Name: בניית מוטנטים בסרוטיפ 1 סטרפטוקוקוס דלקת ריאות זן 519/43 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 6 s
Description: למד שיטה ליצירת מוטנטים איזוגניים ב-Streptococcus pneumoniae סרוטיפ 1 באמצעות פלסמיד pSD1 ותסיסה ב-E. coli. פרוטוקול זה מאפשר מחקר פתוגנזה ופיתוח חיסונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לקרן דלקת קרום המוח ול-MRC על מתן המימון לעבודה זו.

1. יצירת אמפליקון מוטציה על ידי SOE-PCR23 והגברה של קלטת ספקטינומיצין
<ol><li>התחל בביצוע PCR להגברה של זרועות ההומולוגיה (ply 5' (488 bp) ו- ply3' (715 bp) בהתאמה) של אזורי האיגוף של גן הרובד מזן 519/43. השתמש פריימרים plyFw1_NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG), ply5'R1_BamHI (CGAAATATAGACCAAAGGACGCCGGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGA), ply3'F1_BamHI (TCAAGGTCAAGTTTGGTTCTGGATCC GCGTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTC) ו- plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTACCTTATCCTCTACC).</li>
	<li>השתמש בתנאי ה-PCR הבאים עבור ply5': דנטורציה ב-94°C למשך 60 שניות, שלב 2: דנטורציה ב-94°C למשך 30 שניות, שלב 3: חישול ב-58°C למשך 30 שניות, שלב 4: הארכה ב-72°C למשך 30 שניות, שלב 5: חזור לשלב 2 וחזור על הפעולה במשך 35 מחזורים, שלב 6: הארכה סופית ב-72°C למשך 30 שניות.<ol><li>השתמש באותם תנאי PCR עבור ply3' למעט זמן ההארכה בשלב 4 ושלב 6 שבו הוא אמור להיות 60 שניות.</li>
	</ol></li>
	<li>לנתח את מוצרי PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל הבלו את אמפליקון מן הג'ל.</li>
	<li>לטהר את אמפליקוני ה-PCR בהתאם לפרוטוקול המתואר בהוראות היצרן (טבלת חומרים).</li>
	<li>השתמש בכמויות שוות ערך של שתי זרועות ההומולוגיה כתבניות ב- SOE-PCR. התיך את שני האמפליקונים באמצעות פריימרים plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG), ו- plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTTTACCTTATCCTCTACC).</li>
	<li>השתמש בתנאי SOE-PCR הבאים (שלב 1: דנטורינג ב 94 ° C במשך 2 דקות, שלב 2: denaturing ב 94 ° C במשך 30 שניות, שלב 3: חישול 58 ° C עבור 30 שניות, שלב 4: הארכה ב 68 ° C עבור 60 שניות, שלב 5: לחזור לשלב 2 ולחזור במשך 25 מחזורים, שלב 6: הארכה סופית ב 68 ° C עבור 90 שניות).</li>
	<li>לנתח את המוצר SOE-PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל. הבלו אותו מן הג'ל באמצעות ערכת מיצוי ג'ל ופעל לפי ההוראות שסופקו.</li>
	<li>הגבירו את קלטת הספקטינומיצין מפלסמיד pR412 באמצעות תנאי ה-PCR הבאים: שלב 1: דנטורינג ב-94 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות, שלב 2: דנטורינג ב-94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, שלב 3: חישול ב-55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, שלב 4: הארכה ב-68 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות, שלב 5: חזור לשלב 2 וחזור על הפעולה במשך 25 מחזורים, שלב 6: הארכה סופית ב-68°C למשך 60 שניות.<ol><li>השתמש פריימרים BamHI_SP2F2 (GGATCC, CTA, GAA, CTA, GTG, GAT, CCC CC) ו- BamHI_SP2R2 (GGATCC, AAT, TCT, GCA, GAT, TTT, AC, ATG ATC). פלסמיד pR412 נרכשה מד"ר מארק פרודהום (CNRS-Universite Paul Sabatier, טולוז, צרפת).</li>
	</ol></li>
	<li>לנתח את אמפליקונים PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל. הבלו ולטהר את אמפליקון PCR המתקבל כמתואר לעיל.</li>
</ol>2. יצירת פלסמיד pSD1 וטרנספורמציה כימית של E. coli Dh5α
<ol><li>ביצוע קשירה בהתאם להוראות היצרן של מערכת pGEMT-easy I (טבלת חומרים). בצינור מיקרוצנטריפוגה, הוסף 5 μL של 2x חיץ קשירה, 1 μL של pGEMTeasy, 2 μL של המוצר ply_SOE, 1 μL של T4 DNA ligase ומים לנפח כולל של 20 μL. לדגור לילה ב 4 °C (75 °F). זה מייצר פלסמיד pSD1.</li>
	<li>הפוך E. coli Dh5α בעל יכולת כימית עם pSD1. התחל על ידי דגירה של 50 μL של E. coli Dh5α בעל כשירות כימית עם 3 μL של תגובת קשירה pSD1 למשך 15 דקות על קרח. לאחר מכן המשך על ידי חשיפת התאים להלם תרמי (42 ° C, 30 שניות). מניחים את התאים על קרח למשך 2 דקות.</li>
	<li>הסר את התאים מקרח והוסף 350 μL של מדיה S.O.C. לדגור את התרבות במשך 2 שעות ב 37 ° C, 120 סל"ד.</li>
	<li>צלחת את השינוי על לוריא ברטאני אגר (LBA) בתוספת 0.4 mM IPTG, 0.24 מ"ג / מ"ל X-Gal עבור בחירה כחול/לבן ו 100 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין כדי להבטיח שכל המושבות הגדלות בצלחת יש את עמוד השדרה פלסמיד. מושבות לבנות מכילות pSD1.</li>
	<li>בחרו שלוש מושבות לבנות והקימו גידולי לילה ב-10 מ"ל ליברות, בתוספת אמפיצילין של 100 מיקרוגרם/מ"ל. לדגור על התרביות במשך הלילה ב 37 °C (77 °F) עם רעידות.</li>
	<li>למחרת צנטריפוגו את התרביות בגודל 3,082 x גרם והשתמשו בגלולה להפקת פלסמיד.</li>
</ol>3. מיצוי DNA פלסמיד, הגבלת עיכול הגן pSD1 וספקטינומיצין והרכבת pSD2
<ol><li>לחלץ את DNA פלסמיד בהתאם להוראות שסופקו עם הערכה המסחרית (טבלה של חומרים).</li>
	<li>הגדר עיכול הגבלת BamHI הן עבור פלסמיד pSD1 והן עבור קלטת ספקטינומיצין שהוגברה וטוהרה בעבר. השתמש בתנאים ובכמויות הבאים המתוארים בטבלה 1.</li>
	<li>לדגור את הגבלת העיכול תגובות ובקרות ב 37 ° C במשך 3 שעות.</li>
	<li>לנתח את העיכול הגבלה על ידי אלקטרופורזה, הבלו את הרצועה ולטהר בהתאם להוראות שסופקו עם הערכה המסחרית (טבלה של חומרים).</li>
	<li>לאחר מכן, הכינו תגובת קשירה בהתאם להוראות היצרן (טבלת חומרים) באמצעות pSD1 וספקטינומיצין מעוכל BamHI (משלב 3.2). בצינור מיקרוצנטריפוגה, הוסף את רכיבי התגובה הבאים: 5 μL של 2x חיץ קשירה, 2 μL pSD1, 2 μL של קלטת ספקטינומיצין, 1 μL של T4 DNA ligase ודגור לילה ב 4 ° C. זה מייצר פלסמיד pSD2.</li>
	<li>הפוך פלסמיד pSD2 ל- E. coli Dh5α בעל יכולת כימית כמתואר בשלב 2.2.</li>
	<li>בחר את הטרנספורמנטים הנושאים פלסמיד pSD2 בהתבסס על יכולתם לגדול ב- LBA בתוספת 100 מיקרוגרם / מ"ל של ספקטינומיצין ואמפיצילין.</li>
	<li>ביצוע מיצוי DNA פלסמיד (pSD2) כמתואר לעיל ובהתאם להוראות היצרן (μL).</li>
</ol>4. טרנספורמציה של זן S. pneumoniae 519/43
<ol><li>הכינו תרבית לילה של S. pneumoniae 519/43 ב- BHI ואפשרו לו לגדול באופן סטטי ב 37 °C, 5% CO2.</li>
	<li>למחרת לדלל את התרביות 1:50 ו 1:100 ב 10 מ"ל של מרק BHI טרי. לדגור על התרביות באופן סטטי ב 37 ° C עד OD595nm הוא בין 0.05 ל 0.1 (רכישה אופטימלית של DNA קרוב יותר 0.1 OD).</li>
	<li>ברגע שמגיעים ל-OD של 0.1, לוקחים 860 μL ומעבירים לצינור מיקרוצנטריפוגה. באותו צינור מיקרוצנטריפוגה להוסיף: 100 μL של 100 mM NaOH, 10 μL של 20% (w/v) BSA, 10 μL של 100 mM CaCl 2,2 μL של 50 ng/mL CSP124 ו 500 ng של pSD2.</li>
	<li>לדגור את התגובה באופן סטטי ב 37 ° C במשך 3 שעות.</li>
	<li>צלחת 330 μL על 5% צלחות אגר דם (BA) בתוספת ספקטינומיצין 100 מיקרוגרם / מ"ל, כל שעה במשך 3 שעות הדגירה.</li>
	<li>לדגור על צלחות לילה ב 37 ° C, 5% CO2. מושבות עמידות בפני ספקטינומיצין טלאי על צלחת BA אחרת בתוספת ספקטינומיצין של 100 מיקרוגרם/מ"ל וכן על לוחות BA בתוספת 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין. יש לדגור על שתי מערכות הצלחות למשך הלילה בתנאים שצוינו לעיל. לוחות ampicillin הם לבדוק את נוכחותו של עמוד השדרה פלסמיד.</li>
	<li>אשר את נוכחותה של קלטת spectinomycin על ידי PCR באמצעות פריימרים plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) ו- SPEC_REV (TAATTCCTCTAAGTCATAATTTCCG). אשר את המוטציה על ידי PCR באמצעות פריימרים plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA) ו- plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT) המתחברים מחוץ לאזור שעבר מוטציה.</li>
	<li>אשר את האינטגרציה במיקום הנכון של הגנום על ידי ריצוף באמצעות פריימרים plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA), plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT), כמו גם פריימרים עם אתר הקישור שלהם בקלטת spectinomycin sqr1 (CCTGATCCAAACATGTAAGTACC) sqf2 (CGTAGTTATCTTGGAGAGAATA) spec_sqf1 (GGTACTTACATGTTTGGATCAGG ) ו- spec_sqr2 TATTCTCTCCAAGATAACTACG.</li>
</ol>

<ol><li>Bentley, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Analysis+of+the+Capsular+Biosynthetic+Locus+from+All+90+Pneumococcal+Serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic Analysis of the Capsular Biosynthetic Locus from All 90 Pneumococcal Serotypes.</a> PLoS Genetics. 2 (3), 31(2006).</li>
<li>Calix, J. J., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+pneumococcal+serotype%2C+11E%2C+has+a+variably+inactivated+wcjE+gene%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A new pneumococcal serotype, 11E, has a variably inactivated wcjE gene.</a> The Journal of Infectious Diseases. 202 (1), 29-38 (2010).</li>
<li>Park, I. H., Pritchard, D. G., Cartee, R., Brandao, A., Brandileone, M. C. C., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+New+Capsular+Serotype+%286C%29+within+Serogroup+6+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Discovery of a New Capsular Serotype (6C) within Serogroup 6 of Streptococcus pneumoniae.</a> Journal of Clinical Microbiology. 45 (4), 1225-1233 (2007).</li>
<li>Jin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+Report+of+Putative+Streptococcus+pneumoniae+Serotype+6D+among+Nasopharyngeal+Isolates+from+Fijian+Children%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">First Report of Putative Streptococcus pneumoniae Serotype 6D among Nasopharyngeal Isolates from Fijian Children.</a> The Journal of Infectious Diseases. 200 (9), 1375-1380 (2009).</li>
<li>Oliver, M. B., vander Linden, M. P. G., Küntzel, S. A., Saad, J. S., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+Streptococcus+pneumoniae+Serotype+6+Variants+with+Glycosyltransferases+Synthesizing+Two+Differing+Repeating+Units%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Discovery of Streptococcus pneumoniae Serotype 6 Variants with Glycosyltransferases Synthesizing Two Differing Repeating Units.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (36), 25976-25985 (2013).</li>
<li>Calix, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serological+Characterization+of+Two+Capsule+Subtypes+among+Streptococcus+pneumoniae+Serotype+20+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Serological Characterization of Two Capsule Subtypes among Streptococcus pneumoniae Serotype 20 Strains.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27885-27894 (2012).</li>
<li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((and+Serological+Characterization+of+a+New+Pneumococcal+Serotype%2C+6H%2C+and+Generation+of+a+Pneumococcal+Strain+Producing+Three+Different+Capsular+Repeat+Units%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunology%22%5BJournal%5D)">and Serological Characterization of a New Pneumococcal Serotype, 6H, and Generation of a Pneumococcal Strain Producing Three Different Capsular Repeat Units.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 22 (3), 313-318 (2015).</li>
<li>O'Brien, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+disease+caused+by+Streptococcus+pneumoniae+in+children+younger+than+5+years%3A+global+estimates%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates.</a> The Lancet. 374 (9693), 893-902 (2009).</li>
<li>Henriques-Normark, B., Tuomanen, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pneumococcus%3A+Epidemiology%2C+Microbiology%2C+and+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Pneumococcus: Epidemiology, Microbiology, and Pathogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (7), 010215(2013).</li>
<li>Leimkugel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Outbreak+of+Serotype+1+Streptococcus+pneumoniae+Meningitis+in+Northern+Ghana+with+Features+That+Are+Characteristic+of+Neisseria+meningitidis+Meningitis+Epidemics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">An Outbreak of Serotype 1 Streptococcus pneumoniae Meningitis in Northern Ghana with Features That Are Characteristic of Neisseria meningitidis Meningitis Epidemics.</a> The Journal of Infectious Diseases. 192 (2), 192-199 (2005).</li>
<li>Yaro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiological+and+Molecular+Characteristics+of+a+Highly+Lethal+Pneumococcal+Meningitis+Epidemic+in+Burkina+Faso%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Epidemiological and Molecular Characteristics of a Highly Lethal Pneumococcal Meningitis Epidemic in Burkina Faso.</a> Clinical Infectious Diseases. 43 (6), 693-700 (2006).</li>
<li>Antonio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+epidemiology+of+pneumococci+obtained+from+Gambian+children+aged+2-29+months+with+invasive+pneumococcal+disease+during+a+trial+of+a+9-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Molecular epidemiology of pneumococci obtained from Gambian children aged 2-29 months with invasive pneumococcal disease during a trial of a 9-valent pneumococcal conjugate vaccine.</a> BMC Infectious Diseases. 8 (1), 81(2008).</li>
<li>Kwambana-Adams, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+outbreak+of+pneumococcal+meningitis+among+older+children+%28%E2%89%A55+years%29+and+adults+after+the+implementation+of+an+infant+vaccination+programme+with+the+13-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine+in+Ghana%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">An outbreak of pneumococcal meningitis among older children (≥5 years) and adults after the implementation of an infant vaccination programme with the 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in Ghana.</a> BMC Infectious Diseases. 16 (1), 575(2016).</li>
<li>Antonio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seasonality+and+outbreak+of+a+predominant+Streptococcus+pneumoniae+serotype+1+clone+from+The+Gambia%3A+Expansion+of+ST217+hypervirulent+clonal+complex+in+West+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Seasonality and outbreak of a predominant Streptococcus pneumoniae serotype 1 clone from The Gambia: Expansion of ST217 hypervirulent clonal complex in West Africa.</a> BMC Microbiology. 8 (1), 198(2008).</li>
<li>Staples, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+an+Australian+serotype+1+Streptococcus+pneumoniae+outbreak%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of an Australian serotype 1 Streptococcus pneumoniae outbreak.</a> Epidemiology and Infection. 143 (2), 325-333 (2015).</li>
<li>Gessner, B. D., Mueller, J. E., Yaro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((African+meningitis+belt+pneumococcal+disease+epidemiology+indicates+a+need+for+an+effective+serotype+1+containing+vaccine%2C+including+for+older+children+and+adults%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">African meningitis belt pneumococcal disease epidemiology indicates a need for an effective serotype 1 containing vaccine, including for older children and adults.</a> BMC Infectious Diseases. 10 (1), 22(2010).</li>
<li>Hill, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasopharyngeal+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae+in+Gambian+infants%3A+a+longitudinal+study%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae in Gambian infants: a longitudinal study.</a> Clinical Infectious Diseases. 46 (6), 807-814 (2008).</li>
<li>Ebruke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+changes+in+nasopharyngeal+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae+serotype+1+genotypes+in+healthy+Gambians+before+and+after+the+7-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Temporal changes in nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae serotype 1 genotypes in healthy Gambians before and after the 7-valent pneumococcal conjugate vaccine.</a> PeerJ. 3, 90(2015).</li>
<li>Adegbola, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+and+antimicrobial+susceptibility+patterns+of+isolates+of+Streptococcus+pneumoniae+causing+invasive+disease+in+The+Gambia+1996-2003%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+Medicine+and+International+Health%22%5BJournal%5D)">Serotype and antimicrobial susceptibility patterns of isolates of Streptococcus pneumoniae causing invasive disease in The Gambia 1996-2003.</a> Tropical Medicine and International Health. 11 (7), 1128-1135 (2006).</li>
<li>Marks, L. R., Reddinger, R. M., Hakansson, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Levels+of+Genetic+Recombination+during+Nasopharyngeal+Carriage+and+Biofilm+Formation+in+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">High Levels of Genetic Recombination during Nasopharyngeal Carriage and Biofilm Formation in Streptococcus pneumoniae.</a> mBio. 3 (5), (2012).</li>
<li>Ritchie, N. D., Mitchell, T. J., Evans, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+different+about+serotype+1+pneumococci%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiology%22%5BJournal%5D)">What is different about serotype 1 pneumococci.</a> Future Microbiology. 7 (1), 33-46 (2012).</li>
<li>Harvey, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+variable+region+of+pneumococcal+pathogenicity+island+1+is+responsible+for+unusually+high+virulence+of+a+serotype+1+isolate%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The variable region of pneumococcal pathogenicity island 1 is responsible for unusually high virulence of a serotype 1 isolate.</a> Infection and Immunity. 84 (3), 822-832 (2016).</li>
<li>Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+splicing+by+overlap+extension%3A+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> BioTechniques. 8 (5), 528-535 (1990).</li>
<li>Alioing, G., Granadel, C., Morrison, D. A., Claverys, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competence+pheromone%2C+oligopeptide+permease%2C+and+induction+of+competence+in+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Competence pheromone, oligopeptide permease, and induction of competence in Streptococcus pneumoniae.</a> Molecular Microbiology. 21 (3), 471-478 (1996).</li>
<li>Lund, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLund%2C+E+%22Enumeration+and+description+of+the+strains+belonging+to+the+State+Serum+Institute%2C+Copenhagen+Denmark%22">Enumeration and description of the strains belonging to the State Serum Institute, Copenhagen Denmark</a>. , (1951).</li>
<li>Barany, F., Tomasz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Streptococcus+pneumoniae+by+heterologous+plasmid+deoxyribonucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Streptococcus pneumoniae by heterologous plasmid deoxyribonucleic acid.</a> Journal of Bacteriology. 144 (2), 698-709 (1980).</li>
<li>Terra, V. S., Homer, K. A., Rao, S. G., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+novel+%CE%B2-galactosidase+activity+that+contributes+to+glycoprotein+degradation+and+virulence+in+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Characterization of novel β-galactosidase activity that contributes to glycoprotein degradation and virulence in Streptococcus pneumoniae.</a> Infection and Immunity. 78 (1), (2010).</li>
<li>Terra, V. S., Zhi, X., Kahya, H. F., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumococcal+6-phospho-%CE%B2-glucosidase+%28BglA3%29+is+involved+in+virulence+and+nutrient+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Pneumococcal 6-phospho-β-glucosidase (BglA3) is involved in virulence and nutrient metabolism.</a> Infection and Immunity. 84 (1), (2015).</li>
<li>Harvey, R. M., Ogunniyi, A. D., Chen, A. Y., Paton, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumolysin+with+Low+Hemolytic+Activity+Confers+an+Early+Growth+Advantage+to+Streptococcus+pneumoniae+in+the+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Pneumolysin with Low Hemolytic Activity Confers an Early Growth Advantage to Streptococcus pneumoniae in the Blood.</a> Infection and Immunity. 79 (10), 4122(2011).</li>
<li>Terra, V. S., Plumptre, C. D., Wall, E. C., Brown, J. S., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+pneumolysin+deficient+mutant+in+Streptococcus+pneumoniae+serotype+1+strain+519%2F43+and+phenotypic+characterisation%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Construction of a pneumolysin deficient mutant in Streptococcus pneumoniae serotype 1 strain 519/43 and phenotypic characterisation.</a> Microbial Pathogenesis. 141, 103999(2020).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

דלקת ריאות סטרפטוקוקוס, במיוחד סרוטיפ 1, ממשיכה להוות איום עולמי הגורם למחלת פנאומוקוק פולשנית ולדלקת קרום המוח. למרות הכנסת חיסונים שונים שאמורים להגן מפני סרוטיפ 1, באפריקה סרוטיפ זה עדיין מסוגל לגרום להתפרצויות שיובילו לתחלואה ותמותה גבוהה13. היכולת לבצע מניפולציה גנטית בסרוטיפ זה היא בעלת חשיבות קריטית בגלל הרלוונטיות הקלינית שלו. השיטה המתוארת במחקר זה מאפשרת מניפולציה גנטית של זן מייצג בתוך סרוטיפ זה. זן פולשני 519/43 (ST5316), מבודד קליני מחולה דלקת קרום המוח בדנמרק<sup class="xref...

סטרפטוקוקוס דלקת ריאות (S. pneumoniae, הפנאומוקוקוס) הוא אחד הגורמים העיקריים לתחלואה ולתמותה ברחבי העולם. עד לאחרונה התגלו קרוב ל-100 סרוטיפים של S. pneumoniae 1,2,3,4,5,6,7. מדי שנה, מחלת פנאומוקוק פולשנית (IPD) טוענת לכ -700,000 מקרי מוות, של ילדים מתחת לגיל5 שנים 8. S. pneumoniae הוא הגורם העיקרי לדלקת ריאות חיידקית, דלקת אוזניים, דלקת קרום המוח ואלח דם ברחבי העולם9.
בחגורת דלקת קרום המוח האפריקאית, סרוטיפ 1 אחראי להתפרצויות דלקת קרום המוח, כאשר סוג הרצף (ST) ST217, סוג רצף אלים ביותר, דומיננטי 10,11,12,13,14,15. חשיבותו בפתולוגיה של דלקת קרום המוח הושוותה לזו של Neisseria meningitidis בחגורת דלקת קרום המוח האפריקאית16. סרוטיפ 1 הוא לעתים קרובות הגורם העיקרי ל- IPD; עם זאת, הוא נמצא לעתים רחוקות מאוד בכרכרה. למעשה, בגמביה, סרוטיפ זה אחראי ל -20% מכלל המחלות הפולשניות, אך הוא נמצא רק ב -0.5% מהנשאים הבריאים 14,17,18,19. החלפה גנטית ורקומבינציה בפנאומוקוקים מוסמכים מתרחשת בדרך כלל בהובלה ולא במחלה פולשנית20. יתר על כן, סרוטיפ 1 הוכח כאחד משיעורי ההובלה הקצרים ביותר המתוארים בקרב פנאומוקוקים (9 ימים בלבד). לכן, הוצע כי סרוטיפ זה עשוי להיות בעל שיעור רקומבינציה נמוך בהרבה מאחרים21.
יש צורך במחקרי עומק כדי להבין את הסיבה לשיעור ההובלה הנמוך של זני סרוטיפ 1 ואת חשיבותו במחלות פולשניות באפריקה שמדרום לסהרה.
כאן אנו מדווחים על פרוטוקול המאפשר מוטגנזה כלל-גנומית של זן סרוטיפ 1 מסוים, 519/43. זן זה יכול בקלות לרכוש ולשלב מחדש דנ"א חדש בגנום שלו. שיטה זו עדיין אינה בין-זנית, אך היא יעילה מאוד כאשר היא נעשית ברקע 519/43 (מטרות אחרות עברו מוטציה, כתבי יד בהכנה). פשוט על ידי שימוש בזן 519/43, וניצול היכולת הטבעית שלו, כמו גם החלפת האופן שבו הדנ"א האקסוגני מסופק, הצלחנו לשנות את הגן pneumolysin (ply) בזן סרוטיפ 1 זה. שיטה זו מייצגת שיפור מזה שהוצג על ידי Harvey et al.22 כפי שהוא נעשה בשלב אחד ללא צורך להעביר את הדנ"א דרך סרוטיפ אחר. עם זאת, ובשל השונות בין הזנים, אף שיטה לא תוקנה לכל הזנים. היכולת לבצע מוטציה בגנים ספציפיים ולצפות בהשפעותיהם תאפשר הבנה מעמיקה של זני סרוטיפ 1 S. pneumoniae ותספק תשובות לתפקידם של זנים אלה בדלקת קרום המוח באפריקה שמדרום לסהרה.

<table><tbody><tr><td>AccuPrime Pfx DNA פולימראז</td><td>Invitrogen</td><td>12344024</td><td>משמש להגברה של השברים</td></tr><tr><td>Ampicillin נתרן</td><td>מלח Sigma Aldrich</td><td>A9518</td><td>משמש לבחירת חיידקים בשלב 1 (pSD1)</td></tr> <tr><td>בסיס אגר דם</td><td>Oxoid</td><td>CM0055</td><td>משמש לצלחת S. pneumoniae טרנספורמטורים</td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>סיגמא</td><td>55470</td><td>משמש עבור S. pneumoniae טרנספורמציה</td></tr><tr><td>מוח עירוי לב</td><td>אוקסואיד</td><td>CM1135</td><td>המשמש לגידול S. pneumoniae תאים</td></tr><tr><td>סידן כלוריד Cacl2</td><td>Sigma</td><td>449709</td><td>המשמש עבור S. pneumoniae טרנספורמציה</td></tr><tr><td>יכולת מגרה פפטיד 1</td><td>AnaSpec</td><td>AS-63779</td><td>משמש לS. pneumoniae טרנספורמציה</td></tr><tr><td>מרק לוריא אגר</td><td>גיבקו</td><td>22700025</td><td>משמש לציפוי ובחירה של בסיס מרק לוריא pSD1 ו-pSD2</td></tr><tr><td>(הניסוח של מילר)</td> <td>Gibco</td><td>12795027</td><td>משמש לציפוי ובחירה של ערכת מיצוי ג'ל pSD1 ו-pSD2</td></tr><tr><td>Monarch</td><td>NEB</td><td>T1020S</td><td>משמש לחילוץ הרצועות מג'ל ה-DNA</td></tr><tr><td>Monarch Plasmid ערכת Miniprep</td><td>NEB</td><td>T1010S</td><td>משמשת לחילוץ פלסמיד מהתאים</td></tr><tr><td>pGEM T-easy</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td>המשמש כפלסמיד התאבדות</td></tr><tr><td>S.O.C.</td><td>Invitrogen</td><td>15544034</td><td>משמש לשחזור תאים לאחר טרנספורמציה</td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד (NaOH)</td><td>Sigma</td><td>S0899</td><td>המשמש לS.pneumoniae טרנספורמציה</td></tr><tr><td>ספקטינומיצין הידרוכלוריד</td><td>SigmaAldrich</td><td>PHR1426</td><td>משמש לבחירת חיידקים</td></tr><tr><td>יעילות תת-שיבוט DH5&alpha; תאים מוכשרים</td><td>Invitrogen</td><td>משמשים</td><td>18265017 ליצירת pSD1 ו- pSD2</td></tr></tbody></table>

בניית מוטנטים בסרוטיפ 1 סטרפטוקוקוס דלקת ריאות זן 519/43

Constructing Mutants in Serotype 1 Streptococcus pneumoniae strain 519/43

Streptococcus pneumoniae serotype 1 נותר בעיה עצומה במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית, במיוחד באפריקה שמדרום לסהרה. למרות חשיבותו, מחקרים בסרוטיפ זה עוכבו על ידי היעדר כלים גנטיים כדי לשנות אותו. במחקר זה אנו מתארים שיטה לשינוי גנטי של איזולט קליני של סרוטיפ 1 (זן 519/43). באופן מעניין, זה הושג על ידי ניצול יכולתו של הפנאומוקוק לרכוש דנ"א באופן טבעי. עם זאת, בניגוד לרוב הפנאומוקוקים, השימוש בדנ"א ליניארי לא היה מוצלח; כדי לשנות את הזן החשוב הזה, היה צורך להשתמש בפלסמיד מתאבד. מתודולוגיה זו סיפקה את האמצעים להבנה עמוקה יותר של סרוטיפ חמקמק זה, הן מבחינת הביולוגיה והן מבחינת הפתוגנים שלו. כדי לאמת את השיטה, הרעלן העיקרי הידוע של פנאומוקוק, פנאומוליזין, עבר מוטציה מכיוון שיש לו פנוטיפ ידוע וקל למעקב. הראינו שהמוטציה, כצפוי, איבדה את יכולתה ללדת תאי דם אדומים. על ידי היכולת לבצע מוטציה בגן חשוב בסרוטיפ המעניין, הצלחנו לצפות בפנוטיפים שונים לאובדן מוטציות תפקודיות בזיהומים תוך צפקיים ותוך אפיים מאלה שנצפו עבור סרוטיפים אחרים. לסיכום, מחקר זה מוכיח כי זן 519/43 (סרוטיפ 1) יכול להיות מהונדס גנטית.

הפרוטוקול המתואר כאן מתחיל בשימוש ב- PCR כדי להגביר את זרועות ההומולוגיה השמאלית והימנית, תוך מחיקת 191 bp מהאזור האמצעי של גן הרובד . בעת ביצוע ה-PCR מציגים אתר BamHI ב-3' של זרוע ההומולוגיה השמאלית ובקצה ה-5' של זרוע ההומולוגיה הימנית (איור 1A). אחריו מגיע PCR-SOE, שבו זרועות הומולוגיה שמאליות וימניות מאוחות לאמפליקון אחד (איור 1B). אמפליקון SOE-PCR זה משובט לאחר מכן לתוך pGEMTeasy באמצעות שיבוט TA כדי ליצור פלסמיד pSD1 (איור 1C</...

כאן אנו מתארים זן סרוטיפ 1 של S. pneumoniae serotype 1 519/43 שניתן להנדס גנטית באמצעות יכולתו לרכוש באופן טבעי DNA ופלסמיד מתאבד. כהוכחה עקרונית נוצרה מוטציה איזוגנית בגן הפנאומוליזין (ply).

Streptococcus pneumoniae serotype 1 remains a huge problem in low-and-middle income countries, particularly in sub-Saharan Africa. Despite its importance, ...

פרוטוקול זה משמעותי מכיוון שהוא מאפשר שינוי גנטי של סרוטיפ שלא ניתן היה לטפל בו בעבר, מה שמאפשר לחקור ולהבין את הסרוטיפ. זה פותח אפיקים לעבודה ביולוגית כמו פיתוח חיסונים. מי שתדגים את ההליך תהיה ונסה ס.טרה, עוזרת פרופסור מבית הספר להיגיינה ורפואה טרופית בלונדון.כדי להתחיל ליצור פלסמיד pSD1 על ידי ביצוע קשירה בהתאם להוראות היצרן pGEM-T Easy System I. דגרו את התגובה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, התמיר E.coli Dh5-alpha בעל יכולת כימית עם pSD1, דגירה של 50 מיקרוליטר מהתאים עם שלושה מיקרוליטרים של תגובת קשירת pSD1 למשך 15 דקות על קרח, ואז חשוף את התאים להלם תרמי והניח את התאים על קרח למשך שתי דקות.הסר את התאים מהקרח והוסף 350 מיקרוליטר של מדיה SOC ואז דגר על התרבית למשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס ו-120 סל"ד. צלחת את הטרנספורמציה על אגר לוריא-ברטאני בתוספת 0.4 מילי-מולרי IPTG, 0.24 מיליגרם למיליליטר X-Gal לבחירה כחול-לבן, ו-100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין כדי להבטיח שלכל המושבות הגדלות על הצלחת יש את עמוד השדרה של הפלסמיד. בחרו שלוש מושבות לבנות המכילות pSD1 והקימו גידולים בן לילה ב-10 מיליליטר של L-B בתוספת 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין.דגרו על התרביות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם טלטול. למחרת, צנטריפוגה את התרביות ב -3, 082 גרם והשתמש בגלולה למיצוי פלסמיד. לאחר חילוץ ה-DNA של הפלסמיד, הגדר עיכול הגבלת BamH1 הן עבור פלסמיד pSD1 והן עבור קלטת הספקטינומיצין.דגרו על תגובות העיכול והבקרות של ההגבלה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. בסיום ההגבלה, נתח את המוצרים על ידי אלקטרופורזה ולאחר מכן כרת את הרצועה הנכונה וטהר אותה באמצעות ערכה מסחרית. לאחר מכן, הפעל תגובת קשירה באמצעות pSD1 המעוכל BamH1 וספקטינומיצין.זה ייצור את הפלסמיד pSD2. הפוך את pSD2 ל-E.coli DH5-alpha בעל יכולת כימית כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, בחר את הטרנספורמנטים הנושאים פלסמיד pSD2 על סמך יכולתם לגדול ב-LBA בתוספת 100 מיקרוגרם למיליליטר של ספקטינומיצין ואמפיצילין ולחלץ את ה-DNA של הפלסמיד.הכינו תרבית לילה של S.pneumoniae 519/43 ב-BHI ואפשרו לו לגדול באופן סטטי ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. למחרת, יש לדלל את התרבויות 1:50 ו -1:100 ב -10 מיליליטר מרק BHI טרי. דגירה סטטית של התרבית ב-37 מעלות צלזיוס עד שה-OD ב-595 ננומטר הוא בין 0.05 ל-0.1.לאחר שמגיעים ל-OD המתאים, קחו 860 מיקרוליטר תרבית והעבירו אותה לצינור מיקרו-צנטריפוגה. הוסף 100 מיקרוליטר של נתרן הידרוקסיד 100 מילי-מולרי, 10 מיקרוליטר של 20% BSA, 10 מיקרוליטר של 100 מילי-מולרי סידן כלורי, שני מיקרוליטר של 50 ננוגרם למיליליטר CSP1 ו-500 ננוגרם של pSD2. דגרו את התגובה באופן סטטי ב-37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות.לאחר מכן, צלחו 330 מיקרוליטר על צלחות אגר דם של 5% בתוספת 100 מיקרוגרם למיליליטר ספקטינומיצין כל שעה במשך תקופת דגירה של שלוש שעות. לאחר מכן, דגרו את הלוחות למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. טלאו מושבות עמידות לספקטינומיצין על צלחת אגר דם אחרת בתוספת 100 מיקרוגרם למיליליטר ספקטינומיצין ועל צלחות אגר דם בתוספת 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין, הבודק את נוכחות עמוד השדרה של הפלסמיד.דגרו על שתי קבוצות הצלחות למשך הלילה. הרכבה נכונה של pSD2 אושרה על ידי עיכול הגבלה. לאחר מכן נעשה שימוש ב-pSD2 להפיכת 519.43 תאים מסוג פראי.מושבות שגדלו על ספקטינומיצין לאחר דגירה של לילה נחשבו לטרנספורמטורים חיוביים. אישור פנוטיפי של מוטציית הפנאומוליזין בוצע על ידי הערכת פעילות המוליטית עבור D39, 519/43 מסוג פרא ומוטציה 519/43 דלתא. זה הושווה להמוליזה של כדוריות דם אדומות ב-0.5% ספונין, שנחשב ל-100%המוטציה איבדה את יכולתה ליז כדוריות דם אדומות.כל המושבות החיוביות אושרו עוד יותר על ידי ריצוף כדי להעריך את מיקום ההחדרה. נעשה שימוש בפריימרים עם אתרי קשירה מחוץ לאזור ההומולוגיה. בעת ביצוע תגובת הטרנספורמציה, חשוב להוסיף את הריאגנטים בסדר הנכון.

constructing-mutants-serotype-1-streptococcus-pneumoniae-strain

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

(גני גן או epistasis) מסכים שיטתיים, בקנה מידה גדול סינטטיים גנטיים אינטראקציה יכולים לשמש כדי לחקור יתירות ומסלול-הצטלבות גנטית. כאן, אנו מתארים טכנולוגית תפוקה גבוהה כמותית סינטתית גנטית מערך הקרנה, כינת eSGA שפתחנו להבהרת יחסי epistatic ולחקור רשתות אינטראקציה גנטיות...

מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות מערכים גנטיים סינטטיים

מקור: בנט, ג'יי א. ואח'. הערכה חזותית ומיקרוסקופית של מוטציות התפתחותיות של Streptomyces . J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים את השימוש במיקרוסקופ ניגודיות פאזה כדי לבחון הבדלים פנוטיפיים בין Streptomyces coelicolor מסוג בר למוטנטי. הוא מתאר את השלבים הכרוכים בהכנה והדמיה של חוטי אוויר לאיתור פגמים התפתחותיים בהיווצרות נבגים.

מיקרוסקופ ניגוד פאזה להערכת מוטציות התפתחותיות בסטרפטומיצס

Streptococcus pneumoniae הוא פתוגן המוביל גורם לדלקת ריאות שנרכשה בקהילה קשה ואחראית ליותר מ -2 מיליון מקרי מוות ברחבי העולם. ההשפעה של גורמי חיידקים מעורבים בכושר או ארסיות יכולה להיות במעקב בזמן אמת במודל דלקת ריאות או בקטרמיה עכבר אקוטי באמצעות חיידקי bioluminescent.

בעקבות בזמן אמת השפעת גורמי דלקת ריאות ארסיים בעכבר דלקת ריאות דגם אקוטי באמצעות חיידקי Bioluminescent

הכנסת שינויים גנומיים מרובים לציאנובקטריה היא כלי חיוני בפיתוח זנים למטרות מחקר תעשייתי ובסיסי. אנו מתארים מערכת ליצירת מוטציות לא מסומנות במיני המודל הציאנובקטריאליים Synechocystis sp. PCC6803 ומוטציות מסומנות ב-Synechococcus sp. PCC7002.

הדור של מסומנים מוטאנטים Markerless במודל כחוליות המינים

אנו מתארים שיטה נתיישב, מהירה וזולה יחסית לדור של ג'ין-שיבשו סטרפטוקוקוס mutans זנים; טכניקה זו עשוי להיות מותאם לדור של ג'ין-שיבשו זנים של מינים שונים.

מהדור ג'ין-שיבשו סטרפטוקוקוס mutans זן בלי ג'ין שיבוט

Pseudomonas aeruginosa זיהום גורם תחלואה משמעותית מארחים פגיע. Nonredundant transposon ההכנסה מוטציה הספרייה של זן aeruginosa פ PA14, כמנהל PA14NR להגדיר, מקלה על ניתוח של ג'ין פונקציונליות בתהליכים רבים. המוצג כאן הוא פרוטוקול כדי ליצור עותקים באיכות גבוהה של ספריית מוטנטים PA14NR להגדיר.

שכפול של הוזמן, ספריית Nonredundant של Pseudomonas aeruginosa זן PA14 Transposon ההכנסה מוטציות

מתוארים כאן היא שיטה פשוטה לטיהור של מוצר הגן ב סטרפטוקוקוס מויזוף. טכניקה זו עשויה להיות יתרון על טיהור של חלבונים, בעיקר חלבונים הממברנה וחלבונים המוניים גבוה המולקולרי, והוא יכול לשמש עם מינים שונים חיידקים אחרים.

טיהור חלבון המסה המולקולרי הגבוה בסטרפטוקוקוס

הרחבת קוד גנטי מוחלת על הקדמה של חומצת אמינו לא טבעית הנושאת קבוצה פונקציונלית ביורטוגונלית על חלבון נשא באתר מוגדר. הפונקציה biorthogonal משמש עוד יותר עבור צימוד סלקטיבי האתר של אנטיגן פחמימות כדי לספק חיסון גליקוקוג'וג'וגייט הומוגני.

גליקוקוג'גייט הומוגני המיוצר על ידי התאגדות חומצת אמינו לא טבעית משולבת וכימיה לחץ למטרות חיסון

מערכת רקומבינציה בתיווך λ-Red שימשה ליצירת מוטציית מחיקה של מיקרופון RNA קטן שאינו מקודד.

RNA קטן שאינו מקודד תורם לאלימות בחלבוני הממברנה החיצונית בסלמונלה אנטריטידיס

כאן, אנו מתארים את הבנייה של מוטציות ריקות של אירומונס בגליקוזילטרנספראזות ספציפיות או באזורים המכילים גליקוזילטרנספראזות, מבחני תנועתיות וטיהור פלגלה שבוצעו כדי לבסס את המעורבות והתפקוד של האנזימים המקודדים שלהם בביוסינתזה של גליקאן, כמו גם את תפקידו של גליקאן זה בפתוגנזה חיידקית.

יצירת מוטציות ריקות כדי להבהיר את תפקידם של גליקוזילטרנספראזות חיידקיות בתנועתיות חיידקית

מאמר זה מתאר מודל עכברי חדשני למעבר של פנאומוקוק ממתיישב אסימפטומטי לפתוגן הגורם למחלה במהלך זיהום ויראלי. מודל זה יכול להיות מותאם בקלות לחקר אינטראקציות מיקרוביאליות ומארח-פתוגן במהלך השלבים השונים של התקדמות המחלה ועל פני מארחים שונים.

מודל עכברי למעבר של דלקת ריאות סטרפטוקוקוס מקולונייזר לפתוגן עם זיהום משותף ויראלי מחזיר מחלה המחמירה בגיל

למד שיטה ליצירת מוטנטים איזוגניים ב-Streptococcus pneumoniae סרוטיפ 1 באמצעות פלסמיד pSD1 ותסיסה ב-E. coli. פרוטוקול זה מאפשר מחקר פתוגנזה ופיתוח חיסונים.

בניית מוטנטים בסרוטיפ 1 סטרפטוקוקוס דלקת ריאות זן 519/43

גלה סרטונים נוספים