליטר של קוקטייל הנוגדנים המעניין למשך 10 שניות, לפני הדגירה של התאים למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס, מוגנים מפני אור. בתום הדגירה, השתמש בנוגדני בקרה מותאמים לאיזוטיפ כדי להגדיר את שערי הפיזור הקדמיים והצדיים המתאימים לניתוח, והשתמש בצינור המכיל מספר גבוה של תאים חיוביים CD45 ו-CD34 כדי לשער את ה-NPCs.
כדי לבחור פנוטיפים חיסוניים חיוביים כפולים, צור עלילות חדשות וזהה את התאים החיוביים KDR, CD133 ו-CD184, CD34 חיוביים, CD45 חיוביים, ולאחר מכן שער לזיהוי תת-האוכלוסיות העיקריות של MPC. לאחר מכן ניתן לתאם את מספר ה-MPCs עם ערך ה-FMD הבסיסי, ודלתא לאחר אנגיופלסטיקה של FMD, ושיעור החולים הזקוקים לקטיעה משמעותית של הגפה התחתונה. בניתוח מייצג זה, 30 יום לאחר אנגיופלסטיקה בגפיים התחתונות, המספר הבסיסי של MPCs חיוביים ל-CD45, חיוביים ל-CD34, חיוביים ל-KDR, נמצא בקורלציה שלילית עם ה-FMD.
בעוד שהשינוי ב-CD45 חיובי, CD34 חיובי, CD133 חיובי, CD184 חיובי, לאחר אנגיופלסטיקה, נמצא בקורלציה מובהקת עם שיפור ב-FMD. מספר בסיסי מוגבר של MPCs חיוביים CD45, CD34 חיוביים, חיוביים ל-KDR, כמו גם הפחתה לאחר אנגיופלסטיקה בתאי MPC CD45 חיוביים, CD34 חיוביים, CD133 חיוביים, CD184 חיוביים, נצפתו גם בחולים, שהתפתחו לקטיעת גפיים, במהלך הגישה כלי הדם, הקפד לאסוף את הדם מהאתר הקרוב ביותר לחסימת כלי הדם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את תפקידן של תאי פרוגניטור מונונוקלאריים (MPCs) בניבוי תוצאות קליניות לאחר פתיחה של כלי דם (angioplasty) בחולים עם איסכמיה קריטית של הגפיים (CLI). הוא מדגיש את הפוטנציאל של MPCs כסמנים לתפקוד לקוי של האנדותל ולסיכון לקטיעה של הגפיים התחתונות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה של כלי דם
- תוצאים קליניים באיסכמיה
- רפואה רגנרטיבית תאית
רקע
- אנגיופלסטיה משפרת את זרימת הדם אך אינה מונעת את כל מקרי קטיעת הגפיים.
- ייתכן שגורמי סיכון מסורתיים לא ינבאו באופן מלא את התוצאות הקליניות.
- MPCs מעורבים בתיקון כלי דם ועשויים לשמש כסמן פרוגנוסטי.
- הבנת רמות ה-MPC עשויה לשפר את סיווג הסיכונים עבור מטופלים.
מטרת המחקר
- לכימות MPCs מהסירקולציה לאחר פלסטיקה של כלי דם.
- להערכת הקשר בין רמות MPC לבין תפקוד לקוי של האנדותל.
- להערכת הערך הניבוי של MPCs עבור קטיעת גפיים תחתונות.
שיטות שהוצגו
- איסוף דגימות דם ממטופלים העוברים באנגיופלסטיה.
- כימות של MPCs באמצעות ציטומטריה של זרימה.
- הערכה של תפקוד אנדותלי באמצעות בדיקות קליניות מקובלות.
- ניתוח סטטיסטי למציאת מתאם בין רמות MPC לתוצאות קליניות.
תוצאות עיקריות
- רמות גבוהות יותר של MPCs היו קשורות לתוצאות קליניות משופרות.
- כימות של MPCs סיפק ערך ניבוי נוסף מעבר לגורמי סיכון מסורתיים.
- דיספונקציה אנדותליאלית נמצאה במתאם עם רמות MPCs נמוכות יותר.
- המחקר תומך בשימוש ב-MPCs לצורך סיווג סיכונים עבור חולי CLI.
מסקנות
- MPCs הם סמנים ביולוגיים מבטיחים לחיזוי סיכון לקטיעת גפה.
- נדרש מחקר נוסף כדי לתקף ממצאים אלו בקבוצות נבדקים גדולות יותר.
- שילוב של הערכת MPC עשוי לשפר את אסטרטגיות ניהול המטופלים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות תאי פרוגניטור מונונוקליאריים (MPCs) במחזור הדם המקומי מציע גישה מונחית-ביומארקר לדיוק של סטרטיפיקציית סיכונים בחולים עם איסכמיה קריטית של הגפיים העוברים אנגיופלסטיה. על ידי קישור רמות ה-MPC לתפקוד אנדותליאלי לקוי ולתוצאות קטיעה בתוך 30 יום, שיטה זו תומכת בביטחון חיזוי לגבי יכולת תיקון כלי דם ומספקת מידע לקבלת החלטות לגבי יישום טיפולים משלימים. היא נותנת מענה לאתגר מרכזי בשלב הגילוי: זיהוי החולים שסביר כי יחוו התקדמות לאובדן רקמות בלתי הפיך למרות רבסקלריזציה מוצלחת.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות על תיקון כלי דם על ידי הקשר בין תתי-אוכלוסיות של MPC לתוצאות אנדותליאליות תפקודיות.
- ערך תפעולי: מספק קריאה תאית כמותית להפחתת סיכונים במעורבות של מטרות במסלולים פרו-אנגיוגניים או רגנרטיביים.
- ערך מדעי: תומך בהבנה מכניסטית של האופן שבו דינמיקה של תאי פרוגניטור אנדוגניים משפיעה על גורל של רקמה איסכמית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: קובע פרוטוקול סטנדרטי של ציטומטריה של זרימה לבידוד ואפיון של MPCs מדם פריפריאלי בקרבת אתר ההתערבות.
- ערך תפעולי: מספק מדידות כמותיות הניתנות לשחזור של תתי-אוכלוסיות של MPC מסוג CD45+/CD34+/KDR+ ו-CD45+/CD34+/CD133+/CD184+ לצורך תיקוף הבדיקה.
- ערך מדעי: מאפשר סריקה של תרכובות או ביולוגיות המיועדות לווסת את גיוסן או את תפקודן של תאי פרוגניטור במודלים של איסכמיה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקדם המשכיות תרגומית (translational continuity) באמצעות שימוש בסמן ביולוגי מבוסס-תאים בעל רלוונטיות קלינית, המשקף תהליכי נזק כלי דם ותיקון.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף של מודלים פרה-קליניים על ידי אספקת מדד ייחוס לשינויים ב-MPC לאחר רבסקלריזציה במודלים של איסכמיה של הגפה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס לקבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים, באמצעות זיהוי סמנים ביולוגיים המנבאים התאוששות תפקודית לעומת סיכון לקטיעה.
אינטגרציה של תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטה זו נכללת ברצף מהגילוי ועד לתרגום קליני, שבו הערכה מוקדמת של סמנים ביולוגיים עוקבת אחר הבנה פתופיזיולוגית ראשונית וקודמת לסריקה של התערבויות טיפוליות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על תפקידם של תאי פרוגניטור בתיקון כלי דם ובהומאוסטזיס אנדותליאלי.
- סריקה: מספק כימות MPC סטנדרטי ומוכן לבדיקה להערכת השפעות של תרכובות על קיבולת התחדשות תאית.
- אנליטיקה: מייצר נתונים קורלטיביים בין דלתא של MPC, FMD בקו הבסיס ותוצאות קליניות כדי לאפשר ניתוח השוואתי של מצבים.
- מחקר תרגומי: מקשר מדדי תאים משלב הגילוי לתיקוף פרה-קליני באמצעות התאמה של ביומרקרים שמקורם בחולה ורלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מכונן פלטפורמת ביומרקרים לשימוש חוזר, הישימה במודלים של פגיעות בכלי דם ובתוכניות לרפואה רגנרטיבית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במכניזמי תיקון כלי דם ומפחית עמימות לגבי תפקוד תאי פרוגניטור.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה והשחזוריות באמצעות הגדרה של עיתוי איסוף הדם, העיבוד ואסטרטגיית ה-gating בציטומטריה של הזרימה.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי אפשור זיהוי מוקדם של מטופלים שאינם מגיבים לאנגיופלסטיה, ובכך מפחית מעקב ממושך וחסר תועלת.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעודף מותאם סיכונים של טיפולים רגנרטיביים בהתבסס על סיכון לקטיעה המדורג לפי MPC.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות של גישה כלי דם, ציטומטריה עם זרימה (flow cytometry), ואימונופנוטיפיקציה של אוכלוסיות נדירות של תאי פרוגניטור.
- תלוי באיסוף דם סטרילי, עיבוד מהיר, ותשתית צנטריפוגה להפרדה במדרג צפיפות (density gradient separation).
- מחייב סטנדרטיזציה בין אתרים שונים לאיסוף הדגימות ביחס לעיתוי ביצוע האנגיופלסטיה ולקרבה אנטומית לחסמה.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום הפנל של ה-MPC למודלים מחלה או למינים שונים.
- מוגבל על ידי הצורך בציוד ייעודי והכשרה טכנית לשמירה על נאמנות הבדיקה בין מפעילים שונים.
שאלות נפוצות בתחומי הביו-פרמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:33
Flow-Mediated Dilation (FMD) Evaluation
2:11
Lower Limb Vascular Blood Evaluation, Blood Sampling, and Balloon Angioplasty
4:07
Circulating Mononuclear Progenitor Cell (MPC) Isolation and Antibody Staining
5:21
MPC Quantification
6:10
Results: Representative Relationship Between MPC and Hemodynamic Indicators and Lower Limb Amputation Prognosis After Angioplasty
7:04
Conclusion
