מיצוי DNA מיקובקטריאלי באמצעות מכות חרוזים במאגר מותאם אישית ואחריו זרימת עבודה של NGS

מחקר האבחון שלנו מתמקד בשיפור זיהוי עמידות לתרופות בשחפת בסביבות משאבים מוגבלות, תוך התמקדות במהירות ופרגמטיות. באבחון שחפת, יש בדיקות גנוטיפיות מקיפות יותר, ואפילו מספר בדיקות פנוטיפיות מהירות חדשות, ויש דחיפות עקביות לקרב את הבדיקות הללו לנקודת הטיפול. אבל ישנם מספר מחסומים פרגמטיים שעדיין קיימים.

אתגרי משאבים מריאגנטים לתשתיות ועד לוגיסטיקה ממשיכים להוות חסמים משמעותיים. עם כל דבר מעבר לתחכום הטכני של מבחן Cepheid Xpert, סטנדרטיזציה של פרוטוקול קשה במסגרות שונות. לכן, מיצוי DNA MTB כפי שמפורט בעבודה זו כאן, הוא דוגמה מצוינת לכך.

יש צורך קריטי להרחיב את אבחון השחפת המבוסס על ריצוף, אך למעבדות רבות עדיין חסרה דרך אמינה לחלץ DNA באיכות גבוהה. המטרה שלנו היא לחלוק שיטה פשוטה, פרקטית ומתאימה לסביבה של נקודת טיפול דלת משאבים. כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט בעלות נמוכה המיועד לשימוש במסגרות מוגבלות במשאבים.

הוא אומת עבור יישומי NGS, ותואם למערכות אוטומטיות לטיפול בנוזלים. כדי להתחיל, שלב תמיסת נתרן כלורי Tris hydrochloride buffer, Triton X 100 ו-EDTA כדי ליצור את מאגר הטריטון. מערבבים תוך ערבוב ומוסיפים מים טהורים במיוחד כדי להגיע לנפח סופי של 100 מיליליטר.

מסננים מעקרים את המאגר לפני השימוש. לאחר מכן, הכינו 100 מיליליטר של מאגר Tris-EDTA נמוך על ידי שילוב של מיליליטר אחד של Tris-HCl מולארי אחד ו-20 מיקרוליטר של 0.5 מולארי EDTA. מערבבים וממלאים במים טהורים במיוחד כדי להגיע לנפח סופי של 100 מיליליטר.

ואז מסננים לעקר את המאגר. כדי להכין את צינורות הליזיס, השתמש בלהב אזמל כדי לחתוך בזהירות את החלק התחתון של צינור מכסה הברגה של 1.5 מיליליטר ממש מתחת לנקודת ההיפוך. חותכים את הקצה מקצה פיפטה P1000 ויוצרים טריז בצורת V ליד הקצה.

תקעו את החלק התחתון החתוך של צינור מכסה הבורג לתוך קצה הפיפטה בצורת V ליצירת סקופ. מלאו מיכל סטרילי בחרוזי סיליקט זירקוניה 0.1 מילימטר. בעזרת הכף המוכנה, העבירו כ-200 מיליגרם חרוזים לצינורות מכסה הברגה של 1.5 מיליליטר.

להכנת תרבית תאי החיידקים, העבירו חמישה מיליליטר של תרבית מיקובקטריום טוברקולוזיס לצינור צנטריפוגה חרוטי של 15 מיליליטר. צנטריפוגה אותו במהירות מרבית למשך 10 דקות. כעת השתמש בפיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר כדי להסיר בזהירות את כל הסופרנטנט מלבד כ-500 מיקרוליטר מבלי להפריע לגלולה.

השתמש בפיפטה P1000 כדי להסיר את הסופרנטנט שנותר. השעו מחדש את הגלולה ב-350 מיקרוליטר של מאגר טריטון מותאם אישית, ולאחר מכן ערבבו היטב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. מחממים את הדגימה באמבט חום יבש למשך 30 דקות בחום של 95 מעלות צלזיוס.

להכנת הליחה העבירו בין 1 ל-5 מיליליטר של דגימת ליחה לצינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מיליליטר. כדי לבצע הנזלת דיתיותרייטול, הוסף ארבעה נפחים של דיתיותרייטול של 10 מילי-מולרית לדגימת הליח, ולאחר מכן מערבולת היטב למשך 30 שניות. צנטריפוגה את הדגימה במהירות מקסימלית למשך 10 דקות.

לאחר מכן השתמש בפיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר כדי להשליך את כל הסופרנטנט מלבד 500 מיקרוליטר. הסר את שאר הסופרנטנט עם פיפטה P1000 מבלי להפריע לגלולה. השעו מחדש את הגלולה ב-350 מיקרוליטר של מאגר טריטון מותאם אישית.

כדי לבצע את הנזלת הנתרן הידרוקסיד NALC, הוסף ארבעה נפחים של תמיסת נתרן הידרוקסיד NALC לדגימת הליחה. מערבלים את התערובת למשך 30 שניות. לאחר מכן דגרו את הצינור למשך שבע דקות בטמפרטורת החדר.

כעת הוסף PBS עד לסימן 50 מיליליטר. מערבל את תכולת הצינור כדי לערבב היטב, ואז צנטריפוגה את הצינור במהירות מקסימלית למשך 10 דקות. לאחר צנטריפוגה, עם פיפטה סרולוגית של 50 מיליליטר, השליכו את הסופרנטנט כפי שהודגם קודם לכן.

לאחר מכן השעו מחדש את הגלולה ב-350 מיקרוליטר של מאגר טריטון מותאם אישית. ראשית, העבירו 350 מיקרוליטר של דגימה מושבתת לתוך צינור מכסה בורג של 1.5 מיליליטר המכיל 250 מיקרוליטר של חרוזי זירקוניה סיליקט 0.1 מילימטר. ביד ניצח את הליזאט במהירות של 6.5 מטר לשנייה במשך 45 שניות עם שתי דקות מנוחה בין המחזורים.

צנטריפוגה את הדגימה במהירות מקסימלית למשך שתי דקות, ואז העבירו 150 מיקרוליטר של הסופרנטנט לצינור מסומן חדש. לאחר מכן ניקוי מערבולת חרוזים מגנטיים שהושוו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, כדי להשעות אותם מחדש. העבירו 180 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים לדגימת ה-DNA.

צנרת למעלה ולמטה 10 פעמים לערבוב. לאחר דגירה של שתי דקות בטמפרטורת החדר, הנח את הצינור על מתלה מגנטי והמתן שתי דקות עד שהתמיסה תתבהר. לאחר מכן השתמש בפיפטה של 200 מיקרוליטר כדי להשליך את הסופרנטנט.

כשהצינור עדיין על המדף המגנטי, הוסיפו 500 מיקרוליטר של אתנול 70% טרי שהוכן לאורך הקיר הנגדי, והמתינו 30 שניות. בתום הכביסה האחרונה, הסר שאריות אתנול בעזרת פיפטה של 10 מיקרוליטר וייבש באוויר למשך שתי דקות. ברגע שהחרוזים הופכים אטומים, הסר את הצינור מהמתלה המגנטי.

השעו מחדש 20 מיקרוליטר של מאגר EDTA Tris נמוך. מערבבים על ידי פיפטינג או מערבולת כדי להבטיח שכל החרוזים נמצאים בתמיסה לפני דגירה של חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הנח את הצינור על מתלה מגנטי למשך שתי דקות עד שהוא צלול.

לאחר מכן העבירו פחות מ-20 מיקרוליטר של ה-DNA המשוחרר לצינור חדש עם תווית כדי למנוע העברת חרוזים. כדי לכמת DNA מיקובקטריאלי באמצעות PCR כמותי המכוון ל-99 נוקלאוטידים של ה-atpE המיקובקטריאלי, הרכיבו תערובת מאסטר QPCR על קרח. התאם את תמהיל המאסטר על סמך כמות הדגימות והתקנים, כולל עודף של 10% כדי לקחת בחשבון את אובדן הפיפטינג.

הפעל את המחזורי התרמי עם 95 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות, ולאחר מכן 35 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, ו-60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות עם קצב רמפה של 2.11 מעלות צלזיוס לשנייה. הפעל את כל הדגימות, התקנים והבקרות בשלוש עותקים. כאן, תרביות מיקובקטריום טוברקולוזיס הניבו את ריכוזי ה-DNA הגבוהים ביותר מבין כל המצבים שנבדקו.

דגימות ליחה דוקרניות הראו תפוקות DNA נמוכות יותר בהדרגה, ושונות מוגברת עם ירידה בקלט החיידקים, במיוחד בקבוצת 10,000 החיידקים.