אנטומיה השראה תלת מימדי מיקרו רקמות מתוכנן רשתות עצביות עבור שחזור מערכת העצבים, אפנון, דוגמנות

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של רשתות עצביות מהונדסות מיקרו-רקמות או מיקרו-TENNs, שהם מבנים תלת מימדיים מיניאטוריים המורכבים ממסלולים אקסונליים ארוכים מיושרים המשתרעים על אוכלוסיות עצביות נפרדות בתוך לומן של הידרוג'ל צינורי. מיקרו-TENNs משכפלים את האנטומיה ברמת המערכת הכללית של הקונקטום במוח, באופן ספציפי, קבוצות דומות מבחינה תפקודית של נוירונים המחוברים על ידי מסלולים אקסונליים ארוכים. מכיוון שהם גדלים מראש כדי לחקות את הציטו-ארכיטקטורה של מסלולי המוח, ניתן ליישם מיקרו-TENNs לשחזור ממוקד של מעגלים עצביים שאבדו עקב טראומה או מחלה ניוונית וכמודלים ביו-פידליים למחקרים נוירוביולוגיים.

אחד ההיבטים המאתגרים ביותר של פרוטוקול זה הוא עבודה עם גורם הצורה בקנה מידה מיקרוני, שבסופו של דבר הכרחי כדי לאפשר אספקה זעיר פולשנית למוח. התחל בשבירת ידנית של צינורות נימי זכוכית לשברים של 2 עד 2.5 סנטימטרים, והכנס מחט דיקור אחת לכל שבר. העבירו מיליליטר אחד של שלושה אחוזים אגרוז ב-DPBS אל פני צלחת פטרי ריקה.

החזק את צינור הנימים במחט שהוחדרה, הנח קצה אחד של הצינור במגע עם בריכת האגרוז הנוזלית כדי למלא אותה בפעולה נימית. כאשר הנוזל מפסיק לעלות, הסר את צינור הנימים מהבריכה, והניח אותו אופקית על פני צלחת פטרי. לאחר מכן, הנח את האגודל והאצבע המורה משני צידי הצינור ואחז בחוזקה.

השתמש ביד השנייה כדי למשוך במהירות את המחט החוצה בזמן שהאגודל והאצבע המורה מונעים מהמיקרו-עמוד עצמו להחליק החוצה מהצינור. לאחר מכן הכנס מחט בגודל 30 לתוך הצינור הנימי כדי לדחוף לאט את המיקרו-עמוד החוצה לתוך צלחת המכילה DPBS. העבירו בזהירות מיקרו-עמוד אחד מ-DPBS לצלחת ריקה באמצעות מלקחיים עדינים.

הוסף 10 מיקרוליטר DPBS לחלק העליון של עמודת המיקרו עם מיקרו-פיפט למניעת ייבוש. תוך כדי עבודה תחת סטריאומיקרוסקופ, הפעילו את המיקרו-עמוד בעזרת אזמל מיקרו כדי לקצר אותו לאורך הרצוי. לאחר מכן השתמש במלקחיים עדינים כדי להעביר את המיקרו-עמוד הגזוז לצלחת פטרי אחרת המכילה DBPS.

עקר את המיקרו-עמודים בצלחות הפטרי המכילות DPBS באור אולטרה סגול למשך 30 דקות. השתמש במקדחה כדי לנקב 16 חורים כמערך של 4 סנטימטר 4 על 4 עם הפרדה של 1 סנטימטר למכסה של צלחת פטרי בגודל 10 סנטימטר. בתוך מכסה אדים כימי, השתמש בחלק התחתון של צלחת פטרי כדי לשקול 27 גרם PDMS ושלושה גרם חומר ריפוי.

מערבבים בעזרת מרית מיקרו כדי להפיץ את הסוכן באופן שווה. לאחר מכן מכסים את חומר הריפוי PDMS במכסה המנוקב. חבר קצה אחד של צינור ליציאת הוואקום של מכסה האדים, והכנס את הקצה השני לגזע של משפך בגודל מתאים.

הנח נורת פיפטה של 1 מיליליטר על קצה של 1 מיליליטר לתוך הצינור, ומשוך את הצינור כלפי מעלה עד שהנורה אוטמת את הצינור לגזע המשפך. לאחר מכן, הנח את המשפך על מכסה הכלים המנוקב ואבטח את הצינור עם תמיכה יציבה זמינה. פתח את שסתום הוואקום למשך חמש דקות כדי לשאוב ולהעלות את בועות האוויר אל פני השטח.

לאחר חמש דקות, סגור את השסתום, הסר את המשפך והיכה את צלחת הפטרי על פני מכסה המנוע כמה פעמים כדי לפוצץ את כל בועות האוויר שנותרו. הניחו תבנית מודפסת בתלת מימד של באר פירמידה בכל אחת מהבארות בצלחת תרבית של 12 בארות כשהפירמידות פונות כלפי מעלה. לאחר מכן יוצקים את חומר הריפוי PDMS על גבי התבניות עד שכל באר של הצלחת מתמלאת.

מעבירים את הצלחת המכוסה לתנור למשך שעה בחום של 60 מעלות לייבוש. לאחר עיקור מערכי ה-PDMS על ידי חיטוי, ועבודה בארון בטיחות ביולוגית, הכנס מערך מיקרו-בארות אחד לכל באר של צלחת סטרילית של 12 בארות. כדי ליצור את הצברים העצביים, השתמש במיקרו-פיפטד כדי להוסיף 12 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל מיקרו-באר של מערך ה-PDMS.

צנטריפוגה את הצלחת ב-200 פעמים גרם למשך חמש דקות כדי לאלץ את צבירת התאים בתחתית המיקרו-בארות. לאחר מכן הוסף בזהירות כשני מיליליטר של מדיום תרבית לחלק העליון של כל מערך PDMS כדי לכסות את כל המיקרו-בארות הזרעים. דגרו את הצלחת למשך 12 עד 24 שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני.

כדי להתחיל בייצור ליבת CEM, ערבבו קולגן, למינין ומדיום תרבית מסוג 1 בצינור מיקרו צנטריפוגה והתאימו את ה-pH ל-7.2 עד 7.4. לאחר מכן הנח את השפופרת המכילה CEM על קרח. השתמש במלקחיים סטריליים כדי להעביר את המיקרו-עמודים לריקון צלחות פטרי של 35 או 60 מילימטר.

לאחר מכן, תוך כדי עבודה תחת סטריאומיקרוסקופ, השתמש בקצה של 10 מיקרוליטר המחובר לקצה של 1000 מיקרוליטר כדי לחלץ שאריות DPBS ובועות אוויר מהלומן. שאב במהירות ארבעה עד חמישה מיקרוליטר של CEM במיקרו-פיפט, ואז הנח את קצה המיקרו-פיפט בקצה אחד של מיקרו-עמודה, ושחרר מספיק CEM כדי למלא את הלומן. כדי למנוע התייבשות, הוסף שני מיקרוליטר CEM סביב כל מיקרו-עמודה.

דגרו את עמודות המיקרו של ההידרוג'ל CEM בצלחות פטרי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני למשך 15 דקות. המשך לזריעת תאים מיד לאחר הדגירה. העבירו כ -10 עד 20 מיקרוליטר תרבית בינונית לשני אזורים פנויים בצלחות הפטרי המחזיקות את עמודי המיקרו.

השתמש במיקרופיפטד כדי לאסוף את הצברים העצביים בנפרד, והעביר אותם לצלחת הפטרי המכילה את המבנים. העבירו את האגרגטים בעזרת מלקחיים לאחת המאגרים הקטנים של מדיום התרבית כדי לשמור על בריאות התאים. תוך כדי התבוננות תחת סטריאומיקרוסקופ, השתמש במלקחיים כדי להכניס אגרגט בקצה אחד של המיקרו-עמודות עבור מיקרו-TENNs חד-כיווניים, או בכל קצה לארכיטקטורה דו-כיוונית.

לאחר מכן העבירו את המיקרו-עמוד הזרוע למאגר הקטן השני של מדיום התרבית כדי למנוע התייבשות ולשמור על בריאות המצטברת. לאחר טעינת כל המיקרו-עמודות, יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% פחמן דו חמצני למשך 45 דקות כדי לאפשר לאגרגטים להיצמד ל-CEM. לאחר הדגירה, ודא שהאגרגטים נשארים בקצות המיקרו-עמודות באמצעות הסטריאומיקרוסקופ.

לבסוף, הציפו בזהירות את צלחות הפטרי המכילות את המיקרו-TENN במדיום תרבית באמצעות פיפטה. מניחים את הכלים בחממה בחום של 37 מעלות צלזיוס ב -5% פחמן דו חמצני לתרבית ארוכת טווח. תמונות ניגודיות פאזה אלה מציגות מיקרו-TENNs חד-כיווניים באורך 2 מיליליטר עד שמונה ימים במבחנה.

בתמונות אלה, שימו לב לאגרגטים העצביים בקצוות המיקרו-עמודה בעוד המסלולים האקסונליים המיושרים מקרינים על פני הלומן. כפי שניתן לראות כאן, מסלולים אקסונליים משתרעים כמעט לכל אורך המיקרו-עמודה בחמישה ימים במבחנה. עבור מיקרו-TENN דו-כיווני של 5 מילימטר, מסלולים אקסונליים מאכלסים את אורך המיקרו-עמודה ב-5 ימים במבחנה, וארכיטקטורה זו נשמרת לפחות עד 10 ימים במבחנה.

שתי התמונות הבאות יכולות לסייע בפתרון בעיות בהליך. תמונה זו מציגה מיקרו-עמודת הידרוג'ל מיובשת לחלוטין כתוצאה מהסרה ו/או אידוי מוחלט של DPBS, CEM או מדיום תרבית במהלך הייצור. תמונה זו מציגה מיקרו-עמוד עם לומן המצפה את הדופן החיצונית עקב היעדר יישור קונצנטרי של מחט הדיקור עם צינור הנימים.

לבסוף, תמונה קונפוקלית זו מציגה מיקרו-TENN דו-כיווני ב-28 יום במבחנה, צבוע לגרעיני תאים עם Hoechst בכחול, ועם אקסונים המסומנים ב-tudge one באדום, ובוטונים קדם-סינפטיים מסומנים ב-synapsin 1 בירוק. נדידת תאים מהאגרגטים לאורך המסלולים האקסונליים נראית בנוכחות מסופים פרה-סינפטיים כפי שהוצע. Micro-TENNs הם מבנים עצמאיים בהשראה אנטומית המחקים היבטים מרכזיים של ציטו-ארכיטקטורת קונקטום; לכן, מיקרו-TENNs עשויים לספק אמצעי להחלפת מסלולים עצביים שאבדו עם ההשתלה במוח.

מרכיבים מכריעים בשיטה זו כוללים את תוכנית המעטפת הביו-חומרית הצינורית, המאפשרת צמיחה אקסונלית אורכית, ושיטת הצבירה, המבטיחה השגת ציטו-ארכיטקטורה נכונה של גופי תאים המוגבלים לקצות המסלולים האקסונליים לאורך החלק הפנימי. לאחר שליטה בשיטות אלה, ניתן ליישם את עקרונות הטכניקה הזו לבניית מיקרו-TENNs עם פנוטיפים אחרים של תאים ורכיבים ביו-חומריים, בהתאם ליישום הספציפי.