אנטומיה השראה תלת מימדי מיקרו רקמות מתוכנן רשתות עצביות עבור שחזור מערכת העצבים, אפנון, דוגמנות

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של רשתות עצביות מהנדסות מרקמות-מיקרו, או micro-TENNs, שהן מבנים תלת-ממדיים זעירים המורכבים ממסלולים אקסוניים ארוכים ומסודרים החוצים אוכלוסיות נוירונליות נפרדות בתוך הלומן של הידרוג'ל צינורי. micro-TENNs משחזרות את האנטומיה הכללית ברמת המערכת של הקונקטום המוחי, ובמיוחד קבוצות של נוירונים דומות תפקודית המחוברות על ידי מסלולים אקסוניים ארוכים. מכיוון שהן גדלו מראש כדי לחקות את הציטו-ארכיטקטורה של מסלולי המוח, ניתן להשתמש ב-micro-TENNs לשחזור ממוקד של מעגלים עצביים שאבדו עקב טראומה או מחלה נוירודגנרטיבית, וכמודלים ביו-פידליים למחקרים נוירוביולוגיים.

אחד ההיבטים המאתגרים ביותר של פרוטוקול זה הוא העבודה עם גודל של מיקרונים, אשר הכרחי על מנת לאפשר הזרקה זעיפית (minimally invasive) לתוך המוח. התחילו בשבירה ידנית של צינורות קפילריה מזכוכית למקטעים של 2 עד 2.5 סנטימטרים, והחדירו מחט דיקור אחת לכל מקטע. העבירו 1 mL של agarose בריכוז 3% ב-DPBS למשטח של צלחת פטרי ריקה.

תוך כדי החזקת צינור הנימי בתוך המחט שהוכנסה, הניחו קצה אחד של הצינור במגע עם מאגר האגרוז הנוזלי כדי למלא אותו באמצעות פעולת נימיות. כאשר הנוזל מפסיק לעלות, הוציאו את צינור הנימי מהמאגר והניחו אותו באופן אופקי על פני שטח של צלחת פטרי. לאחר מכן, הניחו את האגודל ואת האצבע המורה משני צדי הצינור ואחזו בו בחוזקה.

השתמש ביד השנייה כדי למשוך במהירות את המחט החוצה, בעוד האגודל והאצבע המורה מונעים מהמיקרו-עמודה עצמה להחליק אל מחוץ למבחנה. לאחר מכן, הכנס מחט במידה 30-gauge לתוך צינור הנימי כדי לדחוף לאט את המיקרו-עמודה החוצה אל תוך צלחת המכילה DPBS. העבר בזהירות מיקרו-עמודה אחת מ-DPBS לצלחת ריקה באמצעות פינצטה עדינה.

הוסף 10 µL של DPBS לחלקו העליון של המיקרו-עמוד באמצעות מיקרופיפט כדי למנוע התייבשות. תוך כדי עבודה תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, גזום את המיקרו-עמוד בעזרת מיקרו-סקלפל כדי לקצר אותו לאורך הרצוי. לאחר מכן, השתמש בפינצטה עדינה כדי להעביר את המיקרו-עמוד הגזוז לצלקת פטרי אחרת המכילה DBPS.

עקרו את המיקרו-עמודים שבצלוחיות הפטרי המכילות DPBS תחת אור על-סגול למשך 30 דקות. השתמשו במקדח כדי לקדוח 16 חורים במערך של 4 על 4 בסנטימטרים, עם מרווח של 1 סנטימטר, במכסה של צלוחית פטרי בקוטר 10 סנטימטרים. בתוך מנדף כימי, השתמשו בחלק התחתון של צלוחית פטרי כדי לשקול 27 גרם PDMS ושלושה גרם של חומר מעקש.

ערבבו בעזרת מיקרו-שפכטל כדי לפזר את החומר באופן אחיד. לאחר מכן, כסו את חומר ההקשיה של ה-PDMS בעזרת המכסה המחורר. חברו קצה אחד של צינור לפתח הוואקום של מ这篇文章מגריר העשן, והכניסו את הקצה השני לתוך גבעול של משפך בגודל מתאים.

הנח פומפית של פפיטה של 1 מיליליטר על טיפ של 1 מיליליטר לתוך הצינור, ומשוך את הצינור כלפי מעלה עד שהפומפית אוטמת את הצינור אל גבעול המשפך. לאחר מכן, הנח את המשפך על מכסה הצלחת הניקובה ואבטח את הצינור באמצעות תמיכה חזקה זמינה. פתח את שסתום הוואקום למשך חמש דקות כדי ליצור שאיבה ולהעלות את בועות האוויר אל פני השטח.

לאחר חמש דקות, סגרו את השסתום, הסירו את המשפך, והקישו את צלחת הפטרי נגד משטח מנדף העשן מספר פעמים כדי לפוצץ בועות אוויר שנותרו. הניחו תבנית מודפסת בתלת-ממד עם באר פירמידלית בכל אחת מהבארים בצלחת תרבית של 12 בארים, כאשר הפירמידות פונות כלפי מעלה. לאחר מכן, מזגו את חומר ההקשיה של ה-PDMS מעל התבניות עד שכל באר בצלחת תהיה מלאה.

העבירו את הצלחת המכוסה לתנור למשך שעה אחת בטמפרטורה של 60 °C לייבוש. לאחר עיקור של מערכי ה-PDMS באמצעות אוטוקלאב, ובעבודה בתוך קבינת בטיחות ביולוגית, הכניסו מערך מיקרו-בארים אחד לכל באר בצלחת סטרילית של 12 בארים. כדי ליצור את התجمעות העצביות, השתמשו במיקרופיפט כדי להוסיף 12 µL של תרחיף תאים לכל מיקרו-באר במערך ה-PDMS.

סובב את הפלטה בצנטריפוגה ב-200 ×g למשך חמש דקות כדי להכריח את התאיים להצטבר בתחתית המיקרו-בארים. לאחר מכן, הוסף בזהירות כ-2 milliliters של מצע גידול לחלק העליון של כל מערך PDMS כדי לכסות את כל המיקרו-בארים שבהם נזרעו התאים. הדגר את הפלטה למשך 12 עד 24 שעות ב-37 °C וב-5% carbon dioxide.

כדי להתחיל בייצור ליבת ה-CEM, ערבבו קולגן מסוג 1, למינין ומצע גידול במבחנה למיקרו-צנטריפוגה והתאימו את ה-pH לטווח של 7.2 עד 7.4. לאחר מכן, הניחו את המבחנה המכילה את ה-CEM על קרח. השתמשו בפינצטה סטרילית כדי להעביר את המיקרו-עמודים לצלוחיות פטרי ריקות בקוטר 35 או 60 מילימטרים.

לאחר מכן, תוך עבודה תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, השתמשו בטיפ של 10 µL המחובר לטיפ של 1000 µL כדי לשאוב שאריות של DPBS ובועות אוויר מהלומן. שאבו במהירות 4 עד 5 µL של CEM באמצעות מיקרופיפט, לאחר מכן הניחו את קצה המיקרופיפט בקצה אחד של מיקרו-עמודה, ופלטו כמות מספקת של CEM כדי למלא את הלומן. כדי למנוע התייבשות, הוסיפו 2 µL של CEM מסביב לכל מיקרו-עמודה.

דגרו את מיקרו-עמודוני ה-CEM מהידרוג'ל בצלחות פטרי בטמפרטורה של 37 °C בריכוז 5% carbon dioxide למשך 15 דקות. עברו לזריעת תאים מיד לאחר הדגירה. העבירו כ-10 עד 20 µL של מצע גידול לשני אזורים פנויים בצלחות הפטרי שבהן נמצאים המיקרו-עמודונים.

השתמשו במיקרופיפט כדי לאסוף את הצברים העצביים באופן פרטני, והעבירו אותם לצלחת הפטרי המכילה את המבנים. העבירו את הצברים בעזרת פינצטה לאחת מבריקות המצע התרביתי הקטנות כדי לשמור על בריאות התאים. תוך כדי תצפית תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי, השתמשו בפינצטה כדי להכניס צבר לקצה אחד של המיקרו-עמודים עבור micro-TENNs חד-כיווניים, או לכל קצה עבור ארכיטקטורה דו-כיוונית.

לאחר מכן, העבירו את המיקרו-עמוד המוזרע אל בריכת המדיום התרביתי הקטנה השנייה כדי למנוע התייבשות ולשמור על בריאות האגרגטים. כאשר כל המיקרו-עמודים טעונים, דגרו בטמפרטורה של 37 °C בריכוז של 5% carbon dioxide למשך 45 דקות כדי לאפשר לאגרגטים להיצמד ל-CEM. לאחר הדגירה, ודאו באמצעות מיקרוסקופ סטריאו שהאגרגטים נותרו בקצות המיקרו-עמודים.

לבסוף, מלאו בזהירות את צלחוני הפטרי המכילים את ה-micro-TENNs במצע גידול באמצעות פיפטה. הניחו את הצלחונים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C בריכוז של 5% carbon dioxide לתרבית ארוכת טווח. תמונות ניגוד מופע אלו מציגות micro-TENNs חד-כיווניים באורך 2-milliliter עד שמונה ימים in-vitro.

בתמונות אלו, שימו לב לצבירי הנוירונים בקצוות של המיקרו-עמוד, בעוד שצבירי האקסונים המסודרים נשלחים לרוחב החלל הפנימי (lumen). כפי שנראה כאן, צבירי האקסונים מתרחבים כמעט לאורך כל המיקרו-עמוד לאחר חמישה ימים in-vitro. עבור micro-TENNs דו-כיווניים באורך 5 מילימטר, צבירי האקסונים מאכלסים את אורך המיקרו-עמוד ביום ה-5 in-vitro, ומבנה זה נשמר לפחות עד היום ה-10 in-vitro.

שתי התמונות הבאות יכולות לסייע בפתרון בעיות בתהליך. תמונה זו מציגה מיקרו-עמודה של הידרוג'ל מיובשת לחלוטין כתוצאה מהסרה מלאה ו/או התאדות של DPBS, CEM או מצע גידול במהלך הייצור. תמונה זו מציגה מיקרו-עמודה שבה הלומן נמצא לאורך הדופן החיצונית עקב חוסר ביישור קונצנטרי של מחט האקופונקטורה ביחס לצינור הנימי.

לבסוף, תמונה קונפוקלית זו מראה micro-TENN דו-כיווני לאחר 28 ימים in-vitro, הצבוע עבור גרעיני תאים ב-Hoechst בכחול, עם אקסונים המסומנים ב-tudge one באדום, ובוטונים פרה-סינפטיים המסומנים ב-synapsin 1 בירוק. ניתן לראות נדידת תאים מהאגרגטים לאורך המסלולים האקסונליים בנוכחות טרמינלים פרה-סינפטיים, כפי שהוצע. Micro-TENNs הם מבנים עצמאיים בהשראה אנטומית המדמים היבטים מרכזיים של ציטו-ארכיטקטורת הקונקטום; לכן, micro-TENNs עשויים לספק אמצעי להחלפת מסלולים עצביים שאבדו לאחר השתלה במוח.

מרכיבים מכריעים בשיטה זו כוללים את תכנית המעטפת של הביומטריאל הצינורי, המאפשרת צמיחה אקסונית אורכית, ואת שיטת האגרגציה, המבטיחה השגה של הציטו-ארכיטקטורה הנכונה של גופי התאים המוגבלים לקצוות של המסלולים האקסוניים לאורך החלק הפנימי. לאחר השליטה בשיטות אלו, ניתן ליישם את עקרונות הטכניקה לבניית micro-TENNs עם פנוטיפים תאיים ומרכיבי ביומטריאל אחרים, בהתאם ליישום הספציפי.