תא מיון המופעל על ידי קרינה פלואורסצנטית לבידוד של אוכלוסיות תאים בלובן המין

האלמוגים יוצרים מערכות אקולוגיות ביושונות החשובות הן לבני אדם והן לאורגניזמים ימיים. עם זאת, אנו עדיין לא מבינים את מלוא הפוטנציאל והתפקוד של תאי אלמוגים רבים. כאן אנו מציגים פרוטוקול שפותח עבור הבידוד, התיוג וההפרדה של אוכלוסיות של תאי אלמוגים מאבן.

פרוטוקול זה מאפשר זיהוי ובידוד של אוכלוסיות תאי אלמוגים חיים ברמה תיאורית שלא הייתה אפשרית קודם לכן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת גישה לרמה של ספציפיות תאים שעד כה הייתה ברובה בלתי ניתנת להשגה. הדגמת ההליך תהיה ד"ר שאנון סיי, עמיתת מחקר מהמשאב המשותף של ציטומטריית הזרימה במרכז הסרטן המקיף סילבסטר.

כדי להגדיר את ציטומטר הזרימה למיון תאי אלמוגים חיים, פתח תבנית פרוייקט חדשה בתוכנת ציטומטר הזרימה ובחר את הלייזרים המתאימים לניתוח בלוח הלייזר. לאחר מכן, צור פיזור צדדי לעומת חלקת פיזור קדימה בחלקות המתאימות לקביעת אסטרטגיית הגתה והניתוח. לצורך ניתוח ציטומטרי זרימה ומיון של תאי האלמוגים החיים, טען את דגימת התאים שאינם נגועים בתא הדגימה של הציטומטר והתחל את תהליך הקריאה.

מאז תאי האלמוגים הם שבירים במיוחד, לשמור על לחץ ציטומטר נמוך כדי למנוע תמוגה התא. בעלילה פיזור, להתאים את מתח מכפיל התמונה למרכז הנקודות ולהתחיל להקליט את האירועים. בחלקת פיזור קדימה לעומת צד, ליצור שער סביב התאים בסביבות 10 עד 4 סימן על ציר x פיזור קדימה.

החלף את דגימת הבקרה בדגימה הראשונה של תאים מוכתמים והקליט כ- 10,000 תאים לפני ההושהות. לאחר מכן שער את האירועים הייחודיים לקבוצת המדגם המוכתמת. כדי למיין תאי אלמוגים חיים, לאחר בחירת אוכלוסיית התאים המעניינים את תוכנת ציטומטר הזרימה, מקם צינור מיקרוצנטריפוגה אחד המכיל 250 עד 500 מיקרוליטרים של פתרון האיסוף המתאים לתא איסוף הציטרומטר עבור כל אוכלוסייה למיון.

לאחר פרק זמן מתאים עבר כדי לשטוף את הפסולת, להתחיל למיין את האוכלוסייה הרצויה לאסוף בכל מקום מ 10, 000 עד כמה מיליוני תאים. בכל פעם נעשה שימוש בכתם, מינים או סדרן חדשים, מיין לפחות 20, 000 תאים בעלי עניין ל-500 מיקרוליטרים של מדיום מכתים כדי לאפשר בדיקת טוהר על אוכלוסיית העניין ולניתוח מחדש של התאים ממוינים כדי לאשר שהאירועים נקראים בתוך השער המשמש למיון הראשוני. למחקרי במבחנה, אחסן את התאים ממוינים על הקרח עד שהם יועברו לאנקובטור או לסביבה מעקרת.

כדי להביא חלקיקים אחרים שאינם תאיים שאינם חולקים את אותה צורה או צפיפות כמו תאי האלמוגים ניתן להסיר מהניתוח על ידי יצירת בחירת שער על חלקת פיזור קדימה וצד. ניתן לא לכלול את התאים המתים על-ידי השוואת אות ה- DAPI של מתלי התאים שאינם מוכתמים ומוכתמים באמצעות היסטוגרמה ו- gating החוצה את התאים הגבוהים המבטאים DAPI. במקביל, תאים המארחים סימביודזיה של שפעת אוטומטית ניתן להסיר על ידי gating נגד תאים עם האות הגבוה בערוץ האדום הרחוק.

לאחר תהליך גתים איטרטיבי זה, התאים הנותרים מייצגים את אוכלוסיות תאי האלמוגים החיים ללא פגע חסרי סימביודזיה. תאים אלה יכולים להיות מסווגים לאחר מכן תת-כפילויות תאים שונים על ידי כתמים עבור תכונות כגון פעילות מיני חמצן תגובתי ו / או תוכן lysosome. זה קריטי לזכור כי תאים מסוימים הם שבירים יותר מאחרים ולהפעיל את התהליך הזה בזהירות רבה ככל האפשר.

לאחר שתאים מסוימים בודדו, ניתן להשתמש בהם עבור בדיקות פונקציונליות של x-vivo כגון יצירת תרבויות תאים ויצירת פרופילים תעתיקים.