הערכה תפקודית של קינזין-7 CENP-E בזרעונים באמצעות עיכוב Vivo , אימונופלואורסנציה וציטומטריית זרימה

מיוזה היא אירוע אבולוציוני שמור באיקריוטים, החיוני לגמטוגנזה ולרבייה מינית. הפרוטוקול שלנו מספק שיטה יעילה למחקרים של חלוקה מיוטית ו spermatogenesis. תיארנו סדרה של פרוטוקולים לניתוח זרעונים.

ניתן ליישם טכניקה זו לתצפית על ציר מיוטי, כרומוזומים הומולוגיים והאברונים התת-תאיים בזרעונים. שיטה זו יכולה לשמש לניתוח חלוקה מיוטית, יצירת מודלים של בעלי חיים לעריכת גנים והעברת גנים ברקמות או באיברים. נסיינים צריכים לשמור על סביבה סטרילית במהלך ניתוח בטן, ולשים לב לטמפרטורה, לזמן ולתנאי הניסוי העיקריים של פרוטוקול זה.

מי שתדגים את ההליך תהיה מיס מנג-פיי שו, בוגרת תואר שני מהמעבדה שלי. התחל את הבנייה של מודל עכבר המעכב חלבון צנטרומר מתווך GSK923295 E או CENP-E על ידי קשירת גפי העכבר המורדים וקיבוע שלהם על מגש השעווה. לאחר חיטוי אזור הניתוח, השתמש באזמל סטרילי כדי ליצור פתח של חמישה מילימטרים בחלל הבטן של העכבר ואחריו הנחת מלחציים כירורגיים סטריליים על העור.

לאחר מכן משכו את כרית השומן האפידידימלית עם מלקחיים מנתחים סטריליים כדי לאתר את האשכים בעזרת פינצטה סטרילית. לאחר קיבוע האשכים עם מלקחיים סטריליים תחת סטריאוסקופ, להזריק לאט 10 מיקרוליטר של GSK923295 לתוך צינוריות seminiferous בריכוז סופי של 10 micromolar באמצעות 10 מיקרוליטר של ריודין. בסיום, דוחפים את האשכים חזרה לחלל הבטן ותופרים את אתר הניתוח כמתואר בכתב היד של הטקסט.

עבור התייבשות הדרגתית של אשכי העכבר שנאספו, לדגור ברצף את הדגימה במדיות שונות כמתואר בכתב היד. לאחר הדגירה הסדרתית, מניחים את הרקמה בתחתית קופסת ההטבעה ומוסיפים את הפרפין המומס לקופסה. למיצוק מלא של הפרפין, מצננים את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס למשך שש שעות.

לאחר מכן, קבע את הדגימה על מחזיק האולטרה מיקרוטום תוך שמירה על הזווית בין הדגימה לבין משטח הסכין על 5 עד 10 מעלות. התאימו את עובי הפרוסה לחמישה מיקרומטרים כדי להכין את המקטעים בעובי חמישה מיקרומטר באמצעות מיקרוטום אולטרה. לאחר ההכנה, יש למרוח את המגלשה לדוגמה באמבט מים בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס לפני ייבוש החלקים במייבש המגלשה למשך 12 שעות בחום של 37 מעלות.

לאחר 12 שעות, בצע דגירה רציפה של השקופיות כפי שהוסבר קודם לכן. לאחר מכן, שטפו את המגלשות במים מזוקקים במשך חמש דקות ולאחר מכן הכתימו בתמיסת המטוקסילין של מאייר במשך שש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן שטפו את המגלשות המוכתמות במים זורמים במשך חמש דקות ודגרו במים מזוקקים במשך שתי דקות.

יש לדגור על המגלשות באתנול הידרוכלוריד 1% למשך שלוש שניות ולאחר מכן לשטוף ולזרום במים זורמים במשך שתי דקות. הכתימו את הדגימה ב-1%eosin למשך 15 שניות, ולאחר מכן דגירה סדרתית. בסיום, אטמו את המגלשות באמצעות 15 מיקרוליטר של מסטיק נייטרלי וכיסוי של 24 על 50 מילימטר.

עבור immunofluorescence, מניחים את השקופית בתמיסת אחזור האנטיגן לרתיחה בלחץ גבוה בסיר לחץ למשך ארבע דקות לשליפת אנטיגן. לאחר מכן קררו את המגלשה באופן טבעי לטמפרטורת החדר לפני ששטפו פעמיים במים מזוקקים במשך חמש דקות ועם PBS במשך חמש דקות. כדי לחדור לתאים, דגרו על המגלשה ב-500 מיקרוליטר של 0.25% טריטון X-100 ב-PBS למשך 10 דקות ולאחר מכן שטפו את המגלשות עם PBS במשך חמש דקות שלוש פעמים.

לחסימת אנטיגן, יש לדגור על הדגימה עם 300 מיקרוליטר אלבומין או BSA בסרום בקר 3% למשך שעה אחת ועם הנוגדנים הראשוניים ב-3% BSA ב-PBST למשך 16 שעות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, הניחו את המגלשה בקופסה לחה כדי למנוע מהרקמות להתייבש. חממו מחדש את המגלשות באופן טבעי לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

יש להשליך את הנוגדן הראשוני, ולאחר מכן לשטוף את השקופית ב-PBST במשך חמש דקות שלוש פעמים. לדלל נוגדנים משניים עם 3% BSA ו- PBST. לאחר מכן לדגור את הדגימה עם נוגדנים משניים מדוללים במשך שעה עד שעתיים ב 37 מעלות צלזיוס.

לאחר שטיפת הדגימה ב-PBST במשך חמש דקות חמש פעמים, יש להכתים את הגרעינים ב-DAPI של 50 מיקרוליטר למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הרכיבו את הכיסוי עם אמצעי ההרכבה נגד דהייה ואטמו את הכיסוי עם לק. עבור ציטומטריית זרימה, לאסוף אשכי עכבר בצלחות פטרי שישה סנטימטרים לחתוך את האשכים לחתיכות מילימטר מעוקב אחד באמצעות מספריים כירורגיים.

לאחר מכן לעכל את האשכים במיליליטר אחד של 1% collagenase בצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כדי לזרז תאים ספרמטוגניים, צנטריפוגה את הדגימה ב 1, 000 G במשך חמש דקות ולהשליך את supernatant לפני הוספת מיליליטר אחד של 0.25% תמיסת EDTA טריפסין בדגימה במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. מאוחר יותר, צנטריפוגה את הדגימה ב 1, 000 G במשך חמש דקות.

השליכו את הסופרנאטנט כדי לדגור על התאים המואצים במיליליטר אחד של אתנול קר 70% למשך יותר משמונה שעות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה ב 1, 000 גרם במשך חמש דקות, לאסוף משקעי תאים ולהכתים את התאים spermatogenic עם 500 microliters propidium יודיד או PI צביעת פתרון ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, סננו את הדגימה באמצעות רשת 300 רשת כדי לסלק פסולת תאים ואספו את התאים בצינור זרימה כדי לאחסן את התאים בארבע מעלות צלזיוס.

זיהוי אותות פלואורסצנטיים ופיזור אור באורך גל עירור של 488 ננומטר באמצעות ציטומטר זרימה. נתח את תוכן הדנ"א בדגימה ופיזור האור באמצעות תוכנת ModFit MF LT 32. לאחר הזרקת GSK923295 באשכים, הגל הזרעוני השתנה בצינוריות הזרע עקב עיכוב CENP-E.

עם זאת, הגל הזרעוני בצינוריות הזרע היה סדיר ומאורגן בקבוצת הביקורת. נצפה כי מספר כרומוזומים הומולוגיים לא היו מיושרים בלוח המשווני לאחר עיכוב CENP-E. יתר על כן, עיכוב CENP-E הוביל לעלייה של זרעונים metaphase I בצינוריות זרע.

ניתוח האימונופלואורסנציה הדגים את הירידה במספר התאים החיוביים של קומפלקס אנטי-סינפטונמלי שלושה או SYCP3 לכל צינורית זרע לאחר עיכוב CENP-E. מצד שני, נקודות SYP3 לכל תא מטאפאזי ומתיחות SYP3 לכל תא לא הושפעו בקבוצות GSK92395. המרחקים של קטבי ציר בזרעונים מסוג Metaphase I גדלו עקב עיכוב CENP-E.

הניתוח המייצג מראה כי עיכוב CENP-E הביא לירידה בתאי הפלואידים בקבוצת GSK 923295 בהשוואה לקבוצת הביקורת. היחסים בין התאים הדיפלואידים לתאים האנאופלואידיים לא הושפעו באופן משמעותי לאחר עיכוב CENP-E. לעומת זאת, היחסים בין תאי הטטרפלואידים גדלו בקבוצת GSK923295 מאשר בקבוצת הביקורת.

ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה של תאי הזרע הראה את הארגון המשובש של תאי הזרע בקבוצת GSK923295. על הנסיין לשים לב לתנוחת ההזרקה, מינון התרופה, שיטת ההזרקה ושיטת התפרים במהלך ניתוח בטן והזרקת אשכים. טכניקה זו, יחד עם אלקטרופורציה in vivo המתמקדת בחלבונים הממוקדים ובכלי עריכת הגנים, יכולה לשמש בתחום החלוקה המיוטית והזרע.