אסטרטגיית העשרת ספין-טיפ לניתוח סימולטני של N-גליקופפטידים ופוספופפטידים מרקמות הלבלב האנושיות

אסטרטגיית הכרומטוגרפיה של זיקה מתכתית משותקת טיטניום דו-תפקודית יכולה להעשיר הן את N-גליקופפטידים והן את הפוספופפטידים באותו תהליך עבודה, ולהגדיל את המידע הביומולקולרי מאותו ניתוח. היתרון העיקרי של העשרה זו הוא שני מנגנוני הפרדה, המאפשרים הפרדה סימולטנית של N-גליקופפטידים ופוספופפטידים בשברים נפרדים לניתוח ספקטרומטריית מסה במורד הזרם. שימוש בשיטת העשרה זו יכול לשפר את זיהוי הגליקוזילציה והזרחון בדגימות ביולוגיות מורכבות כמו רקמות הלבלב לקראת גילוי סמנים ביולוגיים של מחלות כגון סוכרת וסרטן.

מכיוון ששיטה זו מסתמכת על קצוות ספין וצנטריפוגה, חשוב לשלוט במהירות הצנטריפוגה, ולוודא שהדגימות נקיות מחלקיקים כדי למנוע סתימה. כדי להתחיל, מראש לצנן את החלקים של pulverizer רקמה כי יבוא במגע עם רקמות הלבלב, כלומר החדר, pulverizer, וכף התאוששות, יחד עם כל מרית, במיכל פוליסטירן. לאחר מכן, העבירו חתיכות רקמה למחזיק הדגימה המצונן מראש, והוסיפו חנקן נוזלי לרקמה עד שהן מוקפאות.

לאחר הנחת הפולברייזר לתוך התא, הכה אותו באמצעות מאלט חמש עד עשר פעמים כדי לרסק את הדגימה, ואז להסיר את הפולבריזר מהתא ולגרד את אבקת הרקמות והחתיכות הדבקות. לאחר מכן, מוסיפים כפית של חנקן נוזלי לתא אם הרקמות מתחילות להתמוסס, וחוזרים על תהליך הפולבריזציה עד לקבלת אבקה דקה ומחלקים את הדגימות לכ-100 מיליגרם אליקוטים לתוך צינורות מצוננים מראש. לאחר הכנת מאגר הליזיס, ממיסים טבליה אחת כל אחד ממעכבי פרוטאז ופוספטאז ב-500 מיקרוליטרים של מים, לקבלת מלאי של פי 20 מהריכוז הסופי הרצוי, ומוסיפים את נפח המלאי הנדרש של כל מעכב למאגר הליזיס כדי להשיג את ריכוזי המעכבים הסופיים.

לאחר הוספת 600 מיקרוליטרים של חיץ ליזה לצינור, דגירה ב 95 מעלות צלזיוס בבלוק החימום במשך 10 דקות עם רעידות ב 800 סל"ד, ואז להסיר את הדגימות מגוש החימום ולתת להם להתקרר לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, נקו את הדגימות באנרגיה של 60 וואט למשך 45 שניות, תוך שימוש בפולסים של 15 שניות עם מנוחה של 30 שניות בין לבין, ופלטו את הדגימות ב-3000 פעמים G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. הוסף את הסופרנאטנט לפי חמישה מנפח ממס המשקעים שלו.

לדוגמה, 300 מיקרוליטרים של בופר ליזיס ל-1.5 מיליליטרים של ממס משקעים המכיל 50% אצטון, 49.9% אתנול ו-0.1% חומצה אצטית, ואז צוננים למשך הלילה ב-80 מעלות צלזיוס. מטילים את הדגימות שוב ב-3000 פעמים G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ומסירים את הסופרנאטנט, ואז שוטפים את הכדור על ידי פירוק עם מרית ומערבבים עם אותה כמות של ממס משקעים. לאחר הצנטריפוגה, האוויר מייבש את גלולת הדגימה במכסה אדים במשך 15 דקות, ומאחסן בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס עד שהוא מוכן להמשך.

ראשית, השעו מחדש את גלולת החלבון ב-300 מיקרוליטרים של מאגר עיכול טריאמולרי המכיל 50 חיץ טריאתילמוניום ביקרבונט מילימולרי ושמונה אוריאה טוחנת. לחלבון בתמיסה, מוסיפים את ה-dithiothreitol לריכוז הסופי של חמישה מילימולרים, מערבבים ומפחיתים בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, ואז מוסיפים יודואצטאמיד לריכוז סופי של 15 מילימולר. מערבבים, ואלקילאט בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות בחושך.

לאחר מכן, הוסיפו את Lys-C/Trypsin ביחס של 1 עד 100 אנזים לחלבון, ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור במשך ארבע שעות, ואז הוסיפו 50 חיץ טריאתילמוניום ביקרבונט של 50 מילימולר כדי לדלל את שמונה האוריאה הטוחנת המשמשת לפחות מטוחנת אחת. לאחר הוספת טריפסין ביחס של 1 עד 100 אנזים לחלבון, הדגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור במהלך הלילה, ולאחר מכן מרווים את העיכול בתוספת חומצה טריפלואורואצטית. עבור כל מיליגרם אחד של חלבון התחלתי, יש להתנות מחסנית התפלה במיליליטר אחד של אצטוניטריל, ותריס עם מיליליטר אחד של 0.1% חומצה טריפלואורואצטית, ואז לטעון את התערובת המעוכלת על מחסנית ההתפלה, ולשטוף את התערובת שלוש פעמים באמצעות מיליליטר אחד של 0.1% חומצה טריפלואורואצטית.

לאחר מכן, פפטידים מלטפים באמצעות מיליליטר אחד של 60% אצטוניטריל ו-0.1% תמיסת חומצה פורמית, ואז מייבשים פפטידים בטמפרטורה של כ-35 מעלות צלזיוס באמצעות רכז ואקום צנטריפוגלי עד שהממס התאדה לחלוטין. לאחר השעיה מחדש של הפפטידים במים, העריכו את ריכוזי הפפטידים באמצעות בדיקת פפטידים על פי פרוטוקול היצרן, ואז חלקו את הפפטידים לאליפוטים של 500 מיקרוגרם, ויבשו לחלוטין. שוקלים כשלושה מיליגרם צמר גפן ואורזים אותו לקצה ספינה ריק.

לאחר העברת גרם אחד של חומר כרומטוגרפיה של זיקה מתכתית משותקת טיטניום לתוך צינור, להוסיף 0.1%חומצה trifluoroacetic לריכוז ידוע של חומר. לאחר הוספת מספיק slurry לקצה ספין כדי להעביר 20 מיליגרם של חומר, לשטוף את קצה הספין על ידי צנטריפוגה עם 200 microliters של 0.1% חומצה trifluoroacetic. השהו מחדש את הדגימות ב-200 מיקרוליטרים של ממס העמסה/שטיפה, וזרמו דרך קצה הספין.

לאחר שטיפת קצה הספין על ידי צנטריפוגה עם ממס העמסה/שטיפה, שטפו את קצה הספין עם 200 מיקרוליטרים של תמיסת חומצה פורמית 0.1 אצטוניטריל 0.1 של 80%, ולאחר מכן שטפו את הפפטידים עם 200 מיקרוליטרים של E1 ו-E2, ונתחו כל אלוטיון בנפרד. חזור על תהליך האלוטציה באמצעות ממסים E3 ו- E4, ושלב את שברי האלוטיון המתאימים לפני ניתוח במורד הזרם. לפני ביצוע ההמלטות ב-pH בסיסי, תנו את החומר שלוש פעמים באמצעות 200 מיקרוליטרים של 90% אצטוניטריל ב-2.5% אמוניום הידרוקסיד, ואז הורידו את הפפטידים עם 200 מיקרוליטרים של ממסים E5 ו-E6, ונתחו את האלוטיונים האלה בנפרד לאחר ההתפלה באמצעות קצה ארוז.

לאחר מכן, הקפידו על הפפטידים עם 200 מיקרוליטרים בריכוזים שונים של אצטוניטריל ואמוניום הידרוקסיד. לאחר מכן, שלבו את האלוטיונים הללו, ונתחו כמדגם אחד, E7, לאחר ההתפלה באמצעות קצה ארוז. ספקטרום MS/MS מבואר בביטחון גבוה מפפטידים N-גליקוסיליים וזרחניים התקבלו עם פיצול עשיר של מבשרים, מה שהגביר את הביטחון בזיהוי, כפי שהוקצה על ידי תוכנת חיפוש מסד הנתונים.

זיהויים פפטידיים נמצאו מדגימות מועשרות באמצעות שיטת כרומטוגרפיית ספין של כרומטוגרפיית זיקה מתכתית משותקת דו-תפקודית על כל שבר אלוטיון. רוב הגליקופפטידים מתרבים בארבעת השברים הראשונים, בעוד שרוב הפוספופפטידים מתרבים בשלושת השברים האחרונים, מה שמפחית הפרעות פוטנציאליות בייון. תוצאות הגליקופרוטאומיקה משיטת הטיטניום הכפול הושוו להעשרה של ארליך-גליקופפטיד בלבד, מה שמדגים כי הפרופורציות של כל סוג של גליקאן לאחר חיבור לשש קטגוריות על סמך הרכביהן, דומות בין שתי השיטות.

תוצאות פוספופרוטאומיקה משיטת הטיטניום הכפולה הושוו לכרומטוגרפיית זיקה מתכתית משותקת קונבנציונלית של העשרת פוספופפטיד בלבד או שימוש בשתי השיטות. רוב חומצות האמינו הזרחניות זוהו כסרין ותריאונין, עם כ-1% טירוזין זרחני. בנייה נכונה של קצה הספין חשובה כדי להבטיח התרוממות חלקה.

חברו את הכותנה בחוזקה לקצה, כך שניתן יהיה לארוז את חומר ההעשרה על גבי הכותנה. השתמשנו בשיטת IMAC טיטניום דו-תפקודית לאפיון סימולטני של גליקוזילציה וזרחון ברוב הרקמות ובחלבון הספייק SARS-CoV-2.