גרימת חילוץ פוליפ במושבות אלמוגים כדי להשיג מיקרו-פרופגאטים מותאמים אישית לשימוש ניסיוני במעבדה

מיקרו-פרופגציה של אלמוגים עדיין בחיתוליה. אופטימיזציה של פרוטוקולים לחילוץ פוליפים היא המפתח להשלמת הפער הזה, המאפשרת למדענים להשתמש בפוליפים כמודלים לחקר אלמוגים בסביבות מעבדה. חילוץ פוליפ מאפשר ליצור התפשטות מרובה מקטעי אלמוגים קטנים.

ניתן להשתמש בפוליפים בניסויים שונים המאפשרים תצפית על תהליכים מיקרוסקופיים באלמוגים, למשל. שוניות אלמוגים מאוימות. המטרה שלנו היא להשתמש במודל הניתן לשכפול זה כדי לפתח אסטרטגיות להגנה על אלמוגים מפני הלבנה ואיומים סביבתיים אחרים בצורה יעילה ולא פולשנית.

שיטה זו עשויה לסייע בחקר הפיזיולוגיה של האלמוגים, אינטראקציות המיקרוביום של המארחים והמנגנונים המעורבים בהלבנה. ממצאים כאלה יכולים לתרום לאופטימיזציה של פרוביוטיקה של אלמוגים, למשל. שימוש במי ים עם מליחות נאותה הוא המפתח.

המליחות חייבת להתחיל ברמת הסביבה הטבעית של האלמוגים ולהתגבר לאט כדי שהלחץ לא יזיק יתר על המידה. איסוף פוליפים ברגע הנכון ובחירת אלה שהם השלמים ביותר הוא חיוני להישרדותם. הדגמה חזותית יכולה להיות חיונית להבנת רמזים אלה.

ראשית, השתמשו בצבתות חיתוך אלכסוניות כדי לחתוך שברים קטנים ממושבת אלמוגים, ואז הניחו אותן בצלחות פטרי קטנות מלאות ב-12 מי ים שאליהן התאקלמה מושבת האלמוגים. השאירו את הצלחת פתוחה למשך כ-24 שעות בטמפרטורת הסביבה, כך שהמים מתאדים ומליחותם עולה בהדרגה. כאשר ניתן להבחין בעיכול הרקמה בין הפוליפים, השתמשו בפיפטת העברה של 1 מיליליטר כדי ליצור זרימה עדינה קרוב לרקמת האלמוגים.

הזרימה תסייע לאט לאט להשלים את ניתוק הפוליפים שכבר עיכלו את הרקמה סביבם מהשלד, ואז עם הפיפטה, החליפו באיטיות את המים בצלחת פטרי במים איזוסמוטיים. כדי להכין מי ים בעלי מליחות גבוהה, קחו מי ים רגילים והוסיפו נתרן כלורי למי ים כדי להכין שלושה ליטרים של מי ים בעלי מליחות גבוהה עד שהמליחות תגדל ב-85% לאחר חיתוך שברים קטנים של אלמוגים כפי שהוכח קודם לכן, הכניסו אותם למיכל של 10 ליטר עם שלושה ליטרים של מי ים איזוסמוטיים המחוברים למשאבה פריסטלטית. מלאו את המיכל הזה בשלושה ליטרים של מי ים בעלי מליחות גבוהה שהוכנו בעבר במשך 24 שעות בקצב של 126 מיליליטר לשעה כדי להגדיל את המליחות בכ-40% באמצעות פיפטה, צרו זרימה עדינה של מים לשחרור הפוליפים מהשלד.

לאט לאט להחליף את המים במיכל במי ים איזוסמוטיים. מוסיפים 26.29 גרם נתרן כלורי, 0.872 גרם אשלגן כלורי, 2.16 גרם מגנזיום גופרתי, 11.94 גרם מגנזיום כלוריד, 3.42 גרם נתרן גופרתי ו-0.26 גרם נתרן ביקרבונט לליטר אחד של מים שעברו דה-יוניזציה כדי להכין מי ים נטולי סידן, ואז למלא את מנות פטרי במי ים נטולי סידן. לאחר חיתוך שברי אלמוגים קטנים, הטביעו אותם במי ים נטולי סידן בצלחות הפטרי.

שים את הכלים באינקובטור מסלולי למשך שלוש שעות במהירות סיבוב של 80 סל"ד, ואז העבר את השברים לצלחות פטרי מלאות ב-20% DMEM שהוכנו במי ים מלאכותיים של 40 יחידות מליחות מעשיות ומכילות 100 מיליגרם לליטר אמפיצילין. הדגירה של השברים ב-26 מעלות צלזיוס ו-80 סל"ד. החליפו את המדיה מדי יום עד שניתן יהיה להבחין בעיכול רקמות בין פוליפים ופוליפים בודדים מתחילים להתנתק מהשלד, ואז מעבירים את הפוליפים למי ים מעוקרים ודגירה למשך שעה.

לאחר שהפוליפים מוחזרים למי ים מסוננים עם מליחות שאינה מדגישה, בחר את הפוליפים בני הקיימא על ידי התבוננות בשלמות הרקמה ובתנועה הנגרמת על ידי זרימה סילארית תחת מיקרוסקופ סטריאו. מניחים את הפוליפים שנבחרו בצלחת פטרי ומכסים את צלחת הפטרי ברשת פלנקטון בגודל רשת של 200 מיקרומטר, כך שהפוליפים לא צפים הרחק מהתבשיל. הניחו את צלחת הפטרי בתוך אקווריום עם תנאים מתאימים למיני האלמוגים בהם נעשה שימוש.

כדי למנוע צמיחת יתר של אצות, פתחו את צלחת הפטרי לפחות פעם בשבוע כדי לחדש את המים ולנקות את התבשיל. לאחר בחירת הפוליפים כפי שהוצג קודם לכן, באמצעות פיפטת העברה, מניחים אותם לתוך בקבוקון תא פני שטח בגודל 75 סנטימטרים רבועים המלא ב-50 מיליליטר של מי ים איזוסמוטיים, ואז סוגרים את הבקבוקון ומכניסים אותם לחממה שנקבעה במחזורי אור של 12 שעות, 26 מעלות צלזיוס ו-40 סל"ד. אם הבקבוקון מתמלא באצות או בביופילמים, העבירו את התכולה לבקבוקון נקי.

במחקר זה, חילוץ פוליפ הושרה על ידי שלוש שיטות שונות. שיטת אידוי המים הביאה לחילוץ מוחלט תוך 24 שעות מרגע הדגירה, והמליחות עלתה מ-40 ל-59 יחידות מליחות מעשיות לאחר 24 שעות. שיטת אספקת המים המלוחים הביאה גם לחילוץ פוליפ לאחר 24 שעות של דגירה.

כאן, המליחות עלתה מ -40 ל -52 יחידות מליחות מעשיות לאחר 12 שעות של דגירה, ולאחר מכן ל -59 יחידות מליחות מעשיות לאחר 24 שעות. האינדוקציה של החילוץ באמצעות דגירה במי ים נטולי סידן הושלמה לאחר שלוש שעות של דגירה של פוליפים בתוכה, ולאחר מכן 20 שעות של דגירה במדיה של 20% DMEM, בכל שלוש השיטות ניתן היה ליצור פוליפים אלמוגים אינדיבידואליים. פוליפים של אלמוגים שנוצרו על ידי שיטת האידוי יכלו לשרוד במשך שישה שבועות, ואילו אלה המיוצרים על ידי שיטת אספקת מי הים בעלת המליחות הגבוהה יכלו לשרוד במשך שמונה שבועות בצלחות פטרי בתוך אקווריומים.

פוליפים שהתקבלו משיטת אידוי מי הים שהוחזקו בצלוחיות תרביות תאים בתוך אינקובטורים שרדו עד שלושה שבועות ללא דיסוציאציה מוחלטת של הרקמות שלהם. כאשר מנתקים פוליפים מהשלד, חשוב להיות עדינים. אם הם לא מנותקים לחלוטין, כפיית ניתוק על ידי צנרת חזקה של מים תגרום לנזק ושיעורי הישרדות נמוכים יותר.

באמצעות שיטות אלה, התיישבות של פוליפים יכול להיות מושרה. התיישבות פוליפס יכולה לענות על שאלות לגבי הסתיידותה ותהליכי הצמיחה שלה. לאחר התפתחות האינדוקציה של פוליפ, החוקרים הצליחו לחקור את ההיווצרות הראשונית של שלד האלמוגים ולדמיין באופן ישיר הלבנת אלמוגים בסולם הפוליפים.