Name: חלבונים Immunofluorescence ניתוח של אנדוגני אקסוגניים centromere-קינטוכור (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: למדו שיטת צביעת immunofluorescence עקיפה לאופטימיזציה של לוקליזציה וכימות חלבוני centromere-kinetochore אנדוגניים ואקסוגניים בתאי אדם. הפרוטוקול מאפשר זיהוי וכימות רמות חלבון בשלבי אנאפזה שונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי GM68418 מענק NIH.

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

בשנים האחרונות מחקרים רבים פתחו מבחני מיקרוסקופיה כמותיים שונים עבור תאים קבועים. 42 התקדמות בביולוגיה-קינטוכור centromere לעתים קרובות דורש הבנה של קינטוכור ספציפי הספציפי centromere או תפקודם של חלבונים אשר מרחבית-טמפורלית subcellular תקנה משקפת את הפונקציות המשתנות של חלבונים אלה במהלך מחזור התא. לכן, כאן פתחנו שיטות מכתימות IIF וכן assay IIF כמותית לנתח את הרמות היחסיות במיוחד של אנדוגני וחלבוני CENP-A אקסוגניים, אשר יכול להיות רלוונטית בדגימות יחס שונה. נכון לעכשיו...

&quot;צנטרומר&quot; הוגדר קלסי כאזורים של רקומבינציה meiotic מורחקת בגנטיקה ומאוחר יותר הוכר ההתכווצות העיקרית של הכרומוזומים mitotic, אשר ממלאת תפקיד חיוני פרדת כרומוזום מדויקת במהלך מיטוזה. &quot;קינטוכור&quot; תואר מבנים הרבים השכבתיים אשר נקלטים על ידי microtubules על פני השטח של צנטרומר, כפי שהיא מתגלה על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים; &quot;קינטוכור&quot; הוגדרו מאוחר כמתחם macromolecular שמתאימה בבית centromere של הכרומוזומים mitotic. למרות הבדלים דרמטיים של רצפי DNA centromeric בין חוליות, מבנה קינטוכור ורכב הם שמורים ביותר. אינטראקציה דינמית בין microtubules ציר ואת קינטוכור נדרשת הפרדה נאמן של הכרומוזומים במהלך מיטוזה, ופגמים בעופרת פונקציה centromere-קינטוכור כדי aneuploidy ובכך סרטן. Centromere ברוב אאוקריוטיםאין רצף DNA מוגדר, אבל מורכב מערכים גדולים (0.3-5 Mb) של DNA alphoid החוזר מורכב 171-נ&quot;ב DNA α-הלווין. למעט ניצני שמרים, זהות centromere מושגת לא על ידי רצף ה- DNA אלא על ידי נוכחות של הנוקלאוזום מיוחד המכיל את גרסה H3 היסטון CenH3 (חלבון centromere [CENP-א] בבני אדם). 5 נוקלאוזום CENP-A למקם אל צלחת פנימית של קינטוכור יונק 7 ו נקשר לדנ&quot;א 171-נ&quot;ב α-הלווין. צנטרומר Active דורש CENP-A-המכיל נוקלאוזום לכוון את הגיוס של רשת centromere קשור מכוננת (CCAN) והחלבונים קינטוכור, שביחד להסדיר את הקובץ המצורף של הכרומוזומים אל ציר mitotic והתקדמות מחזור לאחר מכן במחסום הכישור. לאור הראיות הנ&quot;ל, CENP-A הוצע להיות סימן אפיגנטיים של centromere 8; עם זאת, התהליך שבאמצעותו-A CENP משולב iDNA centromeric n כדי וגורמי אחראי התאגדות זה טרם מאופיין היטב. תחום קצר מיקוד-centromere (CATD) מתגורר היסטון לקפל באזור CENP-A, והחלפת באזור המקביל H3 עם CATD מספיקה כדי H3 ישירה centromere. 9 מספר מחקרים הציעו תפקידים פונקציונאליים-translational פוסט שינוי (PTM) של CENP-A 12-16; עם זאת, המנגנונים המולקולריים של PTMs אלה של-A CENP בגיוס כדי צנטרומר טרם הובהר. דיווחנו בעבר כי CUL4A-RBX1-COPS8 פעילות האנזים E3 נדרש CENP-A K124 ubiquitylation ולוקליזציה של CENP-א &#39;עד צנטרומר. 17 התגלית ואפיון של חלבונים קינטוכור הובילו לתובנה חדשה לגבי הפרדה כרומוזום. 18 יותר מ -100 רכיבים קינטוכור זוהו בתאים חוליות ידי גישות שונות. 19,20 תחתמעמדו של איך קינטוכור להרכיב ותפקוד מגיע גם מן האפיון של התפקודים התאיים של כל חלבוני centromere-קינטוכור ורשת החלבונים בתוך תאים. 19 להדמיה ישירה ושיטות הדמיה מתקדמת מיקרוסקופ פלואורסצנטי לספק רזולוציה מרשימה של רכיבים-קינטוכור centromere ולאפשר תצפית ישירה של רכיבים מולקולריים ייחודיים של צנטרומר ו קינטוכור. בנוסף, שיטות immunofluorescent העקיף (IIF) מכתים באמצעות נוגדנים ספציפיים הם קריטיים תצפיות אלה. עם זאת, למרות דיווחים רבים על פרוטוקולים IIF, כמה דנו בבעיות פרט חלבונים centromere-קינטוכור ספציפיים. 1-4 לפיכך, פיתוח ודיווח שיטות מכתים IIF וכן assay IIF כמותית לנתח באופן ספציפי כל חלבון centromere-קינטוכור חשוב מאוד. בשנת מכתים IIF, אחד צריך להמשיך עם הפרוטוקול המכתים כדי למנוע אובדן של החלבון של עניין אושאר התא. עם זאת, קיבעון הורס אתרים אנטיגני מדי פעם, ושילובי נוגדן-אנטיגן שונים לעבוד היטב עם מקבע אחד, אבל טוב מאוד עם אחר, 21 ובחירה מקבע תלויים במידה רבה על החלבון (ים) של עניין. לכן, שיטות מקבעים שונות הן קריטיות מכתים IIF של חלבונים-קינטוכור centromere. הנה שיטות אופטימיזציה של immunofluorescent עקיף (IIF) מכתים ו assay להתייחס לוקליזציה של חלבונים centromere-קינטוכור אנדוגני, כולל CENP-A ודגל מתוייגים אקסוגניים חלבונים CENP-A, ו לכמת את החלבונים האלה בתאים אנושיים פותחו. ניתן ליישם שיטות אלה כדי הניתוח של חלבונים-קינטוכור centromere במינים אחרים.

<table><tbody><tr><td>Lipofectamin 2000</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>11668</td><td>מגיב טרנספקציה I</td></tr><tr><td>Lipofectamin RNAiMAX</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>13778</td><td>מגיב טרנספקציה II</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>31985</td><td>מדיה מופחתת בסרום, חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש</td></tr><tr><td>DMEM בעל גלוקוז גבוה (Dulbecco' s שונה Eagle' s medium)</td><td>Life Technologies/BioWhittaker</td><td>12-604</td><td>DMEM עתיר גלוקוז, חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי, מאושר, מושבת בחום, ממקור ארה"ב</td><td>Life Technologies/Gibco</td><td>10082</td><td>FBS (סרום בקר עוברי)</td></tr><tr><td>פולי-L-ליזין תמיסת</td><td>סיגמא-סלדריך</td><td>P 8920</td><td>פולי-L-ליזין, 0.1% משקל/נ"ך, במים</td></tr><tr><td>UltraPure Distilled Water</td><td>Life Technologies/Invitrogen/Gibco</td><td>10977</td><td>מים בדרגת תרבית רקמות סטריליות&nbsp;</td></tr><tr><td>זכוכית Micro Cover (22 מ"מ x 22 מ"מ)&nbsp;</td><td>Surgipath</td><td>105</td><td>כיסוי זכוכית (22 מ"מ x 22 מ"מ)&nbsp;</td></tr><tr><td>אשכול תרבית תאים 6 בארות</td><td>פישר/קורנינג משולב</td><td>07-200-83</td><td>צלחת פוליסטירן 6 בארות&nbsp;</td></tr><tr><td>פניצילין, סטרפטומיצין; נוזל</td><td>פישר/גיבקו</td><td>15-140</td><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td></tr><tr><td>PAP PEN&nbsp;</td><td>אתר קשירה</td><td>AD100.1</td><td>עט מחסום הידרופובי (למחסום דוחה מים בצביעה אימונופלואורסצנטית)</td></tr><tr><td>פקליטקסל (טקסול)</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>T7402</td><td>טקסול לניתוח תאים מיטוטיים</td></tr><tr><td>TN-16, מעכב מיקרו-צינורות (TN16)</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-T120</td><td>TN16 לניתוח תאים מיטוטיים</td></tr><tr><td>BSA (אלבומין בסרום בקר)</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>A7906</td><td>מגיב חוסם</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>T8787</td><td>חומר ניקוי לחדירה</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P6148</td><td>ריאגנט קיבוע</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>D9542</td><td>לצביעה גרעינית</td></tr><tr><td>p-phenylenediamine</td><td>SIGMA-SLDRICH</td><td>P6001</td><td>להרכבת</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרו VWR בינוניות, חלבית</td><td>VWR International</td><td>48312-013</td><td>מיקרו שקופיות&nbsp;</td></tr><tr><td>נוגדן נגד CENP-A</td><td>Stressgen/Enzo Life Sciences</td><td>KAM-CC006</td><td>נוגדן חד שבטי לעכבר; יחס דילול של 1:100 (IIF), 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>נוגדן נגד CENP-B נוגדן חד</td> שבטי <td>Novus Biologicals</td><td>H00001059-B01P</td><td>עכבר; יחס דילול של 1:200 (IIF, קיבוע מתנול/אצטון)-1:400 (IIF, קיבוע פרפורמלדהיד)</td></tr><tr><td>נוגדן נגד CENP-B&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab25734</td><td>נוגדן רב-שבטי של ארנב; יחס דילול של 1:200 (IIF, קיבוע מתנול/אצטון) -1:400 (IIF, קיבוע פרפורמלדהיד)</td></tr> <tr><td>נוגדן נגד צנטרומר (ACA)</td><td>פיצג'רלד תעשיות אינטרנשיונל, בע"מ.</td><td>90C-CS1058</td><td>אנטי-סרום צנטרומר אנושי; יחס דילול של 1:2000 (IIF)</td></tr><tr><td>נוגדן נגד CENP-H</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>BL1112 (A400-007A)</td><td>נוגדן רב-שבטי של ארנב; יחס דילול של 1:200 (IIF)</td></tr><tr><td>נוגדן נגד CENP-H</td><td>BD</td><td>612142</td><td>נוגדן חד שבטי לעכבר; יחס דילול של 1:200 (IIF)</td></tr><tr><td>נוגדן נגד CENP-I</td><td>N/A, ד"ר קטוסמי קיטאגאווה</td><td>N/A, ד"ר קטוסמי קיטאגאווה</td><td>נוגדן רב-שבטי של ארנב; יחס דילול של 1:1000 (IIF); Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006)</td></tr><tr><td>נוגדן נגד KNL1</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-89223</td><td>נוגדן רב-שבטי של ארנב; יחס דילול של 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>נוגדן Anti-Hec1</td><td>Novus Biologicals / GeneTex</td><td>NB 100-338 / GTX70268</td><td>נוגדן חד שבטי לעכבר; יחס דילול של 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>נוגדן Anti-Hec1</td><td>GeneTex</td><td>GTX110735</td><td>נוגדן רב-שבטי של ארנב; יחס דילול של 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>נוגדן נגד Ska1</td><td>abcam</td><td>ab46826</td><td>נוגדן רב-שבטי של ארנב; יחס דילול של 1:100 (IIF)</td></tr><tr><td>נוגדן נגד דגל</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F3165</td><td>נוגדן חד שבטי לעכבר; יחס דילול של 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>נוגדן נגד דגל</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F7425</td><td>נוגדן רב-שבטי של ארנב; יחס דילול של 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>Anti-CUL4A נוגדן</td><td>N/A, ד"ר Pradip Raychaudhuri</td><td>N/A, ד"ר Pradip Raychaudhuri</td><td>Rabbit נוגדן רב-שבטי; יחס דילול של 1:3000 (WB); שיאנוב ואחרים, כתב העת לכימיה ביולוגית, 35309-35312 (1999)</td></tr><tr><td>נוגדן נגד RBX1</td><td>איתות תאים</td><td>4397</td><td>נוגדן רב-שבטי של ארנב; יחס דילול של 1:2000 (WB)</td></tr><tr><td>נוגדן נגד GAPDH</td><td>Chemicon</td><td>MAB374</td><td>נוגדן חד שבטי לעכבר; יחס דילול של 1:5000 (WB)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11001</td><td>נוגדן משני מצומד פלואורופור (נוגדן משני מטוהר זיקה)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11005</td><td>נוגדן משני מצומד פלואורופור (נוגדן משני מטוהר זיקה)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11008</td><td>נוגדן משני מצומד פלואורופור (נוגדן משני מטוהר זיקה)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Life Technologies/Invitrogen</td><td>A11012</td><td>נוגדן משני מצומד פלואורופור (נוגדן משני מטוהר זיקה)</td></tr><tr><td>אבקת חלב ללא שומן (תחליף מאושר לאבקת חלב ציפורן)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9255871 (הזמנה מחדש מס' 190915; לוט # 90629)</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי ממונע Leica DM IRE2 חלב רזה&nbsp;</td><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי ממונע</td> <td>של Leica</td><td></td>&nbsp;</tr><tr><td>HCX PL APO 63x עדשת טבילה בשמן</td><td>Leica</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 שמן PH 3 CS</td><td>63X עדשת טבילה בשמן</td></tr><tr><td>HCX PL APO 100x עדשת טבילה בשמן</td><td>Leica</td><td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 שמן PHE</td><td>100X עדשת טבילה בשמן</td></tr><tr><td>Leica EL6000 מקור אור קומפקטי</td><td>Leica</td><td></td><td>מקור אור קומפקטי חיצוני לעירור פלורסנט</td></tr><tr><td>ORCA-R2 מצלמת CCD דיגיטלית&nbsp;</td><td>מצלמת CCD דיגיטלית</td> <td>Hamamatsu</td><td>C10600-10B</td>&nbsp;</tr><tr><td>Openlab גרסה 5.5.2 תוכנת הדמיה מדעית&nbsp;</td><td>פרקין אלמר/אי-אספקה</td><td></td><td>לתצפית, רכישה, כימות וניתוח תמונה,</td></tr><tr><td>גרסה 6.1.1 תוכנה לניתוח תמונות תלת מימד&nbsp;</td><td>פרקין אלמר / אימספקציה</td><td></td><td>לתצפית תמונה, רכישה, כימות וניתוח</td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז שלם ללא EDTA קוקטייל מעכב</td><td>פרוטאז Roche</td><td>11873580001/11836170001</td><td>טבליות קוקטייל מעכב פרוטאז</td></tr><tr><td>PlusOne 2-D Quant Kit</td><td>Amersham Biosciences</td><td>80-6483-56</td><td>מגיב בדיקת חלבון מסחרי I למדידת ריכוז החלבון (תואם ל-2% SDS)</td></tr><tr><td>בדיקת חלבון</td><td>Bio-Rad Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td>מגיב לבדיקת חלבון מסחרי II למדידת ריכוז חלבון (תואם ל-0.1% SDS)</td></tr><tr><td>Immobilon-FL</td><td>EMD Millipore</td><td>IPFL00010</td><td>ממברנת PVDF להעברת</td></tr><tr><td>IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-32210</td><td>IR נוגדן משני מצומד צבע פלואורסצנטי (נוגדן משני מטוהר זיקה); יחס דילול של 1:20000 (IIF)</td></tr><tr><td>IRDye 680 עז נגד ארנב IgG</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-32221</td><td>נוגדן משני מצומד צבע פלואורסצנטי IR (נוגדן משני מטוהר זיקה); יחס דילול של 1:20000 (IIF)</td></tr><tr><td>עז נגד עכבר IgG DyLight 549</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI35507</td><td>נוגדן משני מצומד DyLight IR נוגדן משני מצומד צבע פלואורסצנטי (נוגדן משני מטוהר זיקה); יחס דילול של 1:20000 (IIF)</td></tr><tr><td>עיזים נגד ארנב DyLight 649</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI35565</td><td>נוגדן משני מצומד DyLight נוגדן משני מצומד בצבע פלואורסצנטי IR (נוגדן משני מטוהר זיקה); יחס דילול של 1:20000 (IIF)</td></tr><tr><td>נוגדן נגד עכבר עיזים IgG-HRP</td><td>סנטה קרוז</td><td>SC-2005</td><td>נוגדן משני מצומד HRPנוגדן משני מצומד DyLight נוגדן משני מצומד צבע פלואורסצנטי IR (משני מטוהר זיקה נוגדן); יחס דילול של 1:10000 (IIF)</td></tr><tr><td>נוגדן משני מצומד עיזים IgG-HRP</td><td>סנטה קרוז</td><td>SC-2004</td><td>נוגדן משני מצומד HRPנוגדן משני מצומד DyLight נוגדן משני מצומד בצבע פלואורסצנטי IR (נוגדן משני מטוהר זיקה); יחס דילול של 1:10000 (IIF)</td></tr><tr><td>Openlab גרסה 5.5.2. תוכנת הדמיה מדעית&nbsp;</td><td>Improvision/PerkinElmer</td><td></td><td>Software A</td></tr><tr><td>Volocity גרסה 6.3 תוכנה לניתוח תמונה תלת מימדית (רכישת Volocity)</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Software B1</td></tr><tr><td>Volocity גרסה 6.3 תוכנה לניתוח תמונות תלת מימד (כימות Volocity)</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Software B2</td></tr><tr><td>Branson SONIFIER 450</td><td></td><td></td><td>Sonicator</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, מוצק, הברגה 9.5 מ"מ</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>&nbsp; 33995-325</td><td>צופר משבש לסוניקציה</td></tr><tr><td>סוניקטור ברנסון אולטרסאונד מיקרוטיפ מחודד 6.5 מ"מ</td><td>VWR Scientific Products Inc.</td><td>&nbsp; 33996-185</td><td>מיקרו-טיפ לסוניקציה</td></tr><tr><td>מערכת הדמיה אינפרא אדום Odyssey CLx&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>מערכת הדמיה אינפרא אדום לזיהוי אימונו-בלוטים</td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח סטודיו תמונה גרסה 4.0&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>תוכנה C</td></tr><tr><td>הדמיה מולקולרית Versadoc MP4000 מערכת&nbsp;</td><td>מצלמת Bio-Rad</td><td></td><td>Chemiluminescence לזיהוי אימונובלוט</td></tr><tr><td>כמות אחת תוכנת ניתוח חד-ממדית&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Software D</td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto מצע רגישות מקסימלית</td><td>Thermo</td><td>34095</td><td>מצע כימילומינסנט משופר (ECL) רגיש במיוחד</td></tr></tbody></table>

חלבונים immunofluorescence ניתוח של אנדוגני אקסוגניים centromere-קינטוכור

 Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins

"Centromeres" ו-"kinetochores" מתייחסים לאתר שבו כרומוזומים מתקשרים לציר במהלך חלוקת התא. הדמיה ישירה של חלבוני צנטרומר-קינטוכור במהלך מחזור התא נותרה כלי בסיסי בחקירת המנגנונים של חלבונים אלה. שיטות הדמיה מתקדמות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית מספקות רזולוציה יוצאת דופן של רכיבי צנטרומר-קינטוכור ומאפשרות תצפית ישירה על רכיבים מולקולריים ספציפיים של הצנטרומרים והקינטוכורים. בנוסף, שיטות של צביעה אימונו-פלואורסצנטית עקיפה (IIF) באמצעות נוגדנים ספציפיים הן חיוניות לתצפיות אלה. עם זאת, למרות דיווחים רבים על פרוטוקולי IIF, מעטים דנו בפירוט בבעיות של חלבוני צנטרומר-קינטוכור ספציפיים. 1-4 כאן אנו מדווחים על פרוטוקולים אופטימליים לצביעה של חלבוני צנטרומר-קינטוכור אנדוגניים בתאים אנושיים באמצעות קיבוע פרפורמלדהיד וצביעה IIF. יתר על כן, אנו מדווחים על פרוטוקולים לאיתור חלבוני CENP-A אקסוגניים מתויגים ב-Flag בתאים אנושיים הנתונים לקיבוע אצטון או מתנול. שיטות אלו שימושיות באיתור וכימות חלבוני צנטרומר-קינטוכור אנדוגניים וחלבוני CENP-A מתויגים ב-Flag, כולל אלה בתאים אנושיים.

ניתוח Immunofluorescence של CENP-A אנדוגני תומך בהשערה כי האנזים CUL4A-E3 נדרש עבור לוקליזציה של CENP-א &#39;עד צנטרומר המחקרים האחרונים שלנו הראו כי CUL4A-RBX1-COPS8 פעילות אנזים E3 נדרשה ubiquitylation של ליזין 124 (K124) על CENP-A ולוקליזציה של CENP-א &#39;עד צנטרומר. 17 בתחילה, המתחם-centromere ביניים (ICEN) היה מבודד על ידי אנטי CENP-A: immunoprecipitation הכרומטין הילידים, 32-34 וזה כבר שיערו כי ב...

כאן אנו מדווחים על פרוטוקולים לאיתור חלבוני צנטרומר-קינטוכור אנדוגניים ואקסוגניים בתאים אנושיים ולכמת את רמות החלבון הללו בצנטרומר-קינטוכור על ידי צביעה אימונו-פלואורסצנטית עקיפה באמצעות קיבוע (קיבוע פרפורמלדהיד, אצטון או מתנול).

חלבונים Immunofluorescence ניתוח של אנדוגני אקסוגניים centromere-קינטוכור

"Centromeres" and "kinetochores" refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of ...

המטרה הכוללת של בדיקת אימונופלואורסצנציה עקיפה זו היא להבטיח לוקליזציה וקוונטיפיקציה אופטימליות של חלבוני צנטרומר-קינטוצ'ור אנדוגניים ואקסוגניים, כולל חלבון צנטרומר A וחלבוני CENP-A אקסוגניים עם תג flag בתאים אנושיים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע לאופן הזיהוי והכימות של חלבוני צנטרומר-קינטוצ'ור. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי לכמת רמות ביטוי שונות של צנטרומר-קינטוצ'ור בהתאם לשלב האנפאזה הנבחר למחקר.18 שעות לאחר הזריעה, שטפו את התאים בתרבית פעם אחת עם PBS והוסיפו 500 microliters של מצע עם סרום מופחת לכל באער בלוח תרבית פוליסטירן בעל שישה באערים. לאחר מכן, בצעו טרנספקציה לתאים בכל באער באמצעות תמיסת תערובת A ו-B שהוכנה טרי, והדגירו את התרביות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius ו-5%carbon dioxide. לאחר ארבע שעות וחצי, החליפו את המצע ל-DMEM עם רמות גלוקוז גבוהים, מועשר ב-FBS ובאנטיביוטיקה, והחזירו את הלוח לאינקובטור לתרביות תאים.לאחר 48 עד 72 שעות, שאבו את מצע תרבית התאים ושטפו את התאים פעם אחת עם PBS, תוך הוספת התמיות המלוחים לדפנות בארות התרבית כדי להימנע מהפרעת התאים. לאחר מכן, קבעו את התאים ב-4% paraformaldehyde למשך 30 דקות ב-4 degrees Celsius. בתום תקופת הקיבוע, שטפו את התאים פעמיים עם באפר Kb2 ובצעו פרמיאביליזציה לדגימות בבאפר Kb1 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, שטפו את התאים פעם אחת עם תמיסת Kb2 buffer וחסמו קשירה לא-ספציפית על ידי הוספה של תמיסת Kb2 buffer טרייה. לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, השתמשו בפינצטה כדי להוציא את לביש 유리 (cover glasses) שזריעו מכל אחת מהבארות, והשתמשו בטוש למחסום הידרופובי כדי לצייר מחסומים הידרופוביים מסביב לכל דגימת לביש 유리. העבירו את לביש 유리 לתוך פלטת פוליסטירן חדשה בעלת שש בארות והטבילו את הדגימות בנוגדן ראשוני מתאים למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 °C.לאחר מכן, שטפו את התאים שלוש פעמים עם תמיסת Kb2 וסמנו אותם עם הנוגדן המשני המתאים למשך שעה נוספת בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. בתום הדגירה, שטפו את הדגימות בחמישה סבבי שטיפה של 6 דקות בתמיסת Kb2. לאחר מכן, סמנו את גרעיני התאים באמצעות תמיסת Kb3 המכילה DapE למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן בצעו שטיפה אחת עד שתיים בתמיסת Kb2 ומלאו מחדש את הבארים בתמיסת Kb2.כעת הניחו טיפה של חומר קיבוע (mounting medium) במרכזו של כל זכוכית כיסוי עבור דגימה של תאים, והסירו כל שארית נוזל מדגימות התאים. לבסוף, הניחו בזהירות כל דגימה במרכזה של אחת מהשקופיות שהוכנו, והסירו עודפי חומר קיבוע בעזרת נייר סופג. כפי שנראה בניסוי מייצג זה, רמות הביטוי של חלבון CENP-A אנדוגני בליזאטים של תאים כוללים שעברו טרנספקציה של CUL4A siRNA היו דומות לרמות הביטוי של CENP-A בתאים שעברו טרנספקציה של Luciferase siRNA.בנוסף, רמות החלבון של CENP-A אנדוגני בליסאטים של תאים שלמים שעברו טרנספקציה של siRNA נגד RBX1 היו דומות לרמות ה-CENP-A האנדוגני בתאים שעברו טרנספקציה של siRNA נגד Luciferase, מה שמרמז כי הליגאז E3 מסוג CUL4A RBX1 נחוץ ללוקליזציה של CENP-A לצנטרומרים. מוטציות בליזין של CENP-A גורמות לאובדן היכולת להתרכז בצנטרומרים, מה שמרמז כי עיקוביטיליציה של CENP-A K124 חיונית ללוקליזציה של CENP-A לצנטרומרים. באופן חשוב, היתוך אקסוגני של מונו-איבקיטין לחלבון CENP-A שיקם את הדלוקליזציה של המוטנט CENP-A K124R, והחזיר את החלבון למיקומו בצנטרומר.לאחר רכישת המיומנות, ניתן להשלים את הלימודי קיבוע התאים והצביעה האימונופלואורסצנטית תוך חמש עד שש שעות, במידה והם מבוצעים כראוי. זכרו להוסיף את כל התמיסות בעדינות לדפנות הבארות, כדי שהתאים לא יתנתקו מזכוכית הכיסוי בזמן השטיפה או הטבילה של הדגימות. שימו לב כי עבודה עם פאראפורמאלדהיד מחומם מחוץ לחדר מאוורר, או נוכחות של חומרים דליקים ליד אש, עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי הזהירות המתאימים בעת ביצוע פרוטוקול זה.

immunofluorescence-analysis-endogenous-exogenous-centromere

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי בו זמני של שינויי היסטון ידי רצפי DNA וimmunofluorescence ידי דגי DNA אחרי מיקרוסקופיה וניתוחים (דגי 3D החיסוני DNA) 3D.

Immunofluorescence שילוב ודגי DNA על 3D-השתמרו גרעיני Interphase לחקר שינויים בארגון גרעיני 3D

הדמיה של חלבוני centrosomal במהלך spermatogenesis דרוזופילה היא שיטה רבת עוצמה לזיהוי חלבונים חדשים חיוניים לביולוגית centrosome, כמו גם על מנת להבהיר את הפונקציה המסוימת של שחקנים ידועים בתהליך זה.

Centrosomes הדמיה באשכים טוס

כאן, פותחה בדיקת פלואורסצנציה כמותית חדשה כדי למדוד שינויים ברמת חלבון במיוחד בצנטרוזומים על ידי נורמליזציה של עוצמת הקרינה של החלבון לזו של תקן פנימי מתאים.

כמותי Immunofluorescence Assay למדוד הווריאציה ברמות חלבון בCentrosomes

קינאז תלוי-cyclin 1 (Cdk1) מופעל בשלב G2 של מחזור התא, מסדיר משעולים הסלולר רבים. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול להצפנה assay קינאז במבחנה עם Cdk1, אשר מאפשר זיהוי אתרי זירחון ספציפי Cdk1 להקמת מטרות תאיות של קינאז חשוב.

זיהוי של קינאז תלוי-Cyclin 1 אתרי זירחון ספציפיים על-ידי קינאז במבחנה Assay

פיתחנו אסטרטגיה טיהור וגירוש של תמונה מספר רב של centrioles ב לשכנוע סופר-רזולוציה מיקרוסקופיה של יחיד-חלקיקים ממוצע של נטיות שונות.

בידוד והדמיה פלורסצנטיות עבור שחזור יחיד-חלקיקים של Chlamydomonas Centrioles

CENP-מהווה מהווה דרישה חשובה עבור CENP-A התצהיר ב צנטרומר, ירש דרך dimerization בין החטיבה התא, והכרחי לקיום תאים. כאן אנו מתארים ניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות אובילילציה של EYFP-מתויג CENP-A (EYFP-CENP-A) חלבון.

ניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות את אוביקווילציה של EYFP-מתויג CENP-A (EYFP-CENP-A)

בעקבות נזק DNA, תאים אנושיים להפעיל מסלולי תיקון חיוניים כדי לשחזר את שלמות הגנום שלהם. כאן, אנו מתארים את השיטה של חיסון עקיף כאמצעי לזיהוי חלבוני תיקון DNA, לנתח את הגיוס המרחבי והזמני שלהם, ולעזור לחקור אינטראקציה חלבון-חלבון באתרים של נזק DNA.

הדמיה של אינטראקציה חלבוני תיקון DNA על ידי אימונופלואורסץ

מוצג כאן פרוטוקול להדמיית תאים חיים ברזולוציית-על ברקמה שלמה. התקנו את התנאים להדמיית אוכלוסיית תאי גזע בוגרים רגישים מאוד בסביבת הרקמה הטבעית שלה. טכניקה זו כרוכה באיזון רזולוציה זמנית ומרחבית כדי לאפשר תצפית ישירה של תופעות ביולוגיות ברקמה חיה.

הדמיית תאים חיים ברזולוציה סופר-רזולוציה של מבנים תת-תאיים

שגיאה בהפרדת כרומוזומים היא תכונה נפוצה בביציות. לכן, חקר מחסום הרכבת הציר נותן רמזים חשובים על המנגנונים הדרושים לייצור ביצים בריאות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שלוש בדיקות משלימות להערכת שלמות מחסום הרכבת ציר בביציות עכבר.

הערכת שלמות מחסום הרכבת הציר בביציות עכבר

מיקרוסקופיה בהילוך מהיר היא כלי רב ערך לחקר מיוזה בשמרים ניצנים. פרוטוקול זה מתאר שיטה המשלבת סנכרון מחזור התא, מיקרוסקופיה בהילוך מהיר ודלדול מותנה של חלבון מטרה כדי להדגים כיצד לחקור את תפקודו של חלבון מסוים במהלך הפרדת כרומוזומים מיוטיים.

שימוש במיקרוסקופיה של קיטועי זמן ודלדול גרעיני ספציפי לשלב של חלבונים כדי לחקור מיוזה ב- S. cerevisiae

תנועת כרומוזומים במהלך פרופאזה מיוטית היא תופעה לא מובנת היטב שהיא בסיסית להיווצרות נבגים. פרוטוקול זה מתאר שיטה לרכישה, ניתוח וכימות של תנועות צנטרומר במהלך פרופאזה מיוטית במיוציטים זכריים של Arabidopsis thaliana .

אפיון הדמיה חיה של תנועות צנטרומר במהלך פרופאזה מיוטית זכרית ב- Arabidopsis thaliana

למדו שיטת צביעת immunofluorescence עקיפה לאופטימיזציה של לוקליזציה וכימות חלבוני centromere-kinetochore אנדוגניים ואקסוגניים בתאי אדם. הפרוטוקול מאפשר זיהוי וכימות רמות חלבון בשלבי אנאפזה שונים.

חלבונים Immunofluorescence ניתוח של אנדוגני אקסוגניים centromere-קינטוכור

גלה סרטונים נוספים