הדמיה הירארכי עם מודאלים מרובים סעיפים טורי למציאת מטרות תאיות ספציפיים בתוך כמויות גדולות

המטרה הכוללת של זרימת עבודה זו היא לזהות מטרות מסוימות להדמיה אולטרה-מבנית בתוך רקמה באמצעות מיקרוסקופ אור ואחריו הדמיה תלת מימדית ב-SEM ברזולוציה גבוהה מאוד. זרימת העבודה של ההדמיה המוצגת כאן יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי מבנה תאים או רקמות במספר תחומים, כגון ביולוגיה של התא, ביולוגיה התפתחותית, מדעי המוח או אפילו פתולוגיה. היתרון העיקרי של הטכניקה, המבוססת למעשה על טומוגרפיה של מערך, הוא שחיתוך רקמות למערכים של מקטעים טוריים מקל על זיהוי מבני מטרה, גם כאשר בתחילה הם קבורים בתוך נפח הדגימה המקורי.

טומוגרפיית מערך הוצגה במקור בהקשר של מדעי המוח, אך ניתן ליישם אותה גם על מגוון רחב של מערכות אחרות, כולל חיידקים, צמחים, בעלי חיים ואפילו דגימות חולים בסביבה פתולוגית. אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שאיסוף חלקים סדרתיים רבים הוא קשה מאוד. עבודה ללא תמיכה נוספת עלולה לגרום לאובדן חלקים או לחוסר סידור של הסרטים.

בעזרת מברשת זעירה שנוצרה מכמה שערות קבועות לקיסם, מצפים בזהירות את הצדדים המובילים והנגררים של בלוק גזוז מראש בתערובת דבק. בצע שלב זה במהירות מכיוון שהממס של תערובת זו מתאדה תוך שניות. בזמן שהדגימות מתייבשות, חותכים חתיכות פרוסות סיליקון לגודל שמתאים לסירת הסכינים וסמנו אותן עם כותב יהלומים.

לאחר מכן, נקה את פרוסת הסיליקון באופן ידני עם איזופרופנול ורקמה נטולת מוך. תקן את המצע לקצה אחד של לוחית המנשא באמצעות דבק נשלף. לאחר ההגדרה, פלזמה מפעילה את המצע באמצעות פריקת זוהר עם אוויר כדי להשיג משטח הידרופילי.

כשהמצע המותקן קרוב יותר לקצה הסכין, הכנס את המנשא לתוך המהדק של מחזיק המצע. לאחר מכן, הכנס סכין יהלום ג'מבו למחזיק הסכין והגדר את זווית המרווח לאפס מעלות. לאחר מכן, מלאו את סירת הסכינים במים מזוקקים.

התקרב לסכין כך שתהיה מילימטר עד שניים מהדגימה. לאחר מכן, הורד את המצע למים באמצעות ברגים אחד עד שלושה של מחזיק המצע. בדוק שקו המים ממוקם בשליש העליון של המצע.

מכיוון שקשה לראות את מרווח הקרקע בעת שימוש בפרוסת סיליקון, הורד את המצע עד שתרגיש שהוא נוגע ברצפה. לאחר מכן, הרם את המצע בכמות קטנה. ודא שלא המצע ולא המנשא ייגעו בסירת הסכינים בזמן החיתוך.

לאחר מכן, השתמש במזרק או פיפטה כדי לכוונן את מפלס המים בסירה. תוך כדי צפייה דרך המשקפת, הוסיפו או הסירו מים עד שכל שטח פני המים יראה השתקפות הומוגנית של תאורת האור העליונה של האולטרה-מיקרוטום. לאחר השלמת ההגדרה, התחל לחתוך את הדגימה.

לאחר שנחתכו מספר חלקים, עצרו את תהליך החיתוך ושחררו את הסרט מקצה הסכין על ידי ליטוף עדין על קצה הסכין עם ריס או שיער חתול רך מאוד. תפעל את הסרט לכיוון המצע ודחף בעדינות את החלק הראשון של הסרט כדי לחבר אותו לחלק היבש של המצע. המשך לחתוך את הדגימה ולהצמיד את הסרטים למצע.

התחל בצד אחד של המצע והתקדם בהדרגה לכיוון השני עם כל סרט חדש. כאשר המצע מכוסה לחלוטין בסרטים, הרם בעדינות את המצע מסירת הסכינים באמצעות ברגי המיקרומניפולטור של מחזיק המצע. הניחו למערך הסרטים להתייבש ולאחר מכן אחסן אותו בסביבה נטולת אבק.

לאחר הייבוש, הסר את המצע המותקן על הדבק בהקדם האפשרי מהמנשא. לאחר מכן, צבעו את הדגימה שלכם למיקרוסקופ אור כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה ובצעו הדמיה. לאחר מכן, צבעו את הדגימה למיקרוסקופ אלקטרונים והרכיבו אותה על דודי אלומיניום בעזרת כרית פחמן דביקה.

כעת דמיין את המערכים הללו במיקרוסקופ אלקטרונים סורק פליטת שדה. כדי להימנע מטעינה, השתמש באנרגיות אלקטרונים ראשוניות של שלושה קילוואט ומטה ובזרם אלומה בין 50 ל-800 פיקו-amps. בעת שימוש בהחלקות כיסוי זכוכית מצופות ITO, חבר את המשטח המוליך למנשא המיקרוסקופ בעזרת סרט נחושת וצבע כסף.

השלב הראשון במפל ההדמיה ההיררכית הוא ליצור סקירה כללית של המערך באופן שניתן יהיה לזהות את החלקים הבודדים. ראשית הגדר את ארבע הפינות של המערך שלך על ידי גרף תמונה של כל פינה בהגדלה נמוכה, בערך פי 100, ולאחר מכן צור החזר ROI התוחם את כל המערך. הקצה פרוטוקול הדמיה להחזר ROI זה עם הפרמטרים הבאים.

השתמש בגלאי האלקטרונים המשני להדמיה במהירות גבוהה תוך שימוש בזמן השהייה קצר של כ-0.2 מיקרו-שניות. בחר גודל פיקסל גדול של תמונה וגודל אריח של 2000 על 2000 פיקסלים. התוצאה היא תמונה רועשת מאוד אך גם כאן נראית הרקמה בתוך החתך.

לאחר מכן, צור ערכת קטע על ידי יצירת אזור עניין, המתאר רק את הרקמה בחלק הראשון. שכפל אותו לכל הסעיפים הבאים באמצעות כלי החותמת. סובב את אזורי העניין בעת הצורך על מנת להתאים לסרטים מכופפים.

הקצה פרוטוקול לחלק המציג בצורה הטובה ביותר את תת הרקמה. כאן נעשה שימוש בגודל פיקסל ביניים של 60 ננומטר, גודל אריח של 12000 על 12000 פיקסלים וזמן שהייה של 3.2 מיקרו-שניות. בשל איכות ירודה, נוצר מקטע שני המתאר כמה תאים נבחרים באמצעות גודל פיקסלים קטן יותר וגלאי רגיש יותר.

כעת ניתן לזהות היטב את שני תאי המטרה. צור ערכת אתר בתוך ערכת המקטעים הכוללת את מבנה היעד להדמיית SEM ברזולוציה גבוהה יותר. הפוך את אזור העניין לגדול מספיק כדי להסביר דיוק בשלבים.

בדוק והתאם את מיקומי האתרים. כוונון אוטומטי נחוץ כאשר קטעים רבים מצולמים. חשוב למקם את אזורי העניין כך שהמרכז לא יישב על חומר ריק ללא פירוט מבני, למשל, ואקולים.

לאחר מכן, הגדר את הגדרות המיקוד האוטומטי ובדוק את ביצועי ההדמיה לאורך הסרט באזור עניין קטן שקרוב לאתר שיצולם. לאחר מכן, הגדר פרוטוקול הדמיה עבור רכישת SEM ברזולוציה גבוהה. כדי לראות תאי ממברנה, בחר גודל פיקסל תמונה בין שלושה לחמישה ננומטרים.

בחר זמן השתהות בהתאם לגלאי כך שהתמונה לא תהיה רועשת מדי. מכיוון שהשלב צריך לעבור מרחק גדול בין הקלטת קטע זה לקטע זה, הגדר את ערכי המיקוד לפחות בחלק הראשון של כל סרט באמצעות אפשרות בדיקת פרוטוקול. לאחר מכן התחל את הדמיית ה-SEM האוטומטית על פני כל סדרת אזורי העניין של היעד.

בסיום, ייצא את הנתונים שנרכשו כסדרת תמונות, רצוי בפורמט TIF. ייבא סדרות תמונות לפיג'י כערימה וירטואלית. לאחר מכן, חתוך את הערימה להמשך עיבוד על ידי חיתוך האזור קרוב ככל האפשר למבנה המעניין.

כמו כן, התאם את הבהירות והניגודיות ושמור את הערימה. לאחר החיתוך והאופטימיזציה, פתח TrakEM חדש מתפריט קובץ. לחצו לחיצה ימנית על שדה התמונה וייבאו את האוסף ל-TrakEM כפרוסה אחת לכל שכבה.

בלחיצה ימנית, בחר ישר שכבות. בחרו ריבועים קטנים כמצב, קבעו את הטווח מהראשון לאחרון, ובחרו 'ללא' כהפניה. לאחר מכן, בחר את ערכי ברירת המחדל ובחר Rigid כשינוי הצורה הרצוי.

לאחר השלמת ההרשמה ומשביע רצון, שמור את ערכת הנתונים המיושרים על-ידי לחיצה ימנית ובחירה בייצוא. צור תמונה שטוחה, הגדר את הטווח מהתמונה הראשונה לאחרונה, ותן לתוכנה להציג את הערימה שנוצרה. בסיום, שמור את הערימה בתבנית TIF.

לאחר ההכנה, מערך המקטעים מופיע כמערך המורכב ממספר סרטים של קטעים סדרתיים. חלק זה מציג סקירה כללית של קצה שורש ארבידופסיס, מוכתם בפרופידיום יודיד. החלקים הרציפים של דגימה זו יושרו כמתואר בפרוטוקול ושולבו כדי להציג את הדגימה בתלת מימד כקובץ סרט יחיד.

כאן, ניתן לראות את שני תאי המטרה שיצולמו מאוחר יותר ברזולוציה ננומטרית ב-SEM. לאחר צביעה נוספת עם אורניל אצטט וציטראט בדם, המערכים צולמו במיקרוסקופ אלקטרונים. תמונה סטטית זו מציגה את קטע הדגימה שצולם תחילה ברזולוציה של 20 ננומטר ובסיבוב ההדמיה השני, ברזולוציה של חמישה ננומטר.

כאן, 210 תמונות עוקבות ממיקרוסקופ האלקטרונים יושרו ונחתכו כמתואר בפרוטוקול. הסרטון מכוון רק לשני תאים ומראה כיצד הווקואולים בתוך התאים מסודרים ולפעמים מחוברים בתלת מימד. הדמיה היררכית אוטומטית של המערכים ב-SEM המוצגת כאן יכולה לספק מיפוי חלק ברמות רזולוציה שונות, החל מסקירה כללית של המערך כולו ועד לפרטים תת-תאיים.

בהגדלה הגבוהה ביותר ניתן לזהות ואקולים, מיטוכונדריה, הגרעין והרטיקולום האנדופלזמי. לאחר השליטה, הנחת סרטי חתך זה לצד זה על מצע טיפוסי יכולה להיעשות תוך מספר שעות אם היא מבוצעת כראוי. זה עשוי לספק מאות חלקים על מצע אחד להדמיה.

זמן ההדמיה עבור מספר כה גדול של מקטעים יכול להשתנות ממיקרוסקופ אחד למשנהו, אפילו יותר אם למכשירי ההדמיה האהובים עליך יש רמות שונות של אוטומציה. מעניין לציין שניתן לשלב בקלות את זרימת העבודה הכללית עם טכניקות הדמיה אחרות, כגון צביעת היסטו סטנדרטית או אפילו קנדולומינסנציה, או שהיא פשוט יכולה לשמש ככלי עצמאי להדמיה ארת-מפרקים של נפחים גדולים. היבט נוסף של זרימת עבודה זו הוא נגישות קלה.

מחקרים ראשוניים אפשריים ללא כלים נוספים או אוטומציה, כלומר ללא השקעה גדולה. לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לך מושג טוב לגבי זרימת העבודה וכיצד ניתן להשתמש בהדמיה רב-מודאלית כמו גם היררכית כדי למקד ולצלם מבנים מעניינים בנפח תלת-ממדי גדול ברמות רזולוציה שונות.