יצירת רקמת שריר הלב האנושית בתלת מימד באמצעות כתיבה אלקטרו-ספינינג נמס של פיגומי פוליקפרולקטון ותאי לב שמקורם ב-hiPSC

מוצגת שיטה הניתנת לשחזור ליצירת רקמות שריר הלב תלת מימדיות המשלבות כתיבה אלקטרו-ספינינג נמס (MEW), פיגומי פוליקפרולקטון (PCL) והידרוג'לים פיברין עם קרדיומיוציטים ופיברובלסטים שמקורם ב-hiPSC. טכניקה זו מציעה שליטה מדויקת על ארכיטקטורת הפיגומים וניתן ליישם אותה בבדיקות תרופות פרה-קליניות ובמודלים של מחלות לב.

מחקר זה נועד לפתח רקמות לב תלת-ממדיות ביומטריות באמצעות פיגומים חשמליים נמסים ותאי לב אנושיים שמקורם ב-iPSC כדי לשפר את מידול המחלה, בדיקות תרופות ויישומי רפואה רגנרטיבית. דיווח המושרה על ידי בני אדם בקרדיומיוציטים של תאי גזע נותר לא בשל, ומגביל את הפונקציונליות שלהם. בנוסף, מאתגר לשחזר את המורכבות החמורה הנדרשת למידול רקמת לב בתלת מימד.

מודל זה מחקה טוב יותר את שריר הלב המקורי, ומאפשר אינטראקציות מטריצה חוץ-תאיות תלת-ממדיות מורכבות למידול מחלות, בדיקות תרופות ויישומים ספציפיים למטופל. הוא מציע אלטרנטיבה רלוונטית יותר לתרבויות דו-ממדיות ולמודלים של בעלי חיים. בהמשך, המחקר שלנו יתמקד בחקירת מודלים קרדיו-מיקולוגיה, שיפור פרוטוקולי הבשלת רקמות תלת מימדיים ופיתוח מבנים גדולים יותר לטיפולים פרה-קליניים באוטם שריר הלב במודלים של בעלי חיים גדולים כמו חזירים.

כדי להתחיל, חבר את המזרק לצינור אספקת חנקן בלחץ והכניס אותו לתא החימום. הפעל את ציוד הכתיבה האלקטרו-ספינינג והגדר את ווסתי הטמפרטורה ל 80 מעלות צלזיוס לתא ו -65 מעלות צלזיוס לזרבובית. לאחר 30 דקות, הזז את לוחית האספן עד שראש ההדפסה ממוקם בקצה אחד של הלוח או בכל מיקום רצוי.

התאם את המרחק בין תא החימום לצלחת הקולט באופן ידני ל -10 מילימטרים במישור ה- z. סגור את דלת הציוד, המחבר אוטומטית את אספקת השדה החשמלי. הגדר את המתח לשבעה קילו-וולט בלחץ חנקן לשני ברים לשחול דרך קצה המד 23.

טען את קוד G העיצובי בתוכנה כדי להדפיס פיגומים עם גיאומטריית דפוס מרובע. התאם את מהירות הקולט ל -1080 מילימטרים לדקה. לאחר מכן לחץ על כפתור התחלת מחזור כדי להתחיל בהדפסה.

לאחר סיום ההדפסה, הסר בזהירות את הפיגום מהאספן. חותכים את הרשת המודפסת באמצעות אגרוף בקוטר שישה מילימטרים כדי לקבל את הפיגומים הסופיים לייצור רקמות. טפל בפיגומים במשך חמש דקות עם פלזמת חמצן.

עקרו את הרשתות על ידי טבילתן באתנול 70% למשך 30 דקות. שוטפים בהרחבה במים מזוקקים סטריליים למשך 30 דקות, ואז משאירים אותם לייבוש. לאחר ניתוק הקרדיומיוציטים iPSC האנושיים, השעו מחדש את כדור התא בתווך יצירת הרקמה וספרו את התאים באמצעות תא נויבאואר.

באופן דומה, לאחר ניתוק הפיברובלסטים הלבביים של iPSC אנושיים, השעו מחדש את כדור התא במדיום יצירת הרקמה וספרו את התאים. מערבבים את סך התאים הדרושים בצינור חדש ומתייחסים לתוכן כ-Cell Mix. וצנטריפוגה ב-300 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן השעו מחדש את תערובת התאים בנפח הנדרש של מדיום ייצור הרקמות. כדי ליצור תערובת הידרוג'ל, הוסף את נפח הפיברינוגן הנדרש לצינור בטמפרטורת החדר וערבב בזהירות. זרע את תערובת ההידרוג'ל על משטח פוליטטרפלואורואתילן כדי למנוע הידבקות פיברין לצלחת.

פיפטה מחצית מנפח הרקמה, ומשאירה אותה כטיפה. הניחו פיגום פוליקפרולקטון, או PCL, על גבי כל טיפה והוסיפו את הנפח הנותר על הפיגום. כעת, הוסיפו את הכמות הנדרשת של תרומבין וערבבו במהירות את ההידרוג'ל, הימנעו בזהירות מבועות.

דגרו על הרקמות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה כדי להשלים את פילמור הפיברין. הרימו בעדינות כל רקמה מהקצה בעזרת פינצטה סטרילית והעבירו אותן ל-12 צלחות באר המכילות מדיום ליצירת רקמות בתוספת אפרוטינין. דגרו על הרקמות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.

למחרת, רענן את המדיום עם שני מיליליטר של מדיום לתחזוקת רקמות, והסר שאריות KSR ו-Y-27. זריעה של תערובת של שמונה עד שניים של קרדיומיוציטים iPSC אנושיים ופיברובלסטים לבביים iPSC אנושיים לתוך הידרוג'לים של פיברין מביאה לפיזור תאים אחיד על פני נקבוביות הפיגום תוך שעה לאחר פילמור. תמונות אימונופלואורסצנטיות קונפוקליות הראו התפלגות תאים מעורבת של התאים דרך הרקמה התלת-ממדית המקיימת אינטראקציה עם פיגום ה-PCL עם רוב הקרדיומיוציטים האנושיים של iPSC שנצבעו לאקטינין סרקומרי במרווחים עם פיברובלסטים לבביים אנושיים המסומנים בווימנטין.

קרדיומיוציטים iPSC אנושיים מציגים מבנה סרקומר מאורגן היטב על ידי חלבון אקטינין סרקומרי במרווחים קבועים. התאים החלו לפעום באופן ספונטני ביום השני עם תדירות פעימות ממוצעת של 30 פעימות לדקה ביום השביעי, מה שהראה התכווצות יציבה לאורך כל הרשת. ירידה הדרגתית נצפתה לאורך זמן, והגיעה ל-17 פעימות לדקה ביום ה-14.

למרות זאת, הפעילות המטבולית נותרה יציבה בין היום השביעי ליום ה-14, מה שאישר את כדאיות התאים המתמשכת. לבסוף, ניתוח נקודת המעקב של הרקמות הפועמות הראה מהירות התכווצות של 38 מיקרומטר לשנייה ומשרעת התכווצות של 29 מיקרומטר.