כתם נקודות נטול תאים כפלטפורמת בדיקה חיסונית מעשית וניתנת להתאמה לזיהוי תגובת נוגדנים בסרום של בני אדם ובעלי חיים

פרוטוקול זה מדגים את טכניקת הדם המנוקד נטול התאים, פלטפורמת בדיקה חיסונית ניתנת להתאמה, נגישה ובמחיר סביר שפותחה בתגובה למגיפת COVID-19. שיטות הבדיקה החיסונית הקיימות בתקן הזהב כוללות וריאציות של טכניקת ELISA ומבחני זרימה רוחבית. היה עניין משמעותי בפיתוח בדיקה חיסונית חדשה באמצעות טכנולוגיות כגון חלבונים מדווחים מפוצלים, ממשקים אלקטרוכימיים וננו-חלקיקים קולואידים.

האתגר הוא שרוב הבדיקות החיסוניות בתקן הזהב אינן נגישות לקהילות לא ריכוזיות בשל ההסתמכות על רכיבים וציוד מולקולריים יקרים ומתוחכמים. ניתן להתאים במהירות את טכניקת הבדיקה החיסונית החדשה הזו של CFDB להתפרצויות מתפתחות. הוא משתמש בציוד מעבדה בסיסי ומסתמך לחלוטין על רכיבים מולקולריים שניתן לייצר בחברה ובסביבות דלות משאבים.

כדי להתחיל, השג את רצף החלבון ממסד הנתונים של UniProt באמצעות קוד הגישה P0DTC9. קוד על אופטימיזציה של הרצף לביטוי מבוסס ecoli באמצעות קוד IDT בכלי האופטימיזציה. הכנס את הרצף האופטימלי לתבנית SnapGene עבור עמוד השדרה של בניית הביטוי לפני הזמנת הרצף האופטימלי לסינתזה מסחרית כשבר DNA גדיל יחיד תלוי מחדש במים.

בצע בדיקת ביטוי ראשונית בקנה מידה של חמישה מיקרוליטר על ידי הוספת מוצר PCR של 10% לתגובה נטולת התאים של ecoli BL21 בשפופרת PCR. דגרו את התגובה מבלי לרעוד בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 15 שעות. העריכו את איכות הביטוי של חלבון הנוקלאוקפסיד או אנטיגן NP על ידי טעינת מיקרוליטר אחד של התגובה נטולת התאים על ג'ל עמוד SDS 12% והעברתו לקרום ניטרוצלולוז לכתם מערבי.

הרכיבו תגובה נטולת תאים בקנה מידה של מיליליטר אחד באמצעות מוצר תבנית ביטוי ליניארי מטוהר של 15 ננו-מולרי לבדיקת כתם נקודות נטול תאים דגרו את תערובת הביטוי בצינור חרוטי של 15 מיליליטר עם טלטול ב-80 סל"ד למשך 15 שעות ב-30 מעלות צלזיוס. לאחר הערכת איכות הביטוי באמצעות כתם מערבי וציטוט של 50 מיקרוליטר מתערובת הביטוי, אחסן את האליקוטים במינוס 20 מעלות צלזיוס. השתמש בתמונת רשת מאסטר כפי שמוצגת הכוללת תבנית של שישה על שישה סנטימטרים המכילה 12 על 12 עיגולים כל אחד בקוטר של שני מילימטרים שנועדו להתאים ליכולת האיתור של צלחת של 96 בארות.

לאחר הדפסת הרשת הראשית, סנדוויץ' את הרשת המודפסת בחוזקה בין שתי שכבות של סרט תקרה דביק של לוחית PCR, חתוך את הכריך לגודל לאורך גבולות הרשת החיצונית. בעזרת אגרוף ביופסיה של שני מילימטרים, חלול כל עיגול מסומן על הרשת. חותכים חתיכה של קרום ניטרוצלולוזה בגודל 6.5 על 6.5 סנטימטר, מקמו אותה מתחת לרשת הראשית על משטח נקי ואבטחו אותה באמצעות סרט דבק.

בעזרת עט סמן, סמן את מיקומי המעגל החיצוניים ביותר על קרום הניטרוצלולוזה שישמש כמדריך לחיתוך הממברנה לאחר איתור הדגימה. יש לדלל את דגימות הסרום מ-1 עד 10 ב-PBS. בעזרת מיקרו פיפטה, החלק נפחים משולשים של 0.4 מיקרוליטר מכל דגימה על קרום הניטרוצלולוזה במיקומי רשת שנקבעו מראש.

הניחו לדגימות המנוקדות להיקשר ולהתייבש בטמפרטורת הסביבה למשך 10 דקות. בעזרת פינצטה שולפים בזהירות את קרום הניטרוצלולוזה וחותכים אותו לאורך העיגולים החיצוניים המסומנים. העבירו את הממברנה לצלחת פטרי בגודל 10 סנטימטר המכילה 10 מיליליטר תמיסת חסימה.

יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות תוך ניעור עדין ב-100 סל"ד. הוציאו מהמקפיא את 50 המיקרוליטר של תערובת ביטוי האנטיגן נטולת התאים, ולאחר ההפשרה, הוסיפו אותה לחמישה מיליליטר של תמיסת חסימה בצלחת פטרי של 10 סנטימטרים. העבירו את הממברנה ישירות לתמיסה המכילה אנטיגן זו ודגרו בטמפרטורת החדר למשך שעה, תוך ניעור ב-100 סל"ד.

לאחר שעה יש לשטוף ולשטוף את הממברנה ב- TBST המכילה 0.05% טווין 20. לאחר מכן, הוסף 10 מיליליטר של מאגר חוסם המכיל 10 מיקרוגרם למיליליטר של SpyCatcher מטוהר, שני קודקודים, שני חלבונים, לממברנה, והנח את הממברנה בצלחת המכילה קודקוד SpyCatcher. דגירה למשך שעה עם ניעור ב-100 סל"ד לאחר שטיפת הממברנה עם מי מלח או TBS יש לשטוף פעמיים במשך חמש דקות ב-TBST ולאחר מכן שטיפה אחרונה ב-TBS.

הדביקו ואבטחו פיסת פרפילם על משטח עבודה נקי ליד מכשיר ההדמיה של הכתם. הסר עודפי נוזלים על ידי הקשה על הממברנה ובעזרת פינצטה, הנח אותו על גבי הפרפילם. הוסף מיד שלושה מיליליטר של כימילומינסנציה משופרת או תמיסת ECL על גבי הממברנה ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 90 שניות בדיוק.

לאחר ייבוש הממברנה בברז, העבירו אותה למכשיר הדמיה תואם כימילומינסנציה. השתמש בפונקציית ניתוח התמונה של המכשיר כדי להשיג עוצמות נקודתיות כולל עבור שלושה מיקומים ריקים על קרום הניטרוצלולוזה. שמור על נפח מדידה קבוע לכל נקודה.

ייצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני, תוך הבטחת תיוג נכון של כל מיקום נקודתי. חשב את הממוצע ואת סטיית התקן של עוצמות נקודתיות משולשות. הפחיתו את רקע קרום הניטרוצלולוזה מכל מדידות הדגימה.

לאחר מכן, השתמש במשוואה הנתונה כדי לקבל ערך חיתוך לפירוש תוצאות חיוביות או שליליות. לבסוף, שרטט את הנתונים החתוכים לגרף עמודות. בדיקת כתם נקודות נטול תאים בוצעה על שרה האנושית המסחרית המאופיינת מראש, ותמונה של הכתם, יחד עם טבלת עוצמת האות המתאימה, מוצגת באיור זה.

בדיקת כתם הנקודות ללא תאים זיהתה בהצלחה את כל דגימות הבקרה השליליות ואת הדגימות החיוביות ביותר. בדיקה עצמאית של בדיקת כתם הנקודות נטול התאים במעבדה הלאומית למיקרוביולוגיה זיהתה נכון את כל 12 דגימות החולים השליליות ו-12 החיוביות, ואישרה את חוסנה. בדיקת כתם הנקודות ללא תאים זיהתה גם תגובות נוגדנים באוגר נגוע ב-SARS-CoV-2 שרה, עם אותות חיוביים שנצפו ב-18 מתוך 24 דגימות לאחר הדבקה שנאספו חמישה ימים לאחר ההדבקה החוזרת, בעוד שכל הדגימות שלפני ההדבקה נותרו שליליות.