בניית מוטנטים בסרוטיפ 1 סטרפטוקוקוס דלקת ריאות זן 519/43

פרוטוקול זה משמעותי מכיוון שהוא מאפשר שינוי גנטי של סרוטיפ שלא ניתן היה לטפל בו בעבר, מה שמאפשר לחקור ולהבין את הסרוטיפ. זה פותח אפיקים לעבודה ביולוגית כמו פיתוח חיסונים. מי שתדגים את ההליך תהיה ונסה ס.טרה, עוזרת פרופסור מבית הספר להיגיינה ורפואה טרופית בלונדון.

כדי להתחיל ליצור פלסמיד pSD1 על ידי ביצוע קשירה בהתאם להוראות היצרן pGEM-T Easy System I. דגרו את התגובה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, התמיר E.coli Dh5-alpha בעל יכולת כימית עם pSD1, דגירה של 50 מיקרוליטר מהתאים עם שלושה מיקרוליטרים של תגובת קשירת pSD1 למשך 15 דקות על קרח, ואז חשוף את התאים להלם תרמי והניח את התאים על קרח למשך שתי דקות.

הסר את התאים מהקרח והוסף 350 מיקרוליטר של מדיה SOC ואז דגר על התרבית למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס ו-120 סל"ד. צלחת את הטרנספורמציה על אגר לוריא-ברטאני בתוספת 0.4 מילי-מולרי IPTG, 0.24 מיליגרם למיליליטר X-Gal לבחירה כחול-לבן, ו-100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין כדי להבטיח שלכל המושבות הגדלות על הצלחת יש את עמוד השדרה של הפלסמיד. בחרו שלוש מושבות לבנות המכילות pSD1 והקימו גידולים בן לילה ב-10 מיליליטר של L-B בתוספת 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין.

דגרו על התרביות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם טלטול. למחרת, צנטריפוגה את התרביות ב -3, 082 גרם והשתמש בגלולה למיצוי פלסמיד. לאחר חילוץ ה-DNA של הפלסמיד, הגדר עיכול הגבלת BamH1 הן עבור פלסמיד pSD1 והן עבור קלטת הספקטינומיצין.

דגרו על תגובות העיכול והבקרות של ההגבלה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. בסיום ההגבלה, נתח את המוצרים על ידי אלקטרופורזה ולאחר מכן כרת את הרצועה הנכונה וטהר אותה באמצעות ערכה מסחרית. לאחר מכן, הפעל תגובת קשירה באמצעות pSD1 המעוכל BamH1 וספקטינומיצין.

זה ייצור את הפלסמיד pSD2. הפוך את pSD2 ל-E.coli DH5-alpha בעל יכולת כימית כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, בחר את הטרנספורמנטים הנושאים פלסמיד pSD2 על סמך יכולתם לגדול ב-LBA בתוספת 100 מיקרוגרם למיליליטר של ספקטינומיצין ואמפיצילין ולחלץ את ה-DNA של הפלסמיד.

הכינו תרבית לילה של S.pneumoniae 519/43 ב-BHI ואפשרו לו לגדול באופן סטטי ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. למחרת, יש לדלל את התרבויות 1:50 ו -1:100 ב -10 מיליליטר מרק BHI טרי. דגירה סטטית של התרבית ב-37 מעלות צלזיוס עד שה-OD ב-595 ננומטר הוא בין 0.05 ל-0.1.

לאחר שמגיעים ל-OD המתאים, קחו 860 מיקרוליטר תרבית והעבירו אותה לצינור מיקרו-צנטריפוגה. הוסף 100 מיקרוליטר של נתרן הידרוקסיד 100 מילי-מולרי, 10 מיקרוליטר של 20% BSA, 10 מיקרוליטר של 100 מילי-מולרי סידן כלורי, שני מיקרוליטר של 50 ננוגרם למיליליטר CSP1 ו-500 ננוגרם של pSD2. דגרו את התגובה באופן סטטי ב-37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות.

לאחר מכן, צלחו 330 מיקרוליטר על צלחות אגר דם של 5% בתוספת 100 מיקרוגרם למיליליטר ספקטינומיצין כל שעה במשך תקופת דגירה של שלוש שעות. לאחר מכן, דגרו את הלוחות למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. טלאו מושבות עמידות לספקטינומיצין על צלחת אגר דם אחרת בתוספת 100 מיקרוגרם למיליליטר ספקטינומיצין ועל צלחות אגר דם בתוספת 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין, הבודק את נוכחות עמוד השדרה של הפלסמיד.

דגרו על שתי קבוצות הצלחות למשך הלילה. הרכבה נכונה של pSD2 אושרה על ידי עיכול הגבלה. לאחר מכן נעשה שימוש ב-pSD2 להפיכת 519.43 תאים מסוג פראי.

מושבות שגדלו על ספקטינומיצין לאחר דגירה של לילה נחשבו לטרנספורמטורים חיוביים. אישור פנוטיפי של מוטציית הפנאומוליזין בוצע על ידי הערכת פעילות המוליטית עבור D39, 519/43 מסוג פרא ומוטציה 519/43 דלתא. זה הושווה להמוליזה של כדוריות דם אדומות ב-0.5% ספונין, שנחשב ל-100%המוטציה איבדה את יכולתה ליז כדוריות דם אדומות.

כל המושבות החיוביות אושרו עוד יותר על ידי ריצוף כדי להעריך את מיקום ההחדרה. נעשה שימוש בפריימרים עם אתרי קשירה מחוץ לאזור ההומולוגיה. בעת ביצוע תגובת הטרנספורמציה, חשוב להוסיף את הריאגנטים בסדר הנכון.