Name: שיטות משופרות להכנת חתכים רוחביים ותושבות שלמות לא מגולגלות של פרימורדיה של עלי תירס להדמיה פלואורסצנטית וקונפוקלית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: למד שיטות משופרות להכנת חתכים רוחביים ותושבות שלמות לא מגולגלות של פרימורדיה של עלי תירס להדמיה פלואורסצנטית וקונפוקלית. הפרוטוקולים משפרים דיוק בחיתוך ומאפשרים בחינת תבניות ביטוי הורמונליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לשיתוף הפעולה בגנטיקה של תירס, פרויקט הגנומיקה של תאי תירס, דייב ג'קסון (מעבדת קולד ספרינג הארבור, ניו יורק), אן סילבסטר (מעבדה ביולוגית ימית, אוניברסיטת שיקגו, אילינוי), אנדראה גלאבוטי (אוניברסיטת ראטגרס, ניו ג'רזי) וקרולין ג. רסמוסן (אוניברסיטת קליפורניה, ריברסייד) על אספקת המניות המוטנטיות והטרנסגניות, כמו גם רוברט פ. בייקר ואלכסנדר יורקביץ' מליבת מיקרוסקופ האור המתקדם באוניברסיטת מיזורי-קולומביה על עזרתם במיקרוסקופ קונפוקלי. JMR נתמך על ידי מלגת ג'יי ויליאם פולברייט, קרן דיאן פ. ורוברט א. שארפ, והתוכנית לחקר גנום הצמח של הקרן הלאומית למדע (IOS-1546873) ל- PM. CDTC, CMRV, EDCDP ו- RJRR נתמכים על ידי תוכנית המלגות של מכללת אטנאו. CDTC, EDCDP ו- RJRR נתמכים על ידי מלגת DOST-SEI S&T לתואר ראשון. DODL נתמך על ידי Fr. Thomas Steinbugler SJ Academic Scholarship. RJRR נתמך על ידי Aiducation International-Pathways to Higher Education Scholarship. עבודה זו נתמכה על ידי בית הספר למדעים והנדסה וספריית ריזאל, אוניברסיטת אטנאו דה מנילה.

שיטות משופרות להדמיית פרימורדיה של עלי תירס

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

אנו מציגים שתי שיטות להכנת פרימורדיה של עלי תירס לדימות תאי. השיטה הראשונה (פרוטוקול סעיף 2) מאפשרת מדידה של הפרימורדיום לצורך ניתוח חתך רוחבי, ואילו השיטה השנייה (פרוטוקול סעיף 3) מאפשרת גלגול והשטחה של הפרימורדיום לצורך אנליזה של הרכבה שלמה. שיטות אלה מקלות על הדמיה תאית של FPs בפרימורדיה24 של עלי תירס (כפי שמוצג באיור 4 ובאיור 5) ומספקות פתרונות פשוטים לאתגרי הדמיה של עלי תירס מתפתחים. פרוטוקול סעיף 2 מקצר את זמן הדיסקציה ומשפר את דיוק הדגימה על ידי מדידת הפרימורדיה לפני החתך במקום להסתמך רק על פרמטרים 9,16. עם ננו טייפ זמין מסחרית, פרוטוקול סעיף 3 פותר את הבעיה ארוכת השנים של הדמיה של פרימורדיה של עלה שלם בתירס. פרוטוקול זה משפר את השיטה הקודמת, שהשתמשה בצינורות דיאליזה 31, והוא חלופה זולה בהרבה ל- CT ו- MRI11,32,33. עם זאת, כשמדובר בהדמיה של תכונות אנטומיות של עלים והפקת תוצאות אופטימליות, לשני הפרוטוקולים יש כמה מגבלות, המתוארות בטבלה 2 ונידונות ביתר פירוט להלן.
בפרוטוקול סעיף 2 נתקלנו בקושי לדמיין קווי מתאר של תאים בחתכים רוחביים עבים של פרימורדיה העלה, וצביעת נגד בצבעים פלואורסצנטיים קושרי דופן התא או פלסמה לא סיפקה תוצאות משביעות רצון. לדוגמה, FM 4-64 הפיק תוצאות תת-אופטימליות בהשוואה לסמן FP של קרום הפלזמה, p Zm PIP2-1::ZmPIP2-1:CFP39 (PIP2-1-CFP; איור 3A-D). כדי להתגבר על מגבלה זו, אנו ממליצים להשתמש בויברטום כדי לייצר קטעי רקמה דקים יותר (~0.1 מ"מ)58 אשר יאפשרו הדמיה חיה של שדה בהיר של קווי מתאר התא או אופטימיזציה של פרוטוקול הצביעה הנגדית 47,59.
בסעיף 3 של פרוטוקול, המגבלה העיקרית היא הקושי להרכיב את העלה ללא קרע, נזק או בועות אוויר, כמפורט בשלבי פרוטוקול 3.2.5-3.2.6 (איור 3E-K). מכיוון שעלה התירס סימטרי דו-צדדית, תושבת של חצי עלה ולא תושבת של עלה שלם עשויה להספיק להדמיה9. כדי לעשות זאת, פרימורדיום ניתן לחתוך עם סכין גילוח לאורך ציר האורך לאחר גלגול אותו עד אמצע הצלע, המאפשר רק מחצית העלה להיות רכוב. מגבלה נוספת של פרוטוקול סעיף 3 היא שעובי העלה יכול להגביל את הרזולוציה האופטית של אות הפלואורופור במהלך הדמיה עמוקה. כדי לטפל בבעיה זו, ניתן להשתמש בטכניקת ניקוי רקמות60. עם זאת, מצאנו כי ClearSee61, מגיב ניקוי נפוץ להדמיית רקמות צמחים, אינו תואם לפרוטוקול מכיוון שהוא גורם לדגימה ולכיסוי להתנתק מננו-קלטת. פתרון אפשרי לבעיה זו יכול להיות מריחת קרוםחדיר למחצה 31 על דגימת העלה, המאפשר לטפל בה בתמיסת הניקוי תוך החזקתה במקומה על ידי סרט הננו. שיטה כזו המאפשרת ליישם תמיסות נוזליות על העלה הלא מגולגל יכולה לשמש גם להכלאה של RNA באתרו שלם ולטכניקות אימונולוקליזציה, אשר הותאמו בעבר לפיתוח תפרחות תירס אך לא לפרימורדיה 62,63 של עלה שלם.
תיארנו פרוטוקולים לתירס, שיש לו פרימורדיה גדולה של עלים אפילו בשלב השתילה. מיני עשב אחרים עם פרימורדיה עלים קטנה בהרבה, כגון אורז, שעורה, חיטה, סטריה וברהיפודיום 16,23,64,65,66, עשויים לדרוש שימוש בכלים מדויקים נוספים כדי ליישם ביעילות פרוטוקולים אלה. יתר על כן, פרוטוקולים אלה לא נועדו לדימות תאים חיים, אשר לוכד בזמן אמת תהליכים דינמיים של היווצרות רקמות ותגובות תאיות. עם זאת, ככל שגשושיות פלואורסצנטיות, טכנולוגיות הדמיה ויכולות מחשוב ממשיכות להתקדם בדימות תאים חיים עבור צמחים67, מחקר עתידי יכול להתבסס על פרוטוקולים אלה כדי לפתח אסטרטגיות דימות תאים חיים המותאמות לתכונות הייחודיות של פרימורדיה של עלי דשא.

גידולי דשא הם מקור עיקרי של מזון ודלק ביולוגי לאוכלוסיית העולם1, ולשיפור האנטומיה של העלים יש פוטנציאל להגדיל את התפוקה שלהם 2,3. עם זאת, ההבנה הנוכחית שלנו לגבי האופן שבו אנטומיה של עלים מווסתת בעשבים מוגבלת4 ודורשת ניתוח של פרימורדיה של עלה, שכן תכונות אנטומיות ופיזיולוגיות רבות של העלה נקבעות מראש בשלב מוקדם בהתפתחות 5,6,7. טכניקות הדמיה תאית, כגון פלואורסצנטיות ודימות קונפוקלי, הן הכרחיות לחקר אנטומיה של עלי דשא ותכונות תאיות, אך קשה ליישם טכניקות אלה על פרימורדיה של עלי דשא מכיוון שהן עטופות עמוק ומגולגלות בתוך זונת העלים. טיפלנו בבעיה זו על ידי פיתוח שיטות להכנת חתכים רוחביים ותושבות עלים שלמים לא מגולגלים לניתוח פלואורסצנטי וקונפוקלי של פרימורדיה של עלי תירס, מערכת מודל לחקר אנטומיה והתפתחות של עלי דשא 2,8.
עלה התירס, כמו כל עלי העשב, מורכב מלהב דמוי רצועה עם נדן העוטף את הגבעול ומתפתח נבט 9,10,11,12,13. העלים מתפתחים מה-shoot apical meristem (SAM) בתבנית דיסטיכוסית, שבה כל עלה חדש מתחיל במיקום הפוך מהעלה הקודם, והתוצאה היא שתי שורות של עלים לאורך הציר האנכי (איור 1A)14. השלב ההתפתחותי של כל פרימורדיום עלים מזוהה על פי מיקומו ביחס ל-SAM, כאשר הפרימורדיום הקרוב ביותר מסומן כפלסטוכרון1 (P1) והפרימורדיה הבאה אחריו מסומנת כ-P2, P3 וכן הלאה (איור 1B,C)2. במהלך ההתפתחות (איור 1D), פרימורדיום העלים מופיע תחילה כתומך בצורת חצי סהר סביב בסיס ה-SAM (P1), ולאחר מכן גדל לפרימורדיום בצורת ברדס המשתרע מעל המריסטם (P2)9,10,11. השוליים הבסיסיים של מכסה המנוע מתרחבים לרוחב וחופפים זה את זה כאשר הקצה גדל כלפי מעלה, ויוצר פרימורדיום בצורת חרוט (P3-P5)10. לאחר מכן הפרימורדיום גדל במהירות באורכו, וגבול להב הנדן בבסיסו הופך בולט יותר עם היווצרות הליגולה, ההיטל דמוי השוליים בצד האדקסיאלי של העלה (P6/P7). לבסוף, העלה מתגלגל כשהוא יוצא מהזונה במהלך צמיחה במצב יציב, שבו התאים המתחלקים מוגבלים בתוך האזור הבסיסי הקטן של הלהב, ויוצרים שיפוע עם תאים מתרחבים ומתמיינים לאורך הציר הפרוקסימלי-דיסטלי (P7/P8)15. קודקוד הנבטה של שתיל תירס מכיל מספר פרימורדיה בשלבי התפתחות שונים, מה שהופך אותו למודל מצוין לחקר התפתחות עלים8.
ניתוח מדויק של התפתחות עלים מוקדמת דורש היערכות או שימוש בקריטריונים סטנדרטיים כדי להגדיר שלבים מובחנים של התפתחות ראשונית ביחס לצמיחה אחרת או פרמטרים מורפולוגיים. מכיוון שפרימורדיה של העלים מוסתרת בתוך נבט העשב, החוקרים בדרך כלל משתמשים בפרמטרים כגון גיל הצמח או גודל העלים המתעוררים כמנבאים לשלבים ולגדלים של פרימורדיה 9,16. בתירס, הגיל הכרונולוגי של הצמח נקבע על ידי מספר הימים לאחר השתילה או הנביטה (DAP/DAG)17,18. השלב הווגטטיבי (שלב V) נקבע על ידי העלה העליון עם צווארון גלוי, קו חיוור בצד האבקסי בין הלהב לנדן המתאים למיקום הליגול והאוריקלס, זוג אזורים בצורת טריז בבסיס הלהב (איור 1A,B)17,19. בין 20 ל 25 DAG, SAM הופך meristem תפרחת ומפסיק לייצר עלים חדשים20. שיעורי הצמיחה של פרימורדיה של עלי תירס יכולים להשתנות בהתאם לסביבה ולגנוטיפ של הצמח. מסיבה זו, גיל הצמח וגודל העלים המתעוררים אינם יכולים לחזות במדויק את גודל פרימורדיה העלים; עם זאת, שימוש בפרמטרים אלה יכול לעזור לחזות את טווח השלבים והגדלים של פרימורדיה למטרות ניסוי.
ניתוח חתך רוחבי הוא שיטה פופולרית לבחינת אנטומיה והתפתחות של עלים בתירס ועשבים אחרים מכיוון שהוא מאפשר דגימה של פלסטוכרונים מרובים בחתך אחד לאורך הנבטה21,22,23. שיטה זו נוחה גם להדמיה תאית של דגימות טריות, שכן העלים שמסביב משמשים כפיגום השומר על פרימורדיה העלה במקומה במהלך חתך והרכבה24. עם זאת, החיסרון של שיטה זו הוא שזה יכול להיות מאתגר לאתר במדויק את פלסטוסטרון המטרה ואת האזור בתוך הפרימורדיום בעת חתך מתוך יורה שלם. יתר על כן, מכיוון שצמיחת העלים משתנה בין פלסטוכרונים ולאורך הציר הפרוקסימלי-דיסטלי2,5, דגימה לא מדויקת עלולה לגרום לפרשנות שגויה של השלב ההתפתחותי והאזור של הפרימורדיום בקטע נתון. לכן, פיתוח שיטה לדיגום חתך רוחבי מדויק הוא קריטי להבטחת הדיוק והשחזור של ניתוחים אנטומיים והתפתחותיים של פרימורדיה של עלי דשא.
אנליזה של תושבות עלים שלמים מאפשרת חקירה מקיפה ואינטגרטיבית של תהליכים רקמתיים ותאיים המתרחשים בקנה מידה של איברים שלמים, כגון גדילה מתפשטת25 ותבנית ורידים26,27,28. השיטה מספקת סקירה פרדרמלית של העלה, ומאפשרת גילוי של תהליכים ודפוסים מובחנים שאחרת היה קשה לזהות באמצעות ניתוח חתך רוחבי24,27. שלא כמו בארבידופסיס, שם כבר קיימות שיטות מבוססות להדמיית תושבות עלים שלמים29,30, אין כיום שיטה סטנדרטית להדמיית תושבות עלים שלמים לא מגולגלים בעשבים. פרוטוקול קודם לגילוי פרימורדיה של עלי תירס מבודדים כלל חומרים נדירים ולא התאים להדמיה תאית31. טכניקות הדמיה מתקדמות, כגון טומוגרפיה ממוחשבת (CT) והדמיית תהודה מגנטית (MRI), יכולות לרכוש מידע אנטומי תלת ממדי מבלי לבודד ולפתוח את הפרימורדיה 11,32,33, אך הן יקרות ודורשות ציוד מיוחד. פיתוח טכניקה להתגבר על האילוצים שנכפו על ידי המורפולוגיה המגולגלת והחרוטית של פרימורדיה של עלים בתירס ועשבים אחרים יקדם חקירות של התכונות האנטומיות וההתפתחותיות שלהם.
כאן, אנו מציגים שיטות להכנת חתכים רוחביים ותושבות שלמות של פרימורדיה של עלי תירס להדמיה פלואורסצנטית וקונפוקלית. השתמשנו בשיטות אלה כדי לכמת את מספר הוורידים ולמפות את התפלגות ההורמונים המרחבית-טמפורלית בפרימורדיה של עלי תירס עם חלבונים פלואורסצנטיים (FPs)24. השיטה הראשונה כוללת הסרת החלק העליון של עלים ישנים משתילי תירס באמצעות חשפנית תיל (איור 1E). על ידי חשיפת קצה הפרימורדיום (P5-P7), ניתן לקבוע את אורכו ללא צורך להסיר לחלוטין את העלים הישנים יותר, ובכך לאפשר חתך קל ומדויק. השיטה השנייה כוללת גלגול והרכבה של פרימורדיה שלמה (P3-P7) עם ננו-טייפ דו-צדדי שקוף (איור 1F). שיטות אלה מתאימות להדמיה של FPs24 שונים, אך זקוקות לאופטימיזציה לשימוש בצבעים פלואורסצנטיים וריאגנטים לניקוי. בנוסף, אנו מתארים כמה הליכים לשיטוח ערימות z, תפירת תמונות ומיזוג ערוצים ב- ImageJ/FIJI34, החלים על התמונות המופקות בשתי השיטות. שיטות אלה שימושיות עבור פלואורסצנטיות שגרתית או הדמיה קונפוקלית של עלי תירס, אך ניתן להתאים אותן גם למיני עשב מודל אחרים, כגון אורז, סטריה וברהיפודיום.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig01.jpg"> איור 1: ארגון ומורפולוגיה של פרימורדיה של עלי תירס וסקירה כללית של השיטות . (A) ייצוג סכמטי של שתיל תירס. לתירס יש פילוטקסיה דיסטיכוסית, כאשר העלה החדש מתחיל במיקום הפוך מהעלה הקודם. מספר העלה מציין את הסדר הכרונולוגי שבו יצאו העלים מנביטה (כלומר, עלה ראשון, L1; עלה שני, L2; עלה שלישי, L3; וכו'). לכל עלה יש להב דיסטלי ונדן בזאלי התחום על ידי קולר המתאים לליגולה ולאוריקל. העלה העליון עם הצווארון הנראה לעין מציין את השלב הווגטטיבי. השתיל בדוגמה זו נמצא בשלב V2, כאשר צווארון L2 (ראש החץ) גלוי. סמל המספריים מציין את המיקום במזוקוטיל (me) שבו יש לחתוך את השתיל על מנת להיאסף. (B) ייצוג סכמטי של הירייה המנותחת המראה L1 עד L4 מבודדים, כאשר קדימות העלה L5 עד L9 מוצגות כתמונה מוגדלת ב-(C). מספר הפלסטוכרון מציין את מיקומו של הפרימורדיום ביחס ל-SAM, כאשר פרימורדיום העלה הצעיר ביותר (P1) הקרוב ביותר ל-SAM והעלה המבוגר יותר פרימורדיה (P2, P3, P4 וכן הלאה) רחוקים יותר ברצף2. (D) ייצוג סכמטי של המורפולוגיה של פרימורדיה של עלי תירס מ-P1 עד P5. (E) סקירה סכמטית של השיטה לניתוח חתך רוחבי של פרימורדיה עלה תירס. (1) גזור את העלים הישנים יותר עם חשפנית תיל. (2) למדוד את הפרימורדיום ולחתוך את היורה. (3) להרכיב את הקטע על שקופית לצורך הדמיה ועיבוד (4, 5). (F) סקירה סכמטית של השיטה לאנליזה מלאה של פרימורדיה של עלי תירס. (1) הסר את העלים שמסביב כדי לחלץ את הפרימורדיום. (2) גזור ופתח את הפרימורדיום שטוח על סרט הנאנו. (3) להרכיב את הדגימה לצורך הדמיה ועיבוד (4, 5). קיצורים: L = עלה; bl = להב; sh = נדן; co = צווארון; me = mesocotyl; V = צומח; P = פלסטוכרון; SAM = לירות meristem אפי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table><tbody><tr><td>אקריליק ג'ל שקוף דו צדדי ננו טייפ 16.5 רגל x 1.2 אינץ', עובי 2 מ"מ</td><td>חנות EZlifego (אמזון)</td><td>B07YB1ZXG6</td><td>1 גליל</td></tr><tr><td>Bellucci Pick מיקרו בדיקה מעוקל 16.8 ס"מ, 6.6 אינץ</td>' <td>Bausch & Lomb</td><td>N1692 9</td><td>1 pc</td></tr><tr><td>מדריך קליימן מיקרו-בדיקה Sinskey וו פיר זוויתי, 11.6 ס"מ, 4.6 אינץ</td>' <td>Storz Opthalmic Instruments</td><td>E0542</td><td>1 pc</td></tr><tr><td>בדיקה דנטלית, מחט כפופה, 14 ס"מ (5.5 אינץ')</td> <td>טד פלה</td><td>13553</td><td>1 pc</td></tr><tr><td>DOWELL 10-22 AWG מסיר חוטים</td><td>חנות Dowell (אמזון)</td><td>10-22 AWG</td><td>1 pc</td></tr><tr><td>נוצה קצה כפול להבי פלדת פחמן</td><td>טד פלה</td><td>121-9</td><td>pkg/10; לחיתוך עדין</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ זכוכית חלבית, 75 מ"מ x 25 מ"מ x 1-1.2 מ"מ</td><td>טד פלה</td><td>260442</td><td>חבילה/144</td></tr><tr><td>GEM קצה יחיד, להבים לא מצופים מנירוסטה</td><td>טד פלה</td><td>121-1</td><td>קופסה/200; לחיתוך/חיתוך כללי</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>PI17904</td><td>1 ליטר</td></tr><tr><td>ImageJ/FIJI עם תוסף EDF (גרסה 17.05.2021) ותוסף</td> <td>תפירת רשת/אוסףהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH) ארה"ב</td><td>גרסה 2.9.0/1.54s</td><td>תוסף ה-EDF פותח על ידי אלכס פרודנסיו, ג'סי ברנט ודניאל סייג' עבור קבוצת ההדמיה הביו-רפואית, &Eacute; קול פוליטכניק F&eacute; d&eacute; ראל דה לוזאן (EPFL; http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/). תוכנת תפירת הרשת/איסוף פותחה על ידי סטפן פריביש עבור מכון מקס פלאנק לביולוגיה מולקולרית של התא וגנטיקה (MPI-CBG).</td></tr><tr><td>Kimwipes Ex-L קטן 111.76 מ"מ x 213.36 מ"מ</td><td>Kimtech Science</td><td>34155</td><td>קופסה/280 שכבות</td></tr><tr><td>מיקרו כיסוי משקפיים, 22 מ"מ x 22 מ"מ x 0.13 - 0.16 מ"מ עובי</td><td>טד פלה</td><td>260140</td><td>1 אונקיה</td></tr><tr><td>PU ג'ל שקוף דו צדדי ננו טייפ 29.5 רגל x 1.18 אינץ', עובי 1 מ"מ</td><td>חנות Yecaye (אמזון)</td> <td>L354 W1.18</td><td>2 גלילים</td></tr><tr><td>משקפי כיסוי Superslip, 24 מ"מ x 50 מ"מ x 0.13 - 0.16 מ"מ עובי</td><td>טד פלה</td><td>260166</td><td>1 אונקיה</td></tr><tr><td>משקפי כיסוי Superslip, 24 מ"מ x 60 מ"מ x 0.13 - 0.16 מ"מ עובי</td><td>טד פלה</td><td>260168</td><td>1 אונקיה</td></tr><tr><td>קרש חיתוך זכוכית מחוסמת</td><td>Hacaroa (אמזון)</td><td>B09XMXBT5S</td><td>4 יחידות</td></tr></tbody></table>

שיטות משופרות להכנת חתכים רוחביים ותושבות שלמות לא מגולגלות של פרימורדיה של עלי תירס להדמיה פלואורסצנטית וקונפוקלית

Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging

בתירס (Zea mays) ובעשבים אחרים (Poaceae), פרימורדיה העלים סגורה עמוק ומגולגלת בתוך זונת העלים, מה שמקשה על חקר התפתחות העלים המוקדמת. במאמר זה אנו מתארים שיטות להכנת חתכים רוחביים ופרושים שלמים של פרימורדיה של עלי תירס לצורך הדמיה פלואורסצנטית וקונפוקלית. השיטה הראשונה משתמשת בחשפנית תיל כדי להסיר את החלקים העליונים של עלים ישנים, לחשוף את קצה פרימורדיום העלה ולאפשר את מדידתו לדגימת חתך רוחבי מדויקת יותר. השיטה השנייה משתמשת בננו-טייפ דו-צדדי שקוף כדי לפתוח ולהרכיב פרימורדיה של עלה שלם לצורך הדמיה. אנו מראים את התועלת של שתי השיטות בהדמיה וניתוח של כתבי חלבון פלואורסצנטי בתירס. שיטות אלה מספקות פתרון לאתגרים שמציבה המורפולוגיה הייחודית של פרימורדיה של עלי תירס ויהיו שימושיות להדמיה וכימות של תכונות אנטומיות והתפתחותיות של עלים בתירס ובמיני עשב אחרים.

ניתוח חתך רוחבי של פרימורדיה עלי תירס השתמשנו בסעיף 2 של פרוטוקול כדי לכמת את מספר הוורידים ולאפיין דפוסי תגובה הורמונליים במקטעים רוחביים של פרימורדיה של עלי תירס עם FPs (איור 4)24. כדי להעריך את תפקידו של ההורמון הצמחי אוקסין בצמיחת עלים ובהיווצרות ורידים, כימתנו את מספר הוורידים בפרימורדיה של מוטציה של תירס חסר אוקסין, ציצית נעלמת254. בפלסטוכרונים מוקדמים, ורידים מתפתחים מפגינים צלולריזציה ברורה בשכבת התא החציונית של פרימורדיום עלה התירס21,22. עם זאת, זיהוי וספירת ורידים באמצעות טכניקות היסטולוגיות קונבנציונליות22 יכול להיות עבודה אינטנסיבית זמן רב. לכן, כדי לכמת את הוורידים, השתמשנו בסמן חלבון התירס אוקסין אפלוקס pZmPIN1a::ZmPIN1a:YFP41 (PIN1a-YFP להלן), המסמן ורידים מתפתחים וגדילים פרוקמביאליים (PCSs; איור 4A). באמצעות פרוטוקול סעיף 2 הצלחנו לתקנן את דגימת החתך הרוחבי על-ידי מדידת הפרימורדיה לפני החתך (איור 4B,C). גילינו מגמה שבה ל-vt2 יש פרימורדיום רחב יותר ויותר ורידים מהרגיל (איור 4D,E)24, אשר עולה בקנה אחד עם נתונים מעלים55 מורחבים במלואם, מה שמצביע על כך שהפגם ב-vt2 החל בשלב מוקדם של התפתחות העלים. באמצעות פרוטוקול סעיף 2 יכולנו גם לבחון באופן שיטתי את דפוסי הביטוי של כתבי FP של תגובת הורמונים בפרימורדיה של העלה (ראו דוגמאות לתמונות באיור 4F-I). באמצעות סכמת דגימה מתוקננת של חתך רוחבי, מיפינו את ההתפלגות של תגובות אוקסין, ציטוקינין (CK) וחומצה ג'יברלית (GA) על פני פלסטוכרונים ואזורים שונים של פרימורדיית עלים, וגילינו דפוסי תגובה חדשים שאנו משערים שיש להם השלכות על צמיחת עלים והיווצרות ורידים24. לכן, תוצאות מייצגות אלה מדגימות את התועלת של פרוטוקול סעיף 2 לניתוח חתך רוחבי של פרימורדיה של עלי תירס.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig04.jpg"> איור 4: תוצאות מייצגות לניתוח חתך רוחבי של פרימורדיה של עלי תירס. (A-E) כימות מספר הוורידים ורוחב הפרימורדיום בפרימורדיה של ציצית רגילה ונעלמת2 באמצעות סמן חלבון האוקסין EFFLUX PIN1a-YFP. (A) תמונות פלואורסצנטיות מייצגות של חתכים רוחביים של P5 עד P7 המבטאים PIN1a-YFP בהתפתחות ורידים וגדילים פרוקמביאליים. החתכים הרוחביים צולמו במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי באמצעות מסנן FITC (עירור 495-519 ננומטר). מספר הוורידים ורוחב הפרימורדיום כומתו באמצעות כלי הקו הרב-נקודתי והקו החופשי ב-FIJI/ImageJ, בהתאמה. (B) שתיל תירס שאת העלה העליון מוציאים בעזרת חשפנית תיל כדי לחשוף את קצה העלה הרביעי (L4). הסוגר המרובע משתרע על פני אורך הפרימורדיום הצפוי, כאשר הקו המקווקו מציין את אורך האמצע. (C) דיאגרמה סכמטית של צורות פרימורדיום משתנות מ-P5 עד P7, הממחישה כיצד מספר הוורידים ורוחב הפרימורדיום באורך האמצעי (קו מקווקו אופקי) יכולים להשתנות בהתאם לשלב ההתפתחותי של הפרימורדיום. (ד,ה) מדידת רוחב פרימורדיום (D) ומספר ורידים (E) בחלק הבינוני של L4 של נורמלי ו vt2. קו המגמה מייצג ממוצעים מתגלגלים של 10 מ"מ של מדידות ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM). (פ-י) תמונות קונפוקליות מייצגות של חתכים רוחביים של פרימורדיה של עלים המבטאים שילובים של PIN1a-YFP, כתב תגובת אוקסין, DR5-RFP, כתב תגובת ציטוקינין, TCS-Tomato, סמן מגיב לחומצה ג'יברלית, GAR2-YFP ו- mDII-Venus, גרסה מוטנטית של כתב קלט האיתות אוקסין DII-Venus. ערוצי FP מונחים על ערוץ השדה הבהיר בכל תמונה. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר (A); 10 מ"מ (B); 100 מיקרומטר (F-I). נתון זה שונה ושוכפל באישור רוביל ומקסטין24. קיצורים: DAG = ימים לאחר הנביטה; P = פלסטוכרון; VT2 = ציצית נעלמת2; PCS = גדיל פרוקמביאלי; YFP = חלבון פלואורסצנטי צהוב; FITC = isothiocyanate fluorescein; RFP = חלבון פלואורסצנטי אדום; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; TCS-Tomato = TCSv2::NLS-tdTomato; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; mDII-Venus = pZmUbi:mDII:YFP-NLS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
אנליזה מלאה של פרימורדיה של עלי תירס עקבנו אחר סעיף 3 של פרוטוקול כדי להמחיש ולנתח ביטוי FP בתושבות של עלים שלמים של פרימורדיה של עלי תירס (איור 5). על-ידי הדמיה של דפוסי ורידים עם PIN1a-YFP, מצאנו שהיווצרות ורידים מתרחשת בכל הפרימורדיום במהלך הפלסטוכרונים המוקדמים, אולם תהליך זה נעשה מוגבל באזורים הפרוקסימליים בשלב מאוחר יותר בהתפתחות (איור 5A)24. הניתוחים המשלימים את ניתוחי החתך הרוחבי, חשפו דפוסים ספציפיים לרקמות ולשלבים של תגובת הורמונים במהלך היווצרות ורידים24. דוגמה אחת היא תבנית הביטוי של כתב התגובה של CK TCSv2::NLS-tdTomato37 (TCS-Tomato), ביחס לביטוי PIN1a-YFP (איור 5B)24. על ידי ביצוע סעיף 3 של הפרוטוקול, הצלחנו לבצע ניתוחים איכותיים וכמותיים של ביטוי FP בפרימורדיה של העלה (איור 5D-F; נתונים שלא פורסמו). בחנו את דפוסי הביטוי של כתב תגובת אוקסין, DR5rev::mRFPer41 (DR5-RFP), וסמן מגיב GA, pZmGAR2::ZmGAR2:YFP39 (GAR2-YFP), בתושבות עלים שלמים של מוטנטים בודדים וכפולים של vt2 וצמח ננסי3 (d3), מוטנט חסר GA56 (איור 5D). השווינו גם את הרמות היחסיות של התפשטות תאים בין פרימורדיה נורמלית לפרימורדיה של עלה vt2 באמצעות p Zm Cyclin-D2B::ZmCyclin-D2B:YFP42 (Cyclin-D2B-YFP), שהוא סמן למעבר G1/S במחזור התא 57 (איור 5E,F). בעוד שלא היה הבדל משמעותי בין נורמלי לבין vt2, ביטוי Cyclin-D2B-YFP היה עקבי עם פרופיל התפשטות התאים הידוע של פלסטוכרונים מוקדמים31. אנו מסיקים כי פרוטוקול סעיף 3 הוא שיטה יעילה לניתוח תושבות שלמות של פרימורדיה של עלי תירס, שקשה לדמיין אותן בשל המורפולוגיה המגולגלת שלהן.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65239/65239fig05.jpg"> איור 5: תוצאות מייצגות לניתוח כולל של פרימורדיה של עלי תירס. (A) תמונות פלואורסצנטיות מייצגות של פרימורדיה של 7 שתילי תירס DAG המראים ורידים מתפתחים וגדילים פרוקמביאליים, כפי שמסומן על ידי סמן חלבון האוקסין EFFLUX PIN1a-YFP. פרימורדיה P3-P6 הוצאו מהבסיס, לא גולגלו ושוטחו עם הצד האדקסיאלי כלפי מעלה. כניסות מציגות צילומי תקריב של P3 ו-P4. ב-P5 וב-P6, קווים מקווקווים תוחמים את הקצה הדיסטלי של אזורי השגשוג, שבהם רוב הגדילים הפרוצמביאליים עדיין מתפתחים ומתרחבים. (ב,ג) תמונות קונפוקליות מייצגות המציגות את הביטוי של PIN1a-YFP וכתב תגובת ציטוקינין, TCS-Tomato, באזור השוליים הפרוקסימלי של פרימורדיום P5. (D) תמונות פלואורסצנטיות מייצגות של P4 primordia המראות את הביטוי של כתב תגובת אוקסין, DR5-RFP, וסמן מגיב לחומצה ג'יברלית, GAR2-YFP במוטציות רגילות ובודדות וכפולות של ציצית נעלמת2 וצמח ננסי3. (E) תמונות קונפוקליות מייצגות של P3 ו/או P4 המראות את הביטוי של Cyclin-D2B-YFP, כתב למעבר G1/S במחזור התא. (F) כמויות יחסיות של התפשטות תאים בפרימורדיה של עלה P3/P4 של נורמלי ו-vt2, מכומתות על ידי מדידת הצפיפות המשולבת של אות Cyclin-D2B-YFP על פני שטח הפרימורדיום באמצעות ImageJ/FIJI. העמודות מייצגות את ממוצע המידות ± שגיאת התקן של הממוצע. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר (A,D,E); 200 מיקרומטר (B); 100 מיקרומטר (C). איור 4A-C שונה ושוכפל באישור Robil ו-McSteen24, ואילו איור 4D-F הוא נתונים שלא פורסמו על ידי המחברים. קיצורים: DAG = ימים לאחר הנביטה; P = פלסטוכרון; VT2 = ציצית נעלמת2; D3 = צמח ננסי3; YFP = חלבון פלואורסצנטי צהוב; RFP = חלבון פלואורסצנטי אדום; PIN1a-YFP = p Zm PIN1a::ZmPIN1a:YFP; TCS-Tomato = TCSv2::NLS-tdTomato; DR5-RFP = DR5rev::mRFPer; GAR2-YFP = p Zm GAR2::ZmGAR2:YFP; Cyclin-D2B-YFP = pZmCyclin-D2B::ZmCyclin-D2B:YFP; ns = אין הבדל משמעותי; au = יחידה שרירותית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
קובץ משלים 1: דוגמאות להתפתחות עלים בשתילי תירס. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/65239_S_File_1_Leaf_staging_maize_seedling_Fall2019%20(1).xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
איור משלים S1: דגימות צמחים וחומרים המשמשים בפרוטוקולים. (א,ב) שתיל תירס 7-8 DAG עם זונת העלה העליון הוסר באמצעות חשפנית תיל. (B) השיבוץ מראה תקריב של הצילום עם הפרימורדיום P6 החשוף. (ג-ג) נבטים של שתילי תירס כאשר הזונות העליונות הוסרו לצורך ניתוח חתך רוחבי (C,D) והעלים שמסביב הוסרו במלואם לצורך ניתוח הרכבה שלמה (E-G). (H) גליל ננו-טייפ דו-צדדי שקוף מג'ל פוליאוריתן. (ט,י) פרימורדיום עלה P6 (I) ואזור פרוקסימלי של עלה P8 (J) נפרש והורכב על שקופיות זכוכית עם סרט ננו. (K) מגלשת זכוכית עם פרימורדיום עלים לא מגולגל המותקן על במה של מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. קיצור: DAG = ימים לאחר הנביטה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65239/S_FIGURE_1.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

פרימורדיה של עלי תירס עטופה ומגולגלת עמוק, מה שמקשה על מחקרם. כאן, אנו מציגים שיטות להכנת חתכים רוחביים ותושבות שלמות של פרימורדיה של עלי תירס להדמיה פלואורסצנטית וקונפוקלית.

In maize (Zea mays) and other grasses (Poaceae), the leaf primordia are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl, making it difficult to study ...

לעשבים כמו תירס יש פרימורדיה של עלים לגדול בתוך הנבט, מה שהופך אותם לקשים למחקר. אנו מטפלים בבעיה זו באמצעות פרוטוקולים משופרים להכנת חתכים רוחביים של עלי תירס ותושבות שלמות להדמיה פלואורסצנטית וקונפוקלית. הפרוטוקול הראשון משתמש בחשפנית תיל כדי לחתוך את העלים הישנים, ומאפשר מדידה של הפרימורדיום לפני החיתוך.הפרוטוקול השני משתמש בננו-טייפ דו-צדדי ברור כדי לפתוח את פרימורדיום העלה השלם. פרוטוקולים אלה משפרים את הדיוק של חתך רוחבי ומאפשרים גלגול של פרימורדיה עלה, אשר היה קשה מאוד להשיג בשל המורפולוגיה המגולגלת והחרוטית שלהם. שיטות אלה יהיו שימושיות להדמיה וכימות של תכונות אנטומיות והתפתחותיות של עלים בתירס ובעשבים אחרים.בהתבסס על שיטות אלה, אנו מתכננים לפתח אסטרטגיות הדמיה של תאים חיים כדי לענות על שאלות בהתפתחות עלי דשא.

improved-methods-for-preparing-transverse-sections-unrolled-whole

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מציגים פרוטוקול הרכבה...

הדמיה של זקופה תסיסנית עוברים

לגנים רבים בעלי חשיבות התפתחותית יש דפוסי ביטוי ספציפיים לתאים או לרקמות. מאמר זה מתאר ניסויי LM RNA-seq לזיהוי גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי בגבול להב-נדן עלי התירס ובמוטציות lg1-R בהשוואה לסוג בר. השיקולים הניסיוניים שנדונו כאן חלים על ניתוחים טרנסקריפטומיים של תופעות התפתחותיות אחרות.

עיצוב ניסיוני עבור לייזר Microdissection RNA-seq: לקחים מניתוח התפתחות תירס ליף

הדמיה confocal לחיות מספק לביולוגים עם כלי רב עוצמה כדי ללמוד פיתוח. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור הדמית confocal לחיות לפתח פרחים ארבידופסיס.

חי Confocal הדמיה של פיתוח פרחים ארבידופסיס

פרוטוקול זה מטרות תאים ספציפיים ברקמות עבור הדמיה ברזולוציה הננומטרי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM). תחילה עם תמונה של מספר גדול של טורי מקטעים של שרף-מוטבע בחומר ביולוגי במיקרוסקופ אור כדי לזהות את המטרה ולאחר מכן באופן היררכי ב- SEM.

הדמיה הירארכי עם מודאלים מרובים סעיפים טורי למציאת מטרות תאיות ספציפיים בתוך כמויות גדולות

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להמחשת הקרנה מוטור נוירון, האקסון arborization ב הטרנסגניים Hb9::GFP העכבר עוברי. לאחר immunostaining עבור מוטורי לגלוקוז, השתמשנו גיליון אור זריחה מיקרוסקופ כדי התמונה עוברי עבור ניתוח כמותי עוקבות. פרוטוקול זה חל תהליכים ניווט אחרים תא עצב במערכת העצבים המרכזית.

ויזואליזציה של האקסון מנוע והניווט כימות של האקסון Arborization של העוברים העכבר באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון קרינה פלואורסצנטית

אנו מספקים שיטה כדי לשפר את הניגודיות הקליטה רנטגן רקמת תירס מתאים סריקת טומוגרפיה microcomputed רגיל. על סמך CT תמונות, אנחנו מציגים את ערכה של זרימות עבודה של עיבוד תמונה עבור חומרים תירס שונים ביעילות לחלץ פנוטיפים מיקרוסקופיים של וסקולריים צרורות של תירס.

טכניקות Phenotyping בקנה מידה מיקרון של חבילות וסקולריים תירס מבוסס על צילום רנטגן טומוגרפיה Microcomputed

אנחנו מדווחים על שיטה פשוטה רב-תכליתי לביצוע פלורסנט לחיות-הדמיה של עלים תודרנית לבנה על פני תקופה ארוכה של זמן. אנו משתמשים צמח תודרנית הטרנסגניים לבטא גן כתב פלורסנט תחת השליטה של יזם הקשורות חסינות כדוגמה להשגת הבנה ייתכן של תגובות חיסוניות הצמח.

שיטה רב-תכליתי עבור הרכבה תודרנית יוצא Intravital הדמיה בצילום מואץ

פרוטוקול זה נועד לספק נהלים מפורטים לאיסוף, תיקון ותחזוקה של דגימות צמחים מיקוהטרוטרופיים, תוך יישום טכניקות מיקרוסקופיה שונות כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת והולכה, מיקרוסקופיית אור, קונפוקלית ופלואורסצנטית כדי לחקור התיישבות פטרייתית ברקמות צמחים ובזרעים שנבטו בפטריות מיקוריזאליות.

טכניקות מיקרוסקופיה לפענוח התיישבות פטרייתית ברקמות צמחים מיקוהטרוטרופיים ונביטה סימביוטית של זרעים

כתב יד זה מפרט פרוטוקול חיסון אופטימלי המשתמש בנדן עלי תירס מנותק למחקרים ציטולוגיים, פיזיולוגיים ומולקולריים הניתנים לשחזור של אינטראקציות תירס עם פתוגנים צמחיים פטרייתיים. מעטה העלים מאפשר תצפית בזמן אמת על אינטראקציות תאיות בין הצמח החי לפטרייה ברקמות לא מקובעות.

נדן תירס מנותק להדמיית תאים חיים של זיהום על ידי פתוגנים פטרייתיים של תירס פוליארי

זרימת עבודה זו מאפשרת ייצור למלה המכוון למבנים ביולוגיים בעלי תווית פלואורסצנטית שהם קטנים (&lt;1 מיקרומטר בהיקף צירי) ונדירים (עותק אחד לתא) באמצעות פלטפורמת הדמיה תלת-צירית קריוגנית. פלטפורמה זו משלבת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כרסום קרן יונים ממוקדת ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק במיקום מוקד יחיד ומאפשרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בו זמנית בזמן הכרסום.

זרימת עבודה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אלקטרונים וקרן יונים קריוגני לכרסום ממוקד של תאים

פרוטוקול האימונולוקליזציה הזה במיוציטים זכריים של תירס שומר על שלמות תלת-ממדית של התאים במהלך המיוזה. הוא מאפשר מעקב דינמי אחר המיקום התוך-תאי של עד שלושה נוגדנים עצמאיים בחומר משומר עם פאראפורמלדהיד, בנוסף ל-DAPI, שמצבע DNA.

אימונולוקליזציה תלת-ממדית במיוציטים של תירס

למד שיטות משופרות להכנת חתכים רוחביים ותושבות שלמות לא מגולגלות של פרימורדיה של עלי תירס להדמיה פלואורסצנטית וקונפוקלית. הפרוטוקולים משפרים דיוק בחיתוך ומאפשרים בחינת תבניות ביטוי הורמונליות.

שיטות משופרות להכנת חתכים רוחביים ותושבות שלמות לא מגולגלות של פרימורדיה של עלי תירס להדמיה פלואורסצנטית וקונפוקלית

גלה סרטונים נוספים