חלבונים Immunofluorescence ניתוח של אנדוגני אקסוגניים centromere-קינטוכור

המטרה הכוללת של בדיקה אימונופלורסנט עקיפה זו היא לייעל את הלוקליזציה והכימות של חלבוני צנטרומר-קינטוכור אנדוגניים ואקסוגניים, כולל חלבון צנטרומר A וחלבוני CENP-A אקסוגניים מתויגים בדגל בתאים אנושיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח כיצד לזהות ולכמת חלבוני צנטרומר-קינטוכור. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי לבחון רמות שונות של ביטוי צנטרומר-קינטוכור בהתאם לאנפאזה המעניינת שנבחרה.

18 שעות לאחר הזריעה יש לשטוף את התאים המתורבתים פעם אחת עם PBS ולהוסיף 500 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת לכל באר של צלחת תרבית פוליסטירן שש בארות. לאחר מכן, העבירו את התאים בכל באר בתמיסת תערובת A ו-B שהוכנה לאחרונה ודגרו על התרביות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר ארבע וחצי שעות, החלף את ה-DMEM הבינוני לגבוה בתוספת FBS ואנטיביוטיקה והחזיר את הצלחת לחממת תרבית התאים.

48 עד 72 שעות לאחר מכן, שאפו את מדיום תרבית התאים ושטפו את התאים פעם אחת עם PBS, והוסיפו את מי המלח לאורך דפנות בארות התרבית כדי למנוע הפרעה לתאים. לאחר מכן תקן את התאים עם 4% פרפורמלדהיד למשך 30 דקות בחום של 4 מעלות צלזיוס. בתום תקופת הקיבוע יש לשטוף את התאים פעמיים עם מאגר Kb2 ולחלחל את הדגימות במאגר Kb1 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן שטפו את התאים פעם אחת עם מאגר Kb2 וחסמו כל קשירה לא ספציפית בתוספת מאגר Kb2 טרי. לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, השתמש במלקחיים כדי להסיר את כוסות הכיסוי הזרוע מכל אחת מהבארות, והשתמש בעט מחסום הידרופובי כדי לצייר מחסומים הידרופוביים סביב כל דגימת זכוכית כיסוי. העבירו את כוסות הכיסוי לצלחת פוליסטירן חדשה בת שש בארות וטבלו את הדגימות בנוגדנים הראשוניים המתאימים למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן שטפו את התאים שלוש פעמים עם מאגר Kb2 וסמנו אותם עם הנוגדן המשני המתאים למשך שעה נוספת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. בתום הדגירה יש לשטוף את הדגימות בחמש שטיפות של 6 דקות במאגר Kb2. לאחר מכן סמן את גרעיני התא עם מאגר Kb3 המכיל DapE למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שטיפה אחת עד שתיים במאגר Kb2 ומילוי הבארות במאגר Kb2.

כעת הניחו טיפה של מדיום הרכבה במרכז שקופית מיקרוסקופ אחת עבור כל כיסוי של תאים, והוציאו כל נוזל מדגימות התא. לבסוף, הנח בזהירות כל דגימה במרכז אחת משקופיות המיקרוסקופ המוכנות, והסר את כל אמצעי ההרכבה העודף בעזרת מגבת נייר. כפי שנצפה בניסוי מייצג זה, רמות ביטוי חלבון CENP-A אנדוגני בסך הליזטים של התאים שעברו טרנספטציה של CUL4A siRNA היו דומות לרמות ביטוי CENP-A בתאים שעברו טרנספטציה של לוציפראז siRNA.

יתר על כן, רמות החלבון של CENP-A אנדוגני בליזאטים הכוללים של התאים שעברו טרנספטציה של RBX1 siRNA היו דומות לרמות ה-CENP-A האנדוגניות של התאים הטרנספטנטיים של Luciferase siRNA, מה שמצביע על כך שה-CUL4A RBX1 E3 ligase נדרש ללוקליזציה של CENP-A לצנטרומרים. מוטציות ליזין CENP-A מאבדות את יכולתן להתמקם בתוך הצנטרומרים, מה שמרמז על כך ש-CENP-A K124 ubiquitylation חיוני ללוקליזציה של CENP-A לצנטרומרים. חשוב לציין, היתוך מונוביקוויטין אקסוגני של חלבון CENP-A הציל את מוטנט הדלוקליזציה CENP-A K124R, והחזיר את החלבון למיקומו הצנטרומרי.

לאחר השליטה, ניתן להשלים את הליכי קיבוע התאים והצביעה האימונופלורסנט תוך חמש עד שש שעות אם הם מבוצעים כראוי. זכור למרוח בעדינות את כל התמיסות על דפנות הבארות כדי שהתאים לא ייעקרו מכוסות הכיסוי שלהם בעת שטיפה או טבילה של הדגימות. אל תשכח שעבודה עם פרפורמלדהיד מחומם מחוץ לחדר מאוורר או שחומרים דליקים בקרבת אש עלולים להיות מסוכנים ביותר וכי תמיד יש לנקוט באמצעי הזהירות המתאימים בעת ביצוע הליך זה.