תמיכה מרוכבת במטריצה חוץ-תאית מיקרוג'ל להדפסה תלת-ממדית משובצת של מבנים עצביים אנושיים

הדפסה תלת-ממדית מוטבעת בתוך חומרים מרוכבים של SHAPE מתגברת על מגבלות ייצור ביולוגי מסורתיות כדי לאפשר תבניות מדויקות של רקמות רגישות מכנית בתוך הידרוג'לים הדומים לסביבה החוץ תאית המקורית. ארגז הכלים של SHAPE מסתמך על עיצוב ביו-חומרים מודולרי, המאפשר שינויים קלים בניסוח התמיכה בהדפסה. הוא גם ממנף חומרים בעלות נמוכה וציוד נגיש להתאמה פשוטה על ידי קבוצות מחקר אחרות.

גישה זו יכולה להיות מיושמת ליצירת מודלים מרחביים של רקמות עצביות אנושיות לבחינת התפתחות עצבית ותקשורת בהפרעות נוירודגנרטיביות כגון פרקינסון. התחילו בהכנת תמיסת סידן פחמתי במים אולטרה-טהורים בריכוז של שני מיליגרם למיליליטר. מערבבים אותו עם תמיסת אלגינט ביחס שווה ומערבבים אותו מגנטית ב-650 סל"ד למשך שעה בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן מוסיפים חומצה אצטית לתערובת זו ביחס של אחד עד 500 ומערבבים שוב למשך הלילה. למחרת, באופן מכני לשבור את תמיסת אלגינט jelled לתוך microparticles ב 15, 000 סל"ד במשך 10 דקות באמצעות homogenizer. ואז צנטריפוגה כדי להשיג את המיקרו-חלקיקים.

יש להשליך בזהירות את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את החלקיקים ב-DMEM, המכיל שני מילימולרים נתרן הידרוקסידי ו-1% פניצילין סטרפטומיצין. צבע המתלים אמור להשתנות בחזרה לאדום. דוגרים על המתלה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה, הומוגניזציה של המתלים במשך שלוש דקות ב 15, 000 סל"ד וצנטריפוגה ב 18, 500 G במשך 10 דקות. לאחר הצנטריפוגה, הסירו את הסופרנאטנט והתבוננו בכדורית למיקרו-חלקיקי אלגינט צפופים. כדי ליצור את החומר המרוכב SHAPE, ערבבו את כדורית המיקרו-חלקיקים של אלגינט עם קולגן מדולל ומנוטרל ביחס של שניים לאחד ופיפטה אותה מעלה ומטה על קרח.

מעבירים את החומר המרוכב שנוצר לצלחת באר מקוררת 24. לפני ההדפסה, נתק את תאי הגזע העצביים האנושיים שגודלו בעבר בתרבית או hNSCs באמצעות תמיסת טריפסין 0.025% למשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן נטרלו את הטריפסין עם מדיום הגידול וצנטריפוגו את תרחיף התא ב 400 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הסרת supernatant, resuspend את גלולת התא בשניים עד שלושה מיליליטר של מדיום צמיחה. באמצעות מחט מתכת קהה 21 מד, לטעון 100 מיקרוליטר של חלקיקי אלגינט ארוזים היטב לתוך המזרק. לאחר מכן לטעון את השעיית התא מוכן לתוך מזרק.

להדפסה, החלף את מחט הטעינה במחט מתכת קהה 27 מד. באמצעות תוכנת הפניה, לאחר עיצוב המבנה להדפסה, לחץ על צור ליצירת קוד G. הכנס את המזרק הטעון בתא לראש שחול נפחי במדפסת ביולוגית מבוססת שחול ורשום את אורך המחט על ידי לחיצה על תהליך מדידת אורך המחט ההתחלתי.

לאחר מכן הניחו את צלחת 24 הבארות הטעונה ב- SHAPE מרוכב על המדפסת, ולחצו על SHM כדי למדוד את גובה משטח הבאר הריק. בחר pH 2 ואחריו סמל מפתח ברגים. לאחר מכן, תחת ערכת הפרמטרים, שנה את קצב זרימת עוצמת הקול ל -3.6 מיקרוליטר לשנייה ולחץ על החל פרמטר, ואחריו שמור ובוצע.

טען את קוד G לממשק המשתמש של המדפסת על-ידי לחיצה על סמל עבור קוד G פתוח. בחר את הסמל עבור תוכנית ההפעלה כדי להתחיל את הליך ההדפסה. מיד לאחר ההדפסה, יש לדגור על ג'ל SHAPE בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לחישול.

לאחר מכן הוסף בעדינות מדיום צמיחה לתמיכה בג'ל SHAPE מחושל. עבור immunostaining, להסיר את המדיום העודף מן הג'ל, ובאמצעות מרית, להעביר את הג'ל למיכל המכיל DPBS. לאחר שהצלחת מונחת במכסה האדים, הסר את ה- DPBS.

מכסים את הג'ל בתמיסת פורמלדהיד 4% ודגרים במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפה עם DPBS, הוסף את הפתרון החוסם לג'ל. רוקדים את הצלחת בעדינות ודגרים במשך שש שעות בטמפרטורת החדר כדי למנוע קשירה לא ספציפית.

לאחר הסרת התמיסה החוסמת, הוסיפו את הנוגדן העיקרי לג'ל ונענעו אותו בעדינות. דוגרים על הצלחת במשך 48 שעות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שטיפת DPBS, יש לטפל באופן דומה בג'ל עם תמיסת הנוגדנים המשנית למשך 24 שעות.

מניחים את הג'ל המוכתם עם מרית לתוך צלחת באר עם תחתית הדמיה דקה לפני ההדמיה. במחקר הנוכחי, דיו hNSC הדפיס חוט להט של תאים בקוטר של כ-200 מיקרומטר. הגדילים המודפסים היו עשירים בתאים בני קיימא עם מורפולוגיה מסביב.

לאחר 30 יום של הדפסה, התאים הציגו מורפולוגיה עצבית עם גופי תאים קטנים ותהליכים דקים ארוכים, אשר הצביעו על התמיינות מוצלחת של hNSCs. צביעה עם טובולין בטא שלוש אפשרה הדמיה של רשתות עצביות שנוצרו עם גיאומטריה מתוחזקת. ובמהלך תהליך ההתמיינות, התאים לא נדדו החוצה מהגדילים המודפסים.

ניתן להשתמש ב- SHAPE composite ליצירת ערוצים מתבלבלים על-ידי הדפסת דיו קורבן במקום תאים. יתר על כן, התמיכה יכולה לכלול חרוזים רגישים לחמצן כדי לנטר מתח חמצן במבנים מודפסים בתלת-ממד לאורך זמן ומרחב.