ויזואליזציה של האקסון מנוע והניווט כימות של האקסון Arborization של העוברים העכבר באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון קרינה פלואורסצנטית

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לאפשר הערכה איכותית וכמותית של דפוסי ארבוריזציה של אקסון נוירונים מוטוריים באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור ותוכנת ניתוח תמונה על עוברי עכברים. שיטה זו יכולה לסייע בהבנת התפתחות נוירונים מוטוריים בתיאום עם תנועה מורכבת. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לצפות ולצלם דפוסי ארבוריזציה של אקסונים של נוירונים מוטוריים מזוויות שונות ולנתח כמותית כל עצב בודד.

ידגימו את ההליך יא-פינג ין ואי שאן ליאו, שני סטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בהליך זה, יש לתקן את העוברים בנפרד בצלחת של 24 בארות עם מיליליטר אחד של 4% פרפורמלדהיד טרי שהוכן ב-PBS לבאר בארבע מעלות צלזיוס על שייקר למשך הלילה. למחרת, שטפו את העוברים הקבועים לפחות שלוש פעמים, כל אחד למשך חמש עד 10 דקות, עם מיליליטר אחד של 1X PBS ודגרו אותם למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, יש לחדור כל עובר במיליליטר אחד של 0.5% PBST למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס על שייקר. חסום כל דגימה עם מיליליטר אחד של 10% FBS שהוכן ב-1X PBS למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס על שייקר. לאחר מכן, דגרו על כל עובר עם מיליליטר אחד של נוגדן ראשוני נגד GFP בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות עם ניעור מתמיד.

לאחר הדגירה הראשונית של הנוגדנים, שטפו כל עובר במיליליטר אחד של 0.5% PBST במשך יום עד יומיים בארבע מעלות צלזיוס על שייקר. לאחר מכן, יש למרוח מיליליטר אחד של נוגדן משני ולדגור למשך הלילה בחושך בארבע מעלות צלזיוס עם טלטול מתמיד. למחרת, שטפו כל עובר במיליליטר אחד של 0.5% PBST לפחות שלוש פעמים בארבע מעלות צלזיוס על שייקר במשך יומיים-שלושה.

לאחר מכן, דגרו כל עובר במגיב ניקוי מסחרי עם מקדם שבירה של 1.49 בצינור של 1.5 מיליליטר המוגן מאור בטמפרטורת החדר למשך הלילה. הגדר אופטיקת תאורה 5X/0.1 ואופטיקת זיהוי 5X/0.16. הרכיבו את מחזיק המדגם ואת הנימים לדוגמה.

הכן את תא הדגימה על ידי מילויו בתמיסת ניקוי. כדי להרכיב את העובר, הכינו קצה פיפטה P200 על ידי חיתוך החלק העליון כך שיתאים לקוטר הנימים והסר את החלק המחודד לחיבור הדגימה. לאחר מכן, ממיסים את הקצה הקהה של קצה הפיפטה בעזרת להבה קטנה.

כבו את הלהבה והצמידו במהירות את העובר אנכית לקצה המומס. התקן את החלק העליון של קצה הפיפטה עם נימי הדגימה והכניס את תא הדגימה המוכן למיקרוסקופ. באמצעות תוכנת ההדמיה, בחר אתר נימי תחת הכרטיסייה אתר והתאם את צירי X, Y ו-Z.

לאחר מכן, בחר אתר דגימה והגדל ל-0.6X כדי להתמקד בעובר. אפשר למאגר התא להתאזן עם העובר למשך זמן מה כדי לנקות כל פסולת או בועות. לרכישת תמונה תחת הכרטיסייה רכישה, הגדר את פרמטרי נתיב האור כגון יעדי בילוש, מסנן חסימת לייזר, מפצל קרן, מצלמות ולייזרים.

סמן את תיבת הסימון סריקת ציר עבור הפחתת צל. לאחר מכן, הגדירו את הגדרות הרכישה, Bit Bepth עד 16 סיביות, זום לטווח שבין 0.36 ל-0.7X, תאורת אתר יחיד או תאורת אתר כפולה. לחץ על רציף והגדר את עוצמת הלייזר, זמן החשיפה, עוצמת הלייזר ומיקום גיליון האור.

לאחר מכן, לחץ על עצור כדי לסיים את רכישת התמונה. חשוב לוודא שהדגימה השקופה ממוקמת בתוך נתיב האור הקצר ביותר כדי לאפשר רכישה מפורטת של תמונות של מבנים עצים עדינים על עצבים מוטוריים בודדים. לרכישה רב-ממדית, הגדר את מחסנית Z על ידי הזזת מיקום z עבור התמונה הראשונה והאחרונה.

לחצו על 'אופטימלי' לקביעת מספר הפרוסה. לאחר מכן, לחץ על התחל ניסוי כדי לרכוש את מחסנית ה-Z שנבחרה. בסיום, שמור את התמונה בפורמט czi.

כדי לכמת ארבוריזציה של אקסון, פתח את קובץ התמונה בתוכנת ניתוח הדמיון. התאם את הצבע, הבהירות והניגודיות של התמונה באמצעות החלון התאמת תצוגה כדי לזהות חוטים על סמך ניגודיות עוצמה מקומית. לאחר מכן, לחץ על סמל הוסף חוטים חדשים ובחר את אלגוריתם הנתיב האוטומטי בתפריט הנפתח.

בחר את אזור העניין, ולאחר מכן הגדר את נקודות ההתחלה והזרע על-ידי הקצאת מידות הקוטר הגדולות והדקיקות ביותר שניתן למדוד באמצעות מצב פרוסה. הקצה נקודת התחלה בקצה אזור העניין. כדי להשיג הוספה או הסרה ידנית של נקודות התחלה, שנה תחילה את מצב המצביע, נווט בבחירה ולאחר מכן הזז ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני בנקודות העניין.

לאחר מכן, בחר סף ידני לנקודות זרע כדי להבטיח שכל העצבים הגלויים מסומנים. לאחר מכן, הוסף או הסר נקודות זרע באופן ידני. סמן את התיבה הסר מקטעים מנותקים והסר נקודות זרע סביב נקודות התחלה.

לאחר מכן, התאם את הסף לחיסור רקע וסיים את התהליך. יש צורך להסיר חפצי רקע ולאשר את נתיב הגלאי משקף ארבוריזציה אמיתית של אקסון לכימות מדויק. בסוף, בחר את הסגנון והצבע הרצויים.

תחת הכרטיסייה סטטיסטיקה, בחר מפורט והשתמש במספר נימה, נקודות מסוף דנדריט כדי לכמת את מסופי העצב המוטורי כאינדיקטור לארבוריזציה של אקסון מוטורי. לאחר מכן, ייצא את התמונה של האקסון המשוחזר כקובץ tiff. LSFM מספק הדמיה תלת מימדית מפורטת של ארבוריזציה של אקסון מוטורי בעוברי עכברים.

נוירונים מוטוריים כפופים לפרוטוקול המתואר לעיל ומסומנים ב-GFP המתבטא באופן טרנסגני. כדי לדמות ארבוריזציה של אקסונים בפירוט רב יותר ולבצע כמות, ניתן לכוונן את ההגדלה כך שניתן יהיה לחשוף כל מבנה בעל עצים דקים. לבסוף, ניתן לשחזר דפוס ארבוריזציה של עצבי גפיים קדמיות בודדים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה.

אלגוריתם הנתיב האוטומטי בתוכנה עוקב אחר נימה ומכמת את המספר הכולל של מסופי האקסון. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין דגימות ולצלם אקסונים של נוירונים מוטוריים של עוברי עכבר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצן של יריעות אור. כמו כן, תדע להעריך כמותית את דפוס העצבים המוטוריים של כל עצב מוטורי בודד על ידי MRS.