חלבונים Immunofluorescence ניתוח של אנדוגני אקסוגניים centromere-קינטוכור
March 3rd, 2016
כאן אנו מדווחים על פרוטוקולים לאיתור חלבוני צנטרומר-קינטוכור אנדוגניים ואקסוגניים בתאים אנושיים ולכמת את רמות החלבון הללו בצנטרומר-קינטוכור על ידי צביעה אימונו-פלואורסצנטית עקיפה באמצעות קיבוע (קיבוע פרפורמלדהיד, אצטון או מתנול).
המטרה הכוללת של בדיקה אימונופלורסנט עקיפה זו היא לייעל את הלוקליזציה והכימות של חלבוני צנטרומר-קינטוכור אנדוגניים ואקסוגניים, כולל חלבון צנטרומר A וחלבוני CENP-A אקסוגניים מתויגים בדגל בתאים אנושיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח כיצד לזהות ולכמת חלבוני צנטרומר-קינטוכור. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי לבחון רמות שונות של ביטוי צנטרומר-קינטוכור בהתאם לאנפאזה המעניינת שנבחרה.
18 שעות לאחר הזריעה יש לשטוף את התאים המתורבתים פעם אחת עם PBS ולהוסיף 500 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת לכל באר של צלחת תרבית פוליסטירן שש בארות. לאחר מכן, העבירו את התאים בכל באר בתמיסת תערובת A ו-B שהוכנה לאחרונה ודגרו על התרביות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר ארבע וחצי שעות, החלף את ה-DMEM הבינוני לגבוה בתוספת FBS ואנטיביוטיקה והחזיר את הצלחת לחממת תרבית התאים.
48 עד 72 שעות לאחר מכן, שאפו את מדיום תרבית התאים ושטפו את התאים פעם אחת עם PBS, והוסיפו את מי המלח לאורך דפנות בארות התרבית כדי למנוע הפרעה לתאים. לאחר מכן תקן את התאים עם 4% פרפורמלדהיד למשך 30 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס. בתום תקופת הקיבוע יש לשטוף את התאים פעמיים עם מאגר Kb2 ולחלחל את הדגימות במאגר Kb1 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן שטפו את התאים פעם אחת עם מאגר Kb2 וחסמו כל קשירה לא ספציפית בתוספת מאגר Kb2 טרי. לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, השתמש במלקחיים כדי להסיר את כוסות הכיסוי הזרוע מכל אחת מהבארות, והשתמש בעט מחסום הידרופובי כדי לצייר מחסומים הידרופוביים סביב כל דגימת זכוכית כיסוי. העבירו את כוסות הכיסוי לצלחת פוליסטירן חדשה בת שש בארות וטבלו את הדגימות בנוגדנים הראשוניים המתאימים למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן שטפו את התאים שלוש פעמים עם מאגר Kb2 וסמנו אותם עם הנוגדן המשני המתאים למשך שעה נוספת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. בתום הדגירה יש לשטוף את הדגימות בחמש שטיפות של 6 דקות במאגר Kb2. לאחר מכן סמן את גרעיני התא עם מאגר Kb3 המכיל DapE למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שטיפה אחת עד שתיים במאגר Kb2 ומילוי הבארות במאגר Kb2.
כעת הניחו טיפה של מדיום הרכבה במרכז שקופית מיקרוסקופ אחת עבור כל כיסוי של תאים, והוציאו כל נוזל מדגימות התא. לבסוף, הנח בזהירות כל דגימה במרכז אחת משקופיות המיקרוסקופ המוכנות, והסר את כל אמצעי ההרכבה העודף בעזרת מגבת נייר. כפי שנצפה בניסוי מייצג זה, רמות ביטוי חלבון CENP-A אנדוגני בסך הליזטים של התאים שעברו טרנספטציה של CUL4A siRNA היו דומות לרמות ביטוי CENP-A בתאים שעברו טרנספטציה של לוציפראז siRNA.
יתר על כן, רמות החלבון של CENP-A אנדוגני בליזאטים הכוללים של התאים שעברו טרנספטציה של RBX1 siRNA היו דומות לרמות ה-CENP-A האנדוגניות של התאים הטרנספטנטיים של Luciferase siRNA, מה שמצביע על כך שה-CUL4A RBX1 E3 ligase נדרש ללוקליזציה של CENP-A לצנטרומרים. מוטציות ליזין CENP-A מאבדות את יכולתן להתמקם בתוך הצנטרומרים, מה שמרמז על כך ש-CENP-A K124 ubiquitylation חיוני ללוקליזציה של CENP-A לצנטרומרים. חשוב לציין, היתוך מונוביקוויטין אקסוגני של חלבון CENP-A הציל את מוטנט הדלוקליזציה CENP-A K124R, והחזיר את החלבון למיקומו הצנטרומרי.
לאחר השליטה, ניתן להשלים את הליכי קיבוע התאים והצביעה האימונופלורסנט תוך חמש עד שש שעות אם הם מבוצעים כראוי. זכור למרוח בעדינות את כל התמיסות על דפנות הבארות כדי שהתאים לא ייעקרו מכוסות הכיסוי שלהם בעת שטיפה או טבילה של הדגימות. אל תשכח שעבודה עם פרפורמלדהיד מחומם מחוץ לחדר מאוורר או שחומרים דליקים בקרבת אש עלולים להיות מסוכנים ביותר וכי תמיד יש לנקוט באמצעי הזהירות המתאימים בעת ביצוע הליך זה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקולים לזיהוי וכימות חלבונים של מרכזום-קינטוכור בתאים אנושיים באמצעות צביעה אימונופלואורוסצנטית עקיפה. השיטות כוללות טכניקות קיבוע שונות לאופטימיזציה של לוקליזציה של חלבונים אלו.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- ביולוגיה של תאים
- מדעי המוח
- ניתוח חלבונים
רקע
- חלבוני מרכזום-קינטוכור ממלאים תפקיד קריטי בחלוקת התא.
- הבנת הלוקליזציה ורמות הביטוי שלהם חיונית למחקר בביולוגיה של תאים.
- צביעה אימונופלואורוסצנטית עקיפה היא טכניקה נפוצה לחקר חלבונים אלו.
- שיטות קיבוע שונות יכולות להשפיע על זיהוי החלבונים הללו.
מטרת המחקר
- לאופטימיזציה של הלוקליזציה של חלבונים מרכזום-קינטוכור אנדוגניים ואקסוגניים.
- לכמת רמות חלבון במרכזומים-קינטוכורים בתאים אנושיים.
- לספק פרוטוקול אמין לחוקרים בתחום.
שיטות בשימוש
- טכניקות צביעה אימונופלואורוסצנטית עקיפה.
- שימוש בשיטות קיבוע פרפורמלדהיד, אצטון או מתנול.
- טרנספקציה של תאים מותאמים עם מבני חלבון ספציפיים.
- דגירה והחלפת מדיום לאופטימיזציה של ביטוי חלבונים.
תוצאות עיקריות
- לוקליזציה מוצלחת של חלבון מרכזום A וחלבוני CENP-A מסומני דגל.
- כימות רמות חלבון בשלבי אנאפזה שונים.
- הוכחת האפקטיביות של שיטות קיבוע שונות.
- מתן פרוטוקול שניתן להתאים לצרכים ניסיוניים שונים.
מסקנות
- המחקר מציע שיטה חזקה לחקר חלבוני מרכזום-קינטוכור.
- הממצאים יכולים לשפר את ההבנה של דינמיקת חלבונים במהלך חלוקת התא.
- הפרוטוקולים יכולים לשמש למחקר עתידי בביולוגיה של תאים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Quantitative immunofluorescence analysis of centromere-kinetochore proteins enables precise interrogation of chromosome segregation mechanisms, a critical inflection point in cell division research. This capability supports predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking for discovery-stage programs focused on mitotic regulation. Robust localization and quantification workflows for endogenous and exogenous proteins facilitate portfolio decisions in early discovery and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization and quantification of centromere-kinetochore protein localization in human cells.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing effects of genetic or chemical perturbations on protein targeting.
- Facilitates functional validation of candidate targets involved in chromosome segregation fidelity.
- Provides quantitative benchmarks for pathway interrogation and hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Delivers validated immunofluorescence protocols adaptable for high-content screening of mitotic regulators.
- Ensures reproducible detection of both endogenous and exogenous protein variants across experimental conditions.
- Enables quantitative readouts suitable for comparative analysis in compound or genetic screens.
- Supports assay standardization for cross-laboratory and cross-platform studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by enabling detection of protein mislocalization linked to chromosomal instability.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by supporting biomarker quantification in engineered cell systems.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions based on quantitative protein localization data.
Pipeline & Workflow Integration
This immunofluorescence protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting both early mechanistic studies and downstream assay development for lead identification.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven testing of centromere-kinetochore protein function and localization.
- Screening: Provides quantitative, reproducible immunofluorescence readouts for screening campaigns targeting mitotic pathways.
- Analytics: Supports statistical comparison of protein localization and expression across experimental groups.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by quantifying protein mislocalization relevant to chromosomal instability syndromes.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable workflow for diverse protein targets and cell systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in mitotic pathway studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable protocols for reproducible immunofluorescence analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and programs based on mechanistic insights.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence microscopy and quantitative image analysis.
- Demands access to validated antibodies and high-quality imaging instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of fixation and staining protocols for reproducibility.
- Adaptable to various cell models but may require optimization for specific protein tags or fixation chemistries.
- Careful handling of hazardous reagents and adherence to safety protocols are essential.
